Tìm hiểu các căn nguyên vi rút gây viêm đường hô hấp cấp của một số bệnh nhân điều trị ở bệnh viên Đa khoa Việt tiệp Hải Phòng 2010 - 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- NGUYỄN VŨ SƠN TÌM HIỂU CÁC CĂN NGUYÊN VI RÚT GÂY VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP CỦA MỘT SỐ BỆNH NHÂN ĐIỀU TRỊ Ở BỆNH VIỆN ĐA KHOA V

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN VŨ SƠN

TÌM HIỂU CÁC CĂN NGUYÊN VI RÚT GÂY VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP CỦA MỘT SỐ BỆNH NHÂN ĐIỀU TRỊ Ở BỆNH VIỆN ĐA KHOA VIỆT TIỆP

HẢI PHÒNG 2010 - 2012

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN VŨ SƠN

TÌM HIỂU CÁC CĂN NGUYÊN VI RÚT GÂY VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP CỦA MỘT SỐ BỆNH NHÂN ĐIỀU TRỊ Ở BỆNH VIỆN ĐA KHOA VIỆT TIỆP

HẢI PHÒNG 2010 - 2012

Chuyên ngành : Vi sinh vật học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS Lê Thị Quỳnh Mai

Hà Nội - Năm 2012

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CÁC VI RÚT ĐƯỜNG HÔ HẤP 3

1.1.1 Vi rút họ Orthomyxoviridae 3

1.1.2 Vi rút họ Paramyxoviridae 7

1.1.3 Vi rút họ Picornaviridae 9

1.1.4 Vi rút họ Coronaviridae 12

1.2 SỰ LƯU HÀNH CỦA VI RÚT GÂY BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP 15

1.2.1 Trên thế giới 15

1.2.2 Tại Việt Nam 17

1.3 ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG 19

1.4 DỰ PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ 19

1.4.1 Dự phòng 20

1.4.2 Điều trị 21

1.5 CHẨN ĐOÁN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 22

1.5.1 Phương pháp phát hiện kháng nguyên 22

1.5.2 Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền 23

1.5.3 Phương pháp phát hiện kháng thể 24

1.6 CƠ SỞ LÝ LUẬN ĐỂ THIẾT KẾ VÀ TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU 26

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2 1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 28

2.1.1 Định nghĩa ca bệnh 28

2.1.2 Cỡ mẫu 28

2.2 VẬT LIỆU 28

2.2.1 Mẫu bệnh phẩm 28

2.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ 30

2.2.3 Sinh phẩm 32

2.3 PHƯƠNG PHÁP 37

2.3.1 Tách chiết vật liệu di truyền của vi rút ARN 37

2.3.2 Phản ứng di truyền phân tử (PCR) 37

2.3.3 Phương pháp Luminex/xTAG RVP 43

2.3.4 Phân lập 45

2.3.5 Phản ứng xác định trình tự chuỗi nucleotide (sequence) 47

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 50

3.1 CÁC TÁC NHÂN VI RÚT GÂY VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP TẠI HẢI PHÒNG 50

3.1.1 Sự phân bố bệnh phẩm theo tháng 50

3.1.2 Phân bố ca bệnh theo giới 51

3.1.3 Phân bố theo độ tuổi 52

3.2 XÁC ĐỊNH CĂN NGUYÊN 53

3.2.1 Tỷ lệ tác nhân vi rút gây VĐHHC được xác định trong nghiên cứu 55

3.2.2 Vai trò của các họ vi rút gây VĐHHC 56

3.2.3 Kết quả xác định căn nguyên vi rút gây VĐHHC 57

3.2.4 Phân tích sự lưu hành của các tác nhân vi rút theo tháng 61

3.2.5 Sự liên quan giữa tác nhân lây nhiễm và các lứa tuổi 63

3.3 PHÂN LẬP 65

3.4 XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC CỦA VI RÚT CÚM 66

3.4.1 Đặc tính kháng nguyên 66

3.4.2 Xác định đặc điểm di truyền vi rút cúm 67

3.5 HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN VĐHHC 71

Kết luận: 73

Kiến nghị 74

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Axit Deoxy Ribonuleic

A/H1N1pdm/09 Vi rút cúm A/H1N1 đại dịch 2009

CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm

Phòng ngừa và kiểm soát bệnh, Mỹ)

dNTP Deoxiribonucleotide 5‟-triphosphates

ELISA Enzyme linked-immusorbent assay (Thử nghiệm hấp phụ

miễn dịch gắn enzyme)

HA Hemagglutination test (Phản ứng ngưng kết hồng cầu)

HAI Hemagglutination Inhibition Test (Phản ứng ngăn ngưng

RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (Phản

ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược)

TCYTTG World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

VĐHHC Viêm đường hô hấp cấp

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hội chứng viêm đường hô hấp cấp (VĐHHC) do căn nguyên là vi rút hoặc vi khuẩn chủ yếu hay gặp tại các nước có kiểu hình khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều Một số tác nhân có thể gây nên các vụ dịch lẻ tẻ hoặc thành đại dịch (dịch cúm, vi rút hợp bào hô hấp – Respiratory Sycytial Virus…) [6, 30, 51] Tác nhân

vi rút gây bệnh thường gặp là: vi rút thuộc họ Picornaviridae, Paramyxoviridae (RSV, vi rút á cúm…), Orthomyxoviridae (vi rút cúm A, B…) [1, 13, 51] Trong

đó, vi rút cúm được xem là một trong những căn nguyên quan trọng nhất gây bệnh VĐHHC [50, 59, 79] Hiện nay có khoảng hơn 200 loại vi rút có cấu trúc kháng nguyên khác nhau gây bệnh VĐHHC

Trên thế giới, hội chứng VĐHHC xuất hiện quanh năm ở các vùng ôn đới, nhất là vào thời gian thời tiết lạnh và ẩm Bệnh viêm đường hô hấp cấp do căn nguyên vi rút thường mang tính chất “mùa” - đó là thời gian mà số mắc trong cộng đồng tăng cao, ví dụ: dịch cúm theo mùa, RSV thường tập trung vào mùa đông tại các nước ôn đới thuộc khu vực Bắc bán cầu, á cúm là nguyên nhân chính gây VĐHHC vào mùa thu và đầu đông, trong khi cao điểm của nhiễm vi rút entero lại vào cuối hè… VĐHHC do vi rút có ảnh hưởng lớn tới sức khỏe đặc biệt đối với trẻ em và người già tại các nước đang phát triển Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (WHO) có khoảng 4.5 triệu trẻ em dưới 5 tuổi tử vong hàng năm do VĐHHC và căn nguyên vi rút chiếm 40% trong tổng số đó [86]

Tại Việt Nam, bệnh VĐHHC xảy ra quanh năm, có tỷ lệ mắc đứng đầu trong 10 bệnh truyền nhiễm cấp tính [12] Tuy nhiên, các nghiên cứu về VĐHHC

do căn nguyên vi rút cũng như các tác nhân nào chủ yếu và thường gặp còn hạn chế Đặc biệt các nghiên cứu sâu về vi rút học và các phương pháp chẩn đoán nhanh phòng thí nghiệm bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, đặc điểm di truyền, đặc tính kháng nguyên của các tác nhân vi rút gây bệnh VĐHHC hiện chưa được

áp dụng rộng rãi, đó là lý do chúng tôi tiến hành nghiên cứu:

“Tìm hiểu các căn nguyên vi rút gây viêm đường hô hấp cấp của một số bệnh

nhân điều trị ở bệnh viện đa khoa Việt Tiệp - Hải Phòng 2010-2012”

Với mục tiêu:

1 Xác định các tác nhân vi rút gây viêm đường hô hấp cấp của bệnh

nhân điều trị tại bệnh viện đa khoa Việt Tiệp Hải Phòng bằng phương pháp

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÁC VI RÚT ĐƯỜNG HÔ HẤP

Các vi rút gây bệnh VĐHHC thường gặp được ghi nhận từ 5 họ là:

Adenoviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae và

Orthomyxoviridae Tuy nhiên, trong nghiên cứu này của chúng tôi các vi rút thuộc 4

họ thông dụng được phân tích đó là:

4 Coronaviridae - Vi rút gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp

tính nguy hiểm (Severe acute respiratory syndrome coronavirus - SARS-CoV)

1.1.1 Vi rút họ Orthomyxoviridae

1.1.1.1 Hình thái:

Orthomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài, genome là ARN

đơn, âm, phân đoạn Trước đây, các vi rút Orthomyxo và Paramyxo đều được xếp chung vào một họ là Myxoviridae do chúng có cấu trúc và khả năng lây bệnh giống nhau, nhưng về sau được tách thành 2 họ riêng là Orthomyxoviridae và

Paramyxoviridae do phát hiện thấy chúng còn nhiều đặc điểm cơ bản không

giống nhau [13, 51]

Vi rút Orthomyxoviridae gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi

rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa [51] Trong đó vi rút cúm A lưu hành phổ biến trên gia cầm, người và các động vật khác như lợn, ngựa… là căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu Vi rút cúm B thường gây bệnh nhẹ nhưng cũng có thể bộc phát thành dịch vào mùa đông, đặc biệt là ở trẻ em Vi rút cúm C chưa thấy biểu hiện gây bệnh nguy hiểm cho người

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc virion của vi rút cúm [18]

Virion có vỏ đa hình thái, thường có hình cầu với cấu trúc xoắn, đường kính 80-120nm nhưng đôi khi cũng thấy dạng sợi dài đến vài µm Genome của vi rút cúm A và B được chia thành 8 phân đoạn, đơn âm với tổng khối lượng 5x106

Dalton

Trong virion có chứa enzyme ARN-polymerase phụ thuộc ARN, enzyme này cần cho quá trình phiên mã vì genome là ARN chuỗi âm Protein capsid kết hợp với ARN tạo nucleocapsid đối xứng xoắn Nucleocapsid được bao bọc bởi màng protein nền M1 (M: Matrix) phía ngoài màng lại được bao bọc bởi vỏ ngoài là lớp lipid kép có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào chủ Protein M2

đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, tạo thành các kênh ion, làm cho pH trong endosome thay đổi [13]

Bề mặt vi rút có đính các gai bản chất là glycoprotein, đó là kháng nguyên hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) Protein HA gây ngưng kết hồng cầu

và có vai trò gắn vi rút vào tế bào vật chủ, protein NA có vai trò phá vỡ liên kết giữa vi rút và tế bào để giải phóng vi rút

1.1.1.2 Cấu trúc phân tử

Vật liệu di truyền của vi rút cúm A, B là 8 phân đoạn, có chiều dài khoảng

10 đến 15 kb Mỗi phân đoạn mã hoá cho 1 protein cấu trúc hoặc không cấu trúc:

7 protein cấu trúc: PB1, PB2, PA, HA, NA, NP và M1 và 3 protein không cấu trúc: NS1, NS2 và M2 đối với vi rút cúm A và NP đối với vi rút cúm B

Phân đoạn gen HA gồm 1.742-1.778 nucleotid mã hóa cho 562-566 axit amin, protein HA có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, gắn với thụ thể chứa axit sialic trên bề mặt tế bào và giúp vi rút xâm nhập vào tế bào Protein HA tồn tại dưới 2 dạng: dạng tiền thân không phân tách là HAo hoặc dạng phân tách thành HA1 và HA2 liên kết với nhau bởi cầu nối disulfua (S-S) Sự phân tách này là điều kiện quyết định để vi rút có khả năng gây nhiễm và lây truyền của vi rút [73] Ngoài ra, vị trí axit amin trên gen HA có vai trò gắn với thụ thể tế bào chủ cũng đóng vai trò quan trọng trong việc lây truyền vi rút cúm Vi rút cúm người gắn vào thụ cảm thể trên tế bào chủ tại cổng 2.6 (SAα- 2,6 Gal) [43]

Phân đoạn gen NA có 1413 nucleotid mã hóa cho 453 axit amin Protein

NA có bản chất là một enzyme đóng vai trò quan trọng trong việc giải phóng vi rút từ tế bào nhiễm và lan trải vi rút trong đường hô hấp Các đột biến tại vị trí axit amin: 275, 295 ở NA của típ N1 hay 292 ở NA của típ N2 liên quan sự kháng hoặc giảm độ nhạy của thuốc kháng vi rút (Osertamivir và Zanamivir) Sự đột biến này được cho là kết quả của quá trình cạnh tranh sinh học [19, 34, 35,

42, 44]

1.1.1.3 Cơ chế nhân lên

Hình 1.2 Chu trình nhân lên của vi rút cúm[48]

- Đầu tiên, vi rút sẽ gắn vào các thụ thể đặc hiệu trên màng sinh chất nhờ gai glycoprotein HA Vi rút xâm nhập vào bên trong tế bào theo cơ chế nhập bào Màng tế bào bao lấy vi rút, tạo bọng (endosome) nằm bên trong tế bào chất Quá trình dung hợp với màng endosome làm giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất

và được vận chuyển vào trong nhân tế bào

- Trong nhân sợi ARN (-) ban đầu được làm khuôn để tổng hợp nên sợi ARN (+) theo cơ chế bổ sung cARN (+) nhờ enzyme ARN - polymerase phụ thuộc ARN của vi rút Chính các cARN (+) này lại được dùng làm khuôn để tổng hợp các sợi ARN (-) mới là nguyên vật liệu di truyền của vi rút Các sợi ARN (-) được tạo thành này là một sợi hoàn chỉnh về độ dài và một phần được phiên mã tạo ra các mARN (+) ngắn hơn Sau đó, quá trình dịch mã thành các protein chức năng xảy ra ở tế bào chất

- Các protein NS1, M1 và NP được vận chuyển vào nhân kết hợp với sợi ARN (-) mới tổng hợp để hình thành nên nucleocapsid, sau đó được vận chuyển

ra tế bào chất Tại đây, nucleocapsid được bao bọc bởi các protein HA, NA, M2 thông qua sự tương tác với bộ máy Golgi Hạt virion mới được tạo thành bằng cách nảy chồi từ màng sinh chất, axit sialic ở màng sinh chất sẽ bị phân cắt bởi

Hấp phụ

Sau dịch mã Dịch mã Nhập bào

Dung hợp, cởi vỏ

Nảy chồi Đóng gói

Nhân

enzyme NA và giải phóng vi rút ra khỏi tế bào chủ để bắt đầu một chu trình lây nhiễm mới Như vậy, quá trình sao chép của vi rút cúm xảy ra trong nhân tế bào

1.1.2.1 Hình thái

Virion thuộc loại đa hình thái, thường có hình cầu với đường kính 200nm, chứa 5-7 polypeptid và một phân tử ARN đơn (-), dài, khối lượng 5-7x106 Bao quanh nucleocapsid đối xứng xoắn là màng M có cấu tạo từ protein

50-M không được glycosyl hoá Phía ngoài màng 50-M là vỏ ngoài với các gai glycoprotein bề mặt dài khoảng 8nm

Virion bị bất hoạt bởi các dung môi hoà tan lipid, chất tẩy rửa, formaldehyde, các chất oxy hoá…

Đặc điểm đặc trưng là hạt vi rút được bao bọc bởi 2 lớp vỏ lipid với các gai glycoprotein mang tính kháng nguyên [13]

Phần vỏ bao của vi rút Paramyxo bao gồm hai cấu trúc glycoprotein: H-N

và F Chúng tạo nên các gai trên bề mặt của hạt vi rút Các glycoprotein lớn H, N

có vai trò của hemagglutinin và neuraminidase là men ngưng kết hồng cầu động vật lông vũ và giúp sự hấp phụ (adsorbtion) của vi rút trên tế bào cảm thụ Cấu trúc protein khác, ký hiệu F, có vai trò kết dính các thành phần của hạt vi rút trong tế bào và giúp vi rút xâm nhập qua màng tế bào cảm thụ Hoạt động xâm nhập của yếu tố F là nhờ sự hoạt hoá bởi phần giải protein (proteolytic) làm cho men sớm của tế bào chủ tạo F thành Fo rồi cắt thành F1 và F2 F1, F2 hoạt động

để có sự hoà nhập của vi rút vào màng tế bào do đó ARN vi rút xâm nhập vào được tế bào [13]

1.1.2.2 Cấu trúc phân tử

Bô ̣ gen của các Paramyxoviridae là phân tử ssRNA với 15k nu chứa bô ̣ gen

mã hóa 6 loại protein đặc trưng của vi rút [53] 6 gen đó có chức năng mã hóa protein N gắn ARN của nucleocapsid, phosphoprotein P của nucleocapsid, các enzyme polymerase chính của tiểu phần L, protein màng M không gắn đường, glycoprotein gắn màng G, H hay HN và glycoprotein hòa màng F Ngoài ra, các

thành viên trong họ Paramyxoviridae còn có thêm từ một đến năm loại gen điển

hình mã hoá các protein phi cấu trúc để tăng cường quá trình phát triển của vi rút

Do vỏ lipoprotein của vi rút dễ vỡ nên thông thường hình ảnh của hạt vi rút trên kính hiển vi điện tử méo mó, vỡ và thành phần nucleoprotein thường chảy ra ngoài hạt vi rút Các polypeptid cấu trúc của vỏ bao gồm HN (hemagglutinin - neuraminidase) và F (fusion) protein từ các gai bề mặt và M (matrix) protein 3 protein khác cùng với RNA cấu thành nhân nucleoprotein của hạt vi rút và quá trình phiên mã có thể thực hiện với các vi rút có vật liệu di truyền là RNA đơn

âm

Protein F cấu tạo bởi sự phân giải protein của tiền polypeptid, có vai trò rất quan trọng trong quá trình hòa màng của tế bào nhiễm và sau đó hình thành hợp bào (syncytial)

Lớp vỏ bao ngoài (envelope) là màng kép lipid, lớp màng này thu nhận được từ màng tế bào chủ Lớp màng bao ngoài bao gồm ba loại glycoprotein bề mặt: Protein gắn màng G, protein hòa màng F và protein kỵ nước SH Ngoài ra còn có protein M (matrix protein) là protein nằm ở trong của lớp vỏ envelope Các glycoprotein được hình thành từ virion - spikes, nó có kích thước rất ngắn khoảng 11 - 20nm, khoảng cách giữa các spikes là từ 6 - 10nm Nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn, đường kính xoắn ốc khoảng 18nm

Phân lớp pneumovirinae (hMPV và RSV) không có enzyme neuraminidase Protein G không có hemagglutinin mà nó đảm nhiệm chức năng năng thay cho hemagglutinin để gắn vào thụ thể của tế bào

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc virion của vi rút họ Paramyxoviridae [31]

1.1.2.2 Cơ chế nhân lên

Trong quá trình gây nhiễm trùng, vi rút Paramyxo xâm nhập vào tế bào tạo

tế bào khổng lồ Khả năng xâm nhập tế bào này được sử dụng như một đặc điểm quan trọng để chẩn đoán bệnh

Có thể xâm nhiễm vào nhiều loại tế bào nuôi cấy mô Xâm nhập nhờ dung hợp giữa vỏ ngoài vi rút với màng sinh chất của tế bào chủ Quá trình phiên mã

và nhân lên đều diễn ra trong tế bào chất Virion trưởng thành chui ra ngoài theo lối nảy chồi Các tế bào nhiễm thường bị tan ra, nhưng cũng xảy ra sự dụng hợp

tế bào với nhau để tạo ra thể hợp bào, thể vùi

1.1.3 Vi rút họ Picornaviridae

Picorna bắt nguồn từ chữ pico là nhỏ, rna là axit ribonucleic Họ

Picornaviridae có chứa rất nhiều vi rút gây bệnh quan trọng cho người và động

vật, bao gồm vi rút polio, viêm gan A, vi rút bệnh lở mồm long móng (Foot and mouth disease virus-FMDV), và vi rút rhino [13, 51] Theo ủy ban phân loại vi

rút quốc tế, họ Picornaviridae gồm:

- Vi rút aphto bệnh lở mồm long móng

- Vi rút avihepato gây bệnh viêm gan A ở vịt

- Vi rút cardio gây bệnh viêm não, viêm cơ tim ở loài gặm nhấm

- Vi rút Entero gồm có vi rút polio, coxsackie, Echo

- Vi rút Erbo gây viêm mũi ở ngựa

- Vi rút hepato gây bệnh viêm gan A

- Vi rút Kobu gồm Aichivirus và bovine kobuvirus

- Vi rút Parecho gồm human parecho và Ljungan

- Vi rút sapelo gồm Porcine sapelo, Simian sapelo, Avian sapelo

- Vi rút Senecavirus

- Vi rút Tescho

- Vi rút Tremo

1.1.3.1 Hình thái và cấu trúc phân tử

Picorna là vi rút nhỏ hình cầu, đường kính trung bình 22-30nm Các thành viên

của Picornaviridae là vi rút không vỏ với một bộ gen sợi đơn (ssRNA), dương

Virion: Capsid hình khối đa diện 20 mặt tam giác đều, gồm 60 dưới đơn vị, mỗi đơn

vị chứa một phân tử gồm 4 polypeptid chính ký hiệu VP1, VP2, VP3 và VP4 Ba polypeptid đầu nằm trên bề mặt virion còn polypeptid sau nằm ở trong lõi gắn với ARN Genome là một phân tử ARN đơn, (+), dạng thẳng, dài 2,5x106, đầu 3‟ có gắn đuôi poly A, còn đầu 5‟ liên kết cộng hoá trị với một protein do vi rút mã hoá, gọi là VPg

Hình 1.4 Cấu trúc virion của Picornaviridae [40]

Ở vi rút cardio và aptho, gần đầu 5‟ của ARN còn có vùng polyC Đó là cấu trúc thứ cấp mà chiều dài có thể khác nhau tuỳ chủng Ở vi rút Rhino và Entero không có vùng này

1.1.3.2 Quá trình nhân lên

Vi rút nhân lên trong tế bào chất Đầu tiên vi rút gắn vào thụ thể nằm trên màng sinh chất của tế bào chủ, sau đó vào tế bào theo cơ chế nhập bào và tiến hành cởi vỏ trong endosome hoặc lysosome Sau khi được giải phóng khỏi capsid, ARN lập tức bắt đầu dịch mã ở lại trí gần đầu 5‟ để tạo thành một polyprotein Polyprotein này lúc đầu phân cắt thành 3 protein tiền chất là VP1, VP2 và VP3 Mỗi protein lại tiến hành phân cắt tiếp:

- VP1 cắt ra thành VP1A, VP1B, VP1C và VP1D Đó là protein capsid

- VP2 cắt thành VP2A, VP2B Đó là kháng nguyên của vật chủ và VP2C tham gia vào tổng hợp ARN

- VP3 tiến hành tự cắt thành VP3A, VP3B (VPg), VP3C (protease dùng phân cắt hầu hết các protein) và VP3D (ARN polymerase làm nhiệm vụ kéo dài chuỗi ARN mới tổng hợp trên khuôn ARN) Sợi (-) được tổng hợp trên khuôn sợi (+) Đầu sợi (+) được uốn lại thành hình kẹp tóc để làm mỗi cho tổng hợp sợi (-) Kết quả là tạo ra một phân tử “đúp”, có chiều dài gấp đôi genome

VP9 ARN vi rút Poly A

5‟ 3‟

Dịch mã

Polyprotein Phân cắt

VP1 VP2 VP3

VP0 VP1 VP3 Protease, VP9, ARNpolymerase

VP2 VP4

Hình 1.5 Sơ đồ sinh tổng hợp protein của vi rút polio [12]

Để lắp ráp, trước hết cần phân cắt VP1 tạo thành một protome (đơn phân gốc) 5S chưa hoàn thiện chứa VP0, VP1 và VP3 Các protome này sẽ liên kết với một genome ARN để tạo thành tiền virion Trong quá trình hoàn thiện, phần lớn hoặc tất cả các phân tử VP0 đều bị phân cắt sẽ tạo thành VP2 và VP4 Sau lắp ráp, virion trưởng thành ra khỏi tế bào nhờ tan bào

1.1.4 Vi rút họ Coronaviridae

Coronaviridae là một họ virus ARN sợi dương, có màng bao bọc

Coronavirus được truyền qua đường miệng, phân,hoặc bằng các giọt khí dung tiết ra từ đường hô hấp Coronavirus gây bệnh cho một loạt các động vật có vú và các loài chim trên toàn thế giới Mặc dù hầu hết các bệnh đều nhẹ, có liên quan đến các bệnh thần kinh, gan, tiêu hóa và hô hấp trên động vật, tuy nhiên chúng có

thể gây ra bệnh nghiêm trọng hơn ở người, chẳng hạn như hội chứng viêm đường

hô hấp cấp tính nguy hiểm (SARS) Hệ gen của vi rút có chiều dài 26-32 kb [13]

1.1.4.1 Hình thái và cấu trúc phân tử

Vi rút có cấu trúc đa hình thái, đường kính 75 – 160nm, có nucleocapsit xoắn được bao bởi vỏ ngoài lipid kép Trên bề vỏ ngoài nhô ra các gai

glycoprotein có dạng đặc trưng hình dùi cui gọi là peplome dài 12-24nm

Genom của vi rút corona dài khoảng 26-32kb Đầu 3‟ gắn đuôi poly A Các protein liên quan đến virion bao gồm:

Protein S cấu tạo nên các gai peplome bề mặt vỏ ngoài Đây là kháng

nguyên khích thích tạo kháng thể trung hòa

Protein M tạo màng trung gian nằm giữa capsit và vỏ ngoài Từ màng này mọc ra các peplome

Protein N gắn với các genom tao nucleocapsit Protein N ít thay đổi, trong khi protein S thường thay đổi, dẫn đến sự thay đổi của kháng nguyên vi rút

Họ coronaviridae gồm 2 chi là Coronavirus và Torovirus Có rất ít bằng

chứng về khả năng gây bệnh cho người của chi Torovirus, do vậy chi này ít được quan tâm

Các thành viên của Coronavirus bao gồm :

- Vi rút corona gây bệnh cho người - HCV (human corona virus) và năm

2003 đã phát hiện thêm vi rút corona gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp

- SARS

- Các vi rút corona khác gây bệnh cho gà (viêm phế quản), chuột (viêm gan,

dạ dày, viêm não), lợn (viêm ruột - dạ dày, viêm não), chó, gà tây, gia cầm, ngựa (sưng tuyến nước bọt) và mèo (viêm phúc mạc)

1.1.4.2 Quá trình nhân lên

Vi rút corona bám vào thụ thể của tế bào đích nhờ protein S Sau khi xâm nhập vào tế bào, chúng dịch mã tạo thành ARN – polymeraza phụ thuộc ARN

Enzyme này tiến hành phiên mã để tạo sợ ARN âm rồi sợi này lại được dùng làm khuôn để tạo genom ARN dương và mARN mARN tiến hành dịch mã để tạo protein cấu trúc (capsit) Quá trình nhân lên xảy ra trong tế bào chất Sau khi lắp ráp vi rút nảy chồi từ bộ máy Golgi chứ không phải từ màng tế bào chất Các protein M đã được gắn sẵn vào màng của bộ máy Golgi Khi vi rút chui ra được bọc bởi protein M và nằm trong bào nang Bào nang vận chuyển đến tế bào chất rồi tiến hành dung hợp sau đó được đẩy ra ngoài [13]

Các tế bào nhiễm vi rút có thể bị phân giải nhưng chúng có thể dung hợp với nhau dưới dạng hợp bào Trong thể hợp bào, vi rút có khả năng tồn tại lâu Nhiệt

độ thích hợp cho quá trình nhân lên của vi rút là 33oC, tương đương với nhiệt độ môi trường sống ở đường hô hấp trên

Hình 1.6 Quá trình nhân lên ở vi rút corona

1.2 SỰ LƯU HÀNH CỦA VI RÚT GÂY BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP

1.2.1 Trên thế giới

Các tác nhân gây bệnh VĐHHC trên thế giới vừa có tính lưu hành địa phương vừa có thể gây thành dịch, nhất là dịch vi rút cúm A đã lan rộng đến nhiều nước trên thế giới và trở thành đại dịch Hội chứng này có thể xuất hiện quanh năm

ở vùng ôn đới nhưng tần số mắc cao vào mùa thu, mùa đông và mùa xuân, nhất là vào thời gian mà thời tiết lạnh và ẩm Bệnh VĐHHC phát triển mạnh ở nơi mật độ

dân số cao Ở vùng nhiệt đới, bệnh VĐHHC xảy ra nhiều hơn vào lúc thời tiết ẩm ướt và lạnh Trong cộng đồng dân cư rộng lớn, một số bệnh do vi rút đường hô hấp thường xảy ra không có tính theo mùa và có thể gây ra các vụ dịch lớn như vi rút adeno, vi rút hợp bào Tỷ lệ mắc hàng năm cao, đặc biệt ở trẻ em và lứa tuổi thiếu niên [1, 11]

Trong thế kỷ XX đã ghi nhận nhiều đại dịch cúm với số mắc và số tử vong cao Đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918-1919 do vi rút cúm A phân típ H1N1 gây nên ước tính có khoảng 20 triệu người tử vong [59, 68, 75] Dịch cúm Châu Á năm 1957-1958 có nguồn gốc Singapore do vi rút cúm A phân típ H2N2 gây nên với khoảng 69.800 trường hợp tử vong, trong đó lứa tuổi từ 5-19 tuổi chiếm hơn 50% [59,62,74] Đặc biệt, trong những năm gần đây, năm 1997 xuất hiện cúm A phân típ H5N1 tại Hồng Kông lây từ gia cầm sang người và gây tử vong 6/18 trường hợp mắc Hồng Kông đã phải thiêu hủy hơn 2 triệu con gà, gây một tổn thất kinh tế lớn Cuối tháng 12 năm 2003 và những tháng đầu năm 2004, dịch cúm gia cầm đã gây thiệt hại lớn về kinh tế cho các nước Châu Á, trong đó Việt Nam và Thái Lan là 2 nước có cúm gia cầm lây truyền sang người gây tử vong 26 trường hợp [38]

Đại dịch cúm năm 2009 do tác nhân là vi rút cúm A/H1N1 là vi rút cúm hoàn toàn mới được tích hợp gen từ vi rtus cúm lợn (H1N1; H3N2), vi rút cúm gia cầm (H5N1), vi rút cúm người (H3N2) lần đầu tiên được xác định vào tháng

3 năm 2009 tại Mexico Trong thời gian ngắn, vi rút cúm A/H1N1pdm/2009 đã lây truyền trên phạm vi toàn cầu Ngày 11 tháng 6 năm 2009, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã chính thức công bố đại dịch cúm toàn cầu, và tại thời điểm đó vi rút đã ghi nhận tại 74 quốc gia, 28.774 người và 144 trường hợp tử vong[64]

Vi rút á cúm phân típ 1- 3 gây bệnh đường hô hấp trên, gặp ở mọi lứa tuổi, tuy nhiên trẻ em có xu hướng cảm nhiễm nhiều hơn Vi rút này xuất hiện nhiều nơi khác trên toàn thế giới , lây truyền qua đường hô h ấp và lan truyền ở tập thê

Vi rút á cúm là căn nguyên của 1/3 số nhiễm khuẩn đường hô hấp và 1/2 số trường hợp nhiễm bê ̣nh được xác định ở trẻ em trước tuổi đi ho ̣c (<6 tuổi) [53]

Vi rút á cúm típ 1 và típ 2 thườ ng liên quan đến viêm hầu ho ̣ng -khí-phế quản

(bệnh ba ̣ch hầu thanh quản), bé trai có xu hướng cảm nhiễm nhiều hơn bé gái Vi rút á cúm típ 3 thườ ng gây nhiễm bê ̣nh đường hô hấp dưới như là viêm tiểu phế quản và viêm phổi Vi rút á cúm típ 4 thường lưu hành ở Châu Phi và gây bệnh nhẹ đường hô hấp trên [13]

Vi rút hợp bào đường hô hấp (Respiratory Syncytial Virus-RSV) là một trong những căn nguyên gây bệnh viêm đường hô hấp chủ yếu ở trẻ nhỏ Dịch thường xảy ra vào mùa đông và mùa xuân RSV phân bố khắp nơi và có những yếu tố dịch tễ riêng, hàng năm có thể bùng phát thành dịch và kéo dài khoảng 5 tháng, từ tháng 12 đến tháng 4, đỉnh dịch thường vào tháng 1 hoặc tháng 2 [29,

30, 50] Ở Anh, nhiễm RSV thường xảy ra từ tháng giêng đến tháng ba và nó có thể thay đổi từ năm này qua năm khác Ở Mỹ, RSV xuất hiện vào mùa đông và kéo dài tới mùa xuân [29] Ở Washington DC, số trẻ em nhập viện có triệu chứng giống RSV, viêm đường hô hấp dưới cao hơn 2,7 lần Dịch lớn có thể dao động

và thay đổi từng năm Mặc dù mùa mắc RSV có thể tiên đoán được hàng năm nhưng tính khắc nghiệt của vụ dịch lại thay đổi

Trẻ em thường mắc vi rút này trong vòng 3 năm đầu của cuộc đời Một nghiên cứu ở Houston, 69% trẻ sơ sinh bị nhiễm vi rút RSV trong năm đầu tiên, 83% nhiễm trong năm thứ hai Các năm tiếp theo (3-4 tuổi) các trường hợp nhiễm bệnh vẫn tiếp tục được ghi nhân do đó khả năng tái nhiễm của trẻ nhỏ là

có thể

1.2.2 Tại Việt Nam

Việt Nam là nước đang phát triển, với dân số trên 80 triệu người, có khí hậu nhiệt đới (miền Nam) và bán nhiệt đới (miền Bắc), duy trì kiều hình nóng, ẩm, mưa nhiều nên bệnh VĐHHC có thể phát hiện quanh năm, nhưng có xu hướng tăng ở những tháng giao mùa Bệnh VĐHHC thường gọi là bệnh cảm cúm xảy ra trên khắp đất nước với tỷ lệ mắc trung bình 5 năm cuối năm của thập kỷ 90 được ghi nhận là 1.627,2/100.000 dân, xếp thứ nhất trong số 10 bệnh truyền nhiễm có

tỷ lệ mắc cao nhất ở Việt Nam [11] Tuy nhiên, tỷ lệ mắc khác nhau theo phân vùng địa lý và khí hậu Miền Bắc và Tây Nguyên có nhiều vùng núi cao, khí hậu

4 mùa nên hội chứng VĐHHC phát triển nhiều trong các mùa thu, mùa đông và

mùa xuân với tỷ lệ mắc trung bình 5 năm cuối của thập kỷ 90 là 2.298,6/100.000 dân ở miền Bắc và 3.160/100.000 dân ở Tây Nguyên Tỷ lệ này thấp hơn ở miền Trung và miền Nam nơi duy trì khí hậu nhiệt đới với hai mùa khô và mùa mưa trong năm Tại hai khu vực này bệnh VĐHHC thường phát triển vào mùa mưa với thời tiết lạnh và ẩm Tại Việt Nam, một số vụ dịch do căn nguyên vi rút cúm,

vi rút á cúm, vi rút adeno… đã được ghi nhận ở nhiều địa phương [10] Dịch cúm A/H2N2 lan rộng ra hầu hết các tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam trong những năm 1957-1958 tương tự năm 1968-1969 dịch cúm A/H3N2 tiếp tục được ghi nhận Ngoài ra, năm 2004 vi rút cúm A/H5N1 đã lây từ gia cầm sang người với 22 trường hợp mắc, trong đó 15 trường hợp tử vong được xác định, vi rút cúm A/H5N1 tiếp tục lưu hành trong quần thể gia cầm nuôi và tuyền bệnh sang một

số người trong những năm tiếp theo[38]

Sự lây truyền của vi rút cúm A/H1N1pdm/09 đã ảnh hưởng tới Việt nam, trường hợp nhiễm vi rút đầu tiên được xác định vào ngày 31/5/2009 tại thành phố Hồ chí Minh, và nhanh chóng vi rút cúm A/H1N1pdm/09 đã lây truyền trong cộng đồng ( 10/7/2009 Theo báo cáo của Bộ Y tế Việt Nam, tính đến ngày

30 tháng 9 năm 2009, Việt Nam có 9.868 trường hợp mắc cúm A/H1N1-pdm/09, trong đó có 22 ca tử vong

Trong những năm gần đây, đã có nhiều công trình nghiên cứu về căn nguyên gây VĐHHC ở các vùng miền khác nhau trong cả nước Nghiên cứu của

GS TS Huỳnh Phương Liên và cộng sự về các chủng vi rút cúm và các vi rút gây VĐHHC ở Hà Nội năm 2001 chủ yếu là vi rút cúm B (74%), sau đó là vi rút cúm A/H1N1 (20,78%), các vi rút gây VĐHHC khác như vi rút họ Picorna (51,28%) và RSV phân típ B là 10,26%[9] Một nghiên cứu khác ở Tây Nguyên năm 2003 đã cho thấy 13,9% là chủng vi rút cúm A/H3N2, xuất hiện gần như quanh năm và cao nhất vào tháng 9 Ngoài ra, các vi rút gây VĐHHC khác như

vi rút hợp bào đường hô hấp (RSV), hMPV và các vi rút đường ruột (họ Picorna) cũng là căn nguyên gây viêm đường hô hấp ở Tây Nguyên (18,2%) [5] Nhóm nghiên cứu gần đây nhất về vi rút gây bệnh VĐHHC ở trẻ em miền Trung

Việt Nam năm 2007 đã cho thấy căn nguyên chính là vi rút rhino (28%), RSV (23%), vi rút cúm (15%), hMPV (4,5%), vi rút á cúm (5% )[84]

Tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, tác giả Ngô Hương Giang và cộng sự cũng đã xác định có 9 tác nhân vi rút gây VĐHHC của các bệnh nhân tại miền bắc Việt Nam trong giai đoạn 2007-2009 Kết quả nghiên cứu cho thấy vi rút thuộc họ Picorna là tác nhân gây bệnh có tỷ lệ cao nhât (36.18%), vi rút cúm A/H3N2 cũng là tác nhân của 30,92% các trường hợp nhiễm bệnh, sau đó là vi rút cúm A/H5N1 chiếm 11,18%, RSV 8,55%, A/H1N1 (7,24%), vi rút cúm B (1,97%), hMPV (1,97%), vi rút á cúm típ 3 (1,32%), vi rút rhino (0,66%)

Việt Nam là nước đang phát triển, ngân sách chi cho chăm sóc sức khỏe ban đầu còn rất hạn hẹp Vì vậy, cùng với tiêu chảy và suy dinh dưỡng, viêm đường

hô hấp cấp hiện đang có tỷ lệ mắc và tử vong cao, đứng đầu trong các bệnh nhiễm trùng cấp tính [66, 71]

1.4 DỰ PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ

Hiện nay, trong các bệnh do vi rút hô hấp gây nên mới chỉ có vi rút cúm là

có vắc xin phòng bệnh

1.4.1 Dự phòng

1.4.1.1 Vi rút cúm

a, Vắc xin cúm mùa (A/H3N2, A/H1N1pdm/09 đại dịch và B)

- Gây miễn dịch được coi là biện pháp hữu hiệu để phòng cả vi rút cúm A

và B Tuy nhiên do vi rút cúm thay đổi liên tục và hiệu lực của vắc xin phụ thuộc vào sự tương đồng giữa chủng sản xuất vắc xin và chủng vi rút cúm đang lưu hành

- Việc tiêm vắc xin được ưu tiên cho ba nhóm đối tượng:

+ Nhóm đối tượng có nguy cơ cao: người già, người tàn tật, người mắc bệnh mãn tính về tim, phổi, thận

+ Nhóm tiếp xúc với các tác nhân gây nhiễm: nhân viên phòng thí nghiệm…

+ Nhóm người làm việc tại các dịch vụ công cộng: cảnh sát…

- Vắc xin cúm hiện tại có nhiều loại khác nhau bao gồm vắc xin bất hoạt (inactivated vaccine), vắc xin sống giảm độc lực (live attenuated influenza virus-LAIV) và vắc xin sống bất hoạt bằng công nghệ di truyền ngược (reassortment vaccine)

- Vắc xin cúm mùa đang dùng phổ biến là vắc xin sống bất hoạt, đa giá Hiện nay do vi rút cúm A/H1N1 ít lưu hành, tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo sử dụng vắc xin gồm 3 chủng vi rút cúm đối với khu vực Bắc bán cầu (Việt Nam) mùa cúm 2012 bao gồm:

Vi rút cúm đại dịch A/H1N1/09: A/California/7/2009 (H1N1)pdm09

Vi rút cúm A/H3N2: A/Perth/16/2009 (H3N2)

Vi rút cúm B: B/Brisbane/60/2008 [69]

b, Vắc xin cúm A/H5N1

Hiện nay, vắc xin phòng bệnh cúm A/H5N1 cho người vẫn đang được một

số nước trên thế giới và Việt Nam nghiên cứu, sản xuất ở quy mô phòng thí

nghiệm và được thử nghiệm lâm sàng trên người[14] Đây là vắc xin sống bất hoạt bằng công nghệ di truyền ngược

1.4.1.2 Vi rút á cúm:

Dự phòng vi rút á cúm là vắc xin vi rút chết có khả năng hình thành kháng thể trung hòa nhưng không bảo vệ được chống nhiễm bệnh, điều này dễ giải thích vì vắc xin á cúm đòi hỏi phải tạo được kháng thể lớp IgA, hiện nay chưa thực hiện được Do vậy, việc cách ly bệnh nhân và xử lý chất thải của bệnh nhân cần được quan tâm hơn

1.4.1.3 Vi rút hợp bào đường hô hấp (RSV)

Dự phòng bệnh do RSV bằng vắc xin là rất cần thiết và có hiệu quả tốt hơn Tuy nhiên cho đến nay một số loại vắc xin đang được nghiên cứu và thử nghiệm Vắc xin đầu tiên được sử dụng là vắc xin bất hoạt bằng formalin, tuy nhiên vắc xin này đã không tạo ra được đáp ứng miễn dịch Sau đó một loại vắc xin khác được sản xuất bằng tách thành phần F/G glycoprotein của vi rút Vắc xin tái tổ hợp adeno - RSV được sản xuất tạo ra được kháng thể kháng F/G glycoprotein và kháng thể trung hòa trên động vật thử nghiệm là chó, có khả năng bảo vệ chống lại nhiễm RSV ở đường hô hấp dưới Một loại vắc xin tái tổ hợp khác là Vaccin - RSV cũng đã thành công trong việc bảo vệ khỏi mắc bệnh Các loại vắc xin trên cho đến nay chưa được thử nghiệm lâm sàng trên người

Do việc lây lan bệnh bởi RSV theo đường dịch tiết hô hấp nên tỷ lệ nhiễm ở trẻ nhỏ trong thời gian có dịch là rất cao Để giảm thiểu việc lây nhiễm thì công tác vệ sinh trong quần thể dân cư, đặc biệt là tại những nơi tập trung đông trẻ nhỏ như bệnh viện, nhà trẻ là hết sức quan trọng Với những người làm công tác chăm sóc sức khỏe như các y tá, bác sỹ, hộ lý thì vấn đề tự bảo vệ cũng như tránh làm lây lan dịch bệnh là hết sức cần thiết

1.4.2 Điều trị

Các thuốc kháng vi rút được coi là phương pháp đặc hiệu cho điều trị nhiễm

vi rút tuy nhiên hiện tại các sản phẩm này rất hạn chế, chỉ tập trung vào một số tác nhân nhất định :

 Các thuốc kháng vi rút cúm

Ngày nay đã có thuốc trị bệnh cúm do vi rút gây ra, được chia làm 2 nhóm chính: ức chế sự xâm nhập vi rút Amantadine và Rimantadine (Flumadine) và ức chế sự giải phóng vi rút Oseltamivir (Tamiflu) và Zanamivir (Relenza)

- Amantadine và Rimantadine: ngăn cản sự xâm nhập của vi rút bằng cách

ức chế hoạt động của kênh ion M2, do đó ngăn cản sự “cởi áo” của vi rút [38]

- Oseltamivir và Zanamivir: ngăn cản sự giải phóng vi rút khỏi tế bào nhiễm nhờ ức chế hoạt động của enzyme neuraminidase (NA), là cơ chế hiệu quả nhất tác động vào vi rút [74] Quá trình giải phóng của vi rút cúm phải có sự tham gia trực tiếp của enzyme neuraminidase có tác dụng tách axit sialic từ màng glycoprotein của

vi rút do đó vi rút được giải phóng ra khỏi tế bào nhiễm Nếu không có enzyme này

vi rút sẽ bị giữ lại bên trong tế bào và không có cơ hội tấn công sang các tế bào khác

Các thuốc kháng vi rút hợp bào đường hô hấp (RSV):

- Ribavirin là một chế phẩm tổng hợp tương tự guanosin được cấp phép sử dụng năm 1972 tại Mỹ Cơ chế tác dụng của Ribavirin phức tạp và có thể tác động vào nhiều yếu tố: ức chế enzyme polymerase trong quá trình sao chép mRNA, ức chế inosine-5‟ monophosphate dehydrogenase làm suy yếu các quá trình tổng hợp các nucleotid trong tế bào [47]

 Vi rút á cúm:

- Chưa có thuốc chữa đặc trị và chưa có vắc xin hữu hiệu Do vậy, biện pháp tốt nhất là nghỉ ngơi và điều trị triệu chứng như dùng thuốc giảm sốt hay giảm đau (ví dụ: actaminophen) Nếu bị ho có thể dùng thuốc ho (dextromethophan)

1.5 CHẨN ĐOÁN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

1.5.1 Phương pháp phát hiện kháng nguyên

1.5.1.1 Phân lập vi rút

- Phân lập vi rút trên tế bào: vi rút được gây nhiễm trên các dòng tế bào cảm thụ: MDCK (vi rút cúm), Hep-2 (RSV, á cúm), Hela (RSV), Vero E6 (RSV, á cúm, hMPV), LL - MK2 (vi rút họ picorna, hMPV, Rhino)… [61, 81] Các mẫu

có sự hủy hoại tế bào được giữ lại để định loại vi rút

- Phân lập vi rút cúm được coi là „„tiêu chuẩn vàng” trong giám sát cúm [21]

Vi rút sau khi phân lập được định típ (xác định đặc tính kháng nguyên) bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) Chủng phân lập trong vụ dịch được nghiên cứu về các đặc điểm sinh học, sự biến đổi vật liệu di truyền và tính chất kháng nguyên để có thể dự báo được sự lan truyền của một chủng vi rút mới có độc lực cao trong giai đoạn tiếp theo và cho sự lựa chọn thành phần vắc xin cúm hàng năm

1.5.2 Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền

1.5.2.1 Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR)

Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược RT-PCR (Reverse transcriptase Polymerase chain reaction) đã được áp dụng và phát triển cho phần lớn các vi rút có vật liệu di truyền là ARN Phương pháp này có khả năng xác định nhanh sự nhiễm vi rút thông qua xác định vật liệu di truyền của vi rút bằng khả năng phát hiện đoạn ARN đặc hiệu của vi rút cúm trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng Đây là phương pháp nhanh, nhạy, có độ đặc hiệu cao và chính xác khi được kiểm soát tốt

Tuy nhiên, phản ứng này cũng có những hạn chế nhất định trong việc chẩn đoán sớm các trường hợp mắc bệnh do việc lựa chọn loại mẫu bệnh phẩm cũng như thời gian phù hợp để lấy mẫu Phản ứng RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm với giá thành tương đối cao, khả năng dễ bị tạp nhiễm bởi các tác nhân ngoại lai

1.5.2.2 Phản ứng real time RT-PCR

Phản ứng real time RT-PCR sử dụng cặp mồi và chất hóa học phát huỳnh quang hoặc probe có đánh dấu huỳnh quang (SYBR Green I, molecular beacon,

hybridization probe và Taqman probe) cho phép phát hiện chính xác số bản sao ADN của vi rút từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng theo thời gian thật (real-time) [28] Phản ứng Real time RT-PCR được ứng dụng để định lượng ADN, ARN, chẩn đoán các vi rút gây bệnh như vi rút cúm, RSV [24, 25].

Phản ứng real time RT-PCR không cần điện di sản phẩm như phương pháp RT-PCR thông thường nên phương pháp Real time RT-PCR được mô tả như một

hệ thống “đóng” Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, nhạy, có độ chính xác

và đặc hiệu cao, giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm [37] Tuy nhiên, phản ứng real time RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm với giá thành tương đối cao

1.5.2.3 Kỹ thuật Luminex/xTAG RVP

Tác nhân vi rút gây VĐHHC được xác định rất lớn ( trên 200 loại), để đáp ứng yêu cầu phát hiện sớm, chính xác nhiều loại tác nhân vi rút gây VĐHHC trong cùng một phản ứng, nhiều phương pháp đã được thiết kế: RT-PCR đa mồi, real time RT-PCR đa mồi và Luminex/xTAG đã được phát triển Luminex/xTAG

có khả năng phát hiện nhanh nhiều loại vi rút và phân típ (18 tác nhân vi rút khác nhau) Cúm A, cúm A/H1N1, cúm A/H3N2, cúm B, RSV, hMPV, Para 1,2,3,4, Enterovirus - Rhinovirus, coronavirus và Adenovirus Đây là một trong những ứng dụng công nghệ dãy vi lượng ( microarray) trên cơ sở sử dụng bộ hạt vi lượng mã hoá màu Luminex ( Luminex 100 sets colour- coded beads) Các hạt

vi lượng này có thể được bọc bởi các phân tử probe hoặc Tag, cho phép tóm băt, phát hiện các ADN đích đặc hiệu thông qua hệ thống lase [49] Tuy nhiên phương pháp này còn mới, yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm đặc chủng, giá thành cao nên chưa được ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu vi rút

1.5.3 Phương pháp phát hiện kháng thể

Đây là phương pháp phát hiện kháng thể kháng vi rút huyết thanh bệnh nhân Có 3 phương pháp cơ bản được sử dụng là phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI), thử nghiệm hấp phụ liên kết enzyme (ELISA) và phản ứng trung hòa vi lượng (MN) Kết quả được xác định dựa vào việc phát hiện kháng thể

kháng đặc hiệu vi rút cúm (ELISA, MN) hoặc sự biến động kháng thể (tăng gấp

4 lần) giữa 2 mẫu huyết thanh (HI) Chẩn đoán huyết thanh học chỉ có ý nghĩa hồi cứu và có tác dụng rất hạn chế đối với các trường hợp lâm sàng Tuy nhiên,

nó cũng là cơ sở cho việc chẩn đoán nếu như việc phát hiện kháng nguyên hoặc vật liệu di truyền của vi rút không đạt kết quả do chất lượng bệnh phẩm hoặc một

lý do nào khác

1.5.3.1 Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination Inhibition test-HI)

Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) được Hirst GK phát hiện năm

1942 [39] Nguyên lý của phương pháp là phát hiện kháng thể kháng HA đặc hiệu vi rút cúm (antihemagglutinin) khi kết hợp với kháng nguyên chuẩn (A/H1N1, A/H3N2, A/H1N1/09 đại dịch, A/H5N1, B…) có khả năng ức chế ngưng kết hồng cầu Hồng cầu chuột lang 0,75% hoặc hồng cầu gà 0,5% được sử dụng trong phản ứng HI để phát hiện kháng thể kháng vi rút cúm mùa, hồng cầu ngựa 1% được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng vi rút cúm A/H5N1 [21]

- Phản ứng HI tương đối đơn giản, kinh tế, có thể áp dụng để phát hiện sự lưu hành của kháng thể kháng đặc hiệu vi rút cúm với một số lượng mẫu lớn Phần lớn kháng thể kháng HA đều được phát hiện bằng phương pháp HI, vì vậy đây là phản ứng đặc hiệu phân típ đối với chẩn đoán huyết thanh học cúm Tuy nhiên, phản ứng

HI chỉ có giá trị trong chẩn đoán cúm khi có mẫu huyết thanh kép để xác định được

sự biến động kháng thể (tăng gấp 4 lần) giữa 2 mẫu huyết thanh Mẫu huyết thanh đơn không có giá trị trong chẩn đoán Mặt khác, theo những nghiên cứu gần đây cho thấy phản ứng HI có độ nhạy thấp hơn so với phản ứng trung hòa vi lượng [77]

1.5.3.2 Phản ứng trung hòa vi lượng (Microneutralization test – MN)

Phản ứng trung hòa vi lượng-ELISA được Hormon và cs phát triển năm

1988 [33, 77] Nguyên lý của phản ứng là sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu nucloprotein (NP) để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên NP trong tế bào nhiễm vi rút cúm Sử dụng phương pháp Reed và Muench để tính giá trị liều gây nghiễm 50% trên tế bào (TCID50)

Phản ứng trung hòa vi lượng là một phản ứng nhạy và đặc hiệu, có khả năng phát hiện kháng thể kháng đặc hiệu vi rút cúm A/H5N1 và kháng thể kháng các phân típ vi rút cúm gia cầm khác mà phản ứng HI không có khả năng phát hiện được [77] Phản ứng này dễ tiến hành vì không cần kháng nguyên tinh khiết Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là thí nghiệm phức tạp, thời gian tiến hành thí nghiệm kéo dài (2 ngày) và phải làm việc trực tiếp với vi rút sống, đặc biệt là vi rút cúm A/H5N1, nên thí nghiệm phải tiến hành trong phòng thí nghiệm

an toàn sinh học cấp độ 3

Tuy nhiên, chẩn đoán huyết thanh học ít sử dụng trong chẩn đoán bệnh VĐHHC, thường được sử dụng để nghiên cứu hồi cứu hoặc giám sát huyết thanh học

1.6 Cơ sở lý luận để thiết kế và tiến hành nghiên cứu

Bệnh VĐHHC do căn nguyên vi rút là một trong 10 bệnh truyền nhiễm thường xuyên gây dịch tại Việt nam với tỷ lệ mắc và tử vong cao [4,5,9] Trong giai đoạn 2003-2012, một số dịch VĐHHC đã được ghi nhận : SARS, cúm gia cầm A/H5N1, cúm đại dịch A/H1N1pdm/09… các vụ dịch này không những gây ảnh hưởng cho sức khoẻ cộng đồng mà còn ảnh hưởng lớn đến kinh tế và xã hội

Các nghiên cứu đã được triển khai trong những năm qua taị Việt Nam đã cho phép có những thông tin cơ bản nhất về sự lưu hành, mức độ nguy hiểm, tính nổi trội của một số tác nhân virút gây bệnh.[4] Sự nguy hiểm, khả năng lây truyền dễ và nguy cơ tiềm tàng của bùng phát dịch của các vi rút gây VĐHHC trong cộng đồng yêu cầu phải có sự chủ động giám sát vi rút học tại các bệnh viện cũng như trong cộng đồng Chương trình giám sát cúm Quốc gia đã được triển khai từ năm 2006, một số nghiên cứu khác cũng tập trung tại các cộng đồng

cụ thể (Hà nam, Khánh hoà)…

Bệnh viện đa khoa Việt-Tiệp, Hải phòng là bệnh viện loại 4, tuyến y tế cuối cùng chăm sóc sức khoẻ cho nhân dân thành phố Hải phòng và các tỉnh lân cận thuộc khu vực Đông Bắc bộ: Quảng Ninh, Hải Dương, Thái Bình , đây là một điểm giám sát phù hợp cho các nghiên cứu liên quan đên kiểu hình khí hậu

Để tiếp nối các nghiên cứu đã tiến hành trong giai đoạn trước, đồng thời phát triển các giám sát chủ động trong bệnh viện các vi rút gây VĐHHC, chúng

tôi tiến hành xây dựng nghiên cứu “Tìm hiểu các căn nguyên vi rút gây viêm

đường hô hấp cấp của một số bệnh nhân điều trị ở bệnh viện đa khoa Việt Tiệp - Hải Phòng 2010-2012”

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Định nghĩa ca bệnh

Các bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp nghi do vi rút có triệu chứng như sau:

- Bệnh khởi phát trong vòng 7 ngày

- Sốt cao đột ngột trên 38oC (xác định bằng cách đo nhiệt độ hoặc qua khai thác bệnh sử)

- Có ho và/hoặc khó thở

- Và có ít nhất 1 trong những triệu chứng sau: Thở nhanh; tổn thương trên X

quang phổi; phải hỗ trợ hô hấp

2.1.2 Cỡ mẫu

170 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp của bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp nghi

do vi rút thu thập tại điểm giám sát bệnh viện đa khoa Việt - Tiệp trong giai đoạn tháng 09/2010 đến tháng 4/2012 (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Số bệnh nhân VĐHHC tại bệnh viện Việt Tiệp - Hải Phòng

Mẫu bệnh phẩm được lấy ở những bệnh nhân nghi nhiễm virút từ 1-5 ngày kể

từ ngày khởi bệnh

2.2.1.2 Loại bệnh phẩm

Bệnh phẩm để xác định vi rút: Dịch ngoáy họng Trong trường hợp không lấy được dịch họng có thể lấy dịch mũi, dịch nội khí quản được bảo quản trong môi trường vận chuyển vi rút

2.2.1.3 Môi trường vận chuyển

Môi trường vận chuyển được chuẩn bị tại phòng thí nghiệm cúm – viện VSDT

TƯ, sau đó chuyển đến trung tâm y tế dự phòng Hải Phòng

Bảo quản môi trường vận chuyển ở 4o

C Thời hạn sử dụng môi trường: 03 tháng

2.2.1.4 Kỹ thuật lấy mẫu bệnh phẩm

Dịch ngoáy họng: Đưa tăm bông vào vùng hầu họng, để cho thấm ướt toàn bộ đầu tăm bông, sau đó miết mạnh và quay tròn tăm bông tại khu vực 2 amidan và

thành sau họng 3 đến 4 lần (để lấy được dịch, tế bào vùng họng) Đưa ngay tăm

bông vào tube nhựa đã có sẵn 2-3ml môi trường bảo quản virút

Hình 2.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm dịch họng

Dịch mũi: Dùng 1 tăm bông thu thập bệnh phẩm trong cả 2 mũi Đầu tăm bông sau khi thu thập bệnh phẩm chuyển vào tube chứa 2-3 ml môi trường vận chuyển,

bỏ bớt đầu thừa của tăm bông

Hình 2.2 Thu thập mẫu bệnh phẩm dịch mũi

Dịch nội khí quản: Bệnh nhân khi đang thở máy, đã được đặt nội khí quản

Dùng 1 ống hút dịch, đặt theo đường nội khí quản và dùng bơm tiêm hút dịch nội

khí quản theo đường ống ta đã đặt Cho dịch nội khí quản vào tube chứa môi trường

bảo quản virút

2.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ

2.2.2.1 Trang thiết bị

Bảng 2.2 Bảng mô tả trang thiết bị

Máy soi gel tia UV hãng Gel XL Gel Mate

- Que ngoáy họng và tỵ hầu

- Ống chứa môi trường vận chuyển vi rút

* Trang bị phòng hộ cá nhân: quần áo chống dịch mặc một lần, khẩu trang

* Dụng cụ thí nghiệm:

- Pipet tự động vi lượng các loại: 0,5µl – 1000 µl

- Đầu côn vô trùng các loại,có phin lọc: 0,5µl – 1000 µl

- Típ ly tâm: 1,5 ml – 2ml

- Khay chạy điện di 100-250 ml và răng lược, 15-20 răng, dày 1mm

- Cốc đong 100-300 ml

- Đĩa microtitre hoặc giấy parafilm

- Pipet đa kênh, pipet có lọc

- Các vật liệu cần thiết khác như: Găng dùng 01 lần, giấy thấm, găng vải chống nhiệt

2.2.3 Sinh phẩm

2.2.3.1 Sinh phẩm cho phản ứng RT-PCR

Bảng 2.3 Hệ thống mồi sử dụng để phát hiện vật liệu di truyền vi rút bằng phương

pháp RT - PCR

khuếch đại (bp)

Nguồn gốc

H1 H1 HA F AGG CAA ATG GAA ATC TAA TAG CGC

164 CDC, Mỹ H1 HA R CCA TTG GTG CAT TTG AGG TGA TG

H3 H3 HA F AAG CAT TCC YAA TGA CAA ACC

120 CDC, Mỹ H3 HA R ATT GCR CCR AAT ATG CCT CTA GT

H5 H5-1 GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC

219

WHO, Hồng Kông H5-3 CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG

H1pdm swH1 Conv-F1 TGC ATT TGG GTA AAT GTA ACA TTG

349 NIID swH1 Conv-R1 AAT GTA GGA TTT RCT GAK CTT TGG

B Flu B F TCC TCA ACT CAC TCT TCGAGC G

120 CDC, Mỹ Flu B R CGG TGC TCT TGA CCA AAT TGG

hMPV hMPVF-F1-FAM GAG CAA ATT GAA AAT CCC AGA CA

347 CDC, Mỹ hMPFV-R1 GAA AAC TGC CGC ACA ACA TTT AG

HIPV1 PIV1- forward CCG GTA ATT TCT CAT ACC TAT G

OL 68-1 GGT AAY TTC CAC CAC CAN CC Entero EVP4 CTA CTT TGG GTG TCC GTG TT

650

Niigata, Nhật Bản OL68 GGG AAC TTC CAG TAC CAY CC

Cor-p-R1 CAG GTA AGC GTA AAA CTC ATC

- Bộ sinh phẩm tách chiết vật liệu di truyền của vi rút - ARN sử dụng bộ kít QIAamp viral RNA Mini, 250 preps, Cat No 52904, Quiagen

- Bộ sinh phẩm dùng cho phản ứng RT-PCR: QIAGEN Onestep RT-PCR kit, Cat No 210212

- RNase inhibitor (40U/) – Invitrogen

- Chứng dương: ARN virus cúm mùa (H1N1, H3N2 and B), virút cúm

A/H5N1 và virút A/H1N1pdm/09 đại dịch và các vi rút đường hô hấp khác

- Chứng âm: sử dụng khuôn mẫu là nước cất tinh khiết (No Template Control

- NTC)

- Chứng âm tách chiết: khuôn mẫu được tách chiết cùng với bệnh phẩm, sử

dụng môi trường vận chuyển sạch làm mẫu tách chiết (Negative Extraction Control

TAKARA BIO Cat No R007A

Shrimp Alkaline Phosphatase USB Cat No 70092Y

Exonuclease I USB Cat No 70073Z

Streptavidin, R-phycoerythrin conjugate Molecular Probes Cat No S-866

Bộ sinh phẩm dùng cho kỹ thuật Luminex/xTAG: xTAG RVP kit, 96 preps Cat No I019C0290, Luminex

Chứng dương

E coli phage MS 2 ATCC Cat No 15597-B1

Bacteriophage Lambda DNA New England Biolabs Cat No N3011S

2.2.3.3 Nguyên vật liệu hóa chất cho phân lập

Tế bào thường trực thận chó MDCK (Mardin – Darby

Kidney cells), Hep2, LLC-MK2

CDC, NIID

Chai nuôi cấy tế bào T-75 Corning Cat.No #430720 Phiến 96 giếng đáy chữ U Corning – Cat.No # 3898 Dulbecco‟s Modified Eagle Medium (D-MEM)* GIBCO Cat.No # 11965-092 Penicillin-Streptomycin, stock solution (10,000 U/ml

penicillin G; 10,000 μg/ml streptomycin sulfate)

GIBCO Cat.No # 15140-023

Bovine serum albumin fraction V, 7.5% solution GIBCO Cat.No # 15260-011

Fetal bovine serum, 40 nm filtered HyClone Laboratories, Inc

Cat.No # A-1111-L Trypsin-EDTA

(0.05% trypsin; 0.53 mM EDTA.4Na)

GIBCO Cat.No # 25300-054

Gentamicin reagent solution

(50mg gentamicin sulfate/ml)

GIBCO Cat.No # 15750-011

Dung dịch đệm PBS

2.2.2.3 Sinh phẩm sử dụng cho phương pháp xác định trình tự gen

- Uni 12 primer (CDC – Mỹ)

- cADN SuperscriptIII Reverse Transcriptase, P/N 02321, Invitrogen