3.4.1. Đặc tính kháng nguyên
Bảng 3.13: Kết quả phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HAI)
Tên chủng virút
Hiệu giá HAI của vi rút phân lập với các kháng huyết thanh chuẩn.
Kết luận A/H3N2 B/Brisban e B/Wisconsi n A/H1N1pd m/09 HP-SARI 20154 (B) 10 320 20 10 (B/ Brisbane /60/2008) - Victoria lineage HP-SARI 20201 (B) 10 320 10 10 (B/ Brisbane /60/2008) - Victoria lineage HP-SARI 20216 (A/H1N1pdm/09) 10 <10 10 640 A (H1N1) pdm09 HP-SARI 2095 (A/H1N1pdm/09) <10 <10 10 >640 A (H1N1) pdm09 A/H3 (Kháng nguyên chuẩn) >=1280 10 20 1/40 B/Victoria (Kháng nguyên chuẩn) <10 320 20 <10 B/Yamagata (Kháng nguyên chuẩn) <10 <10 160 <10 A/H1pdm (Kháng nguyên chuẩn) <10 <10 <10 >=1280
Kết quả cho thấy các chủng vi rút cúm phân lập trong nghiên cứu: HP-SARI 20216, HP-SARI 2095 được xác định là cúm A/H1N1pdm/09 bằng phương pháp RT-PCR có phản ứng tốt với kháng huyết thanh chuẩn A/H1N1pdm/09 và đạt hiệu giá HI tương ứng >=1/640, kết quả trên tương đương với hiệu giá ngăn ngưng kết hồng câù (HAI) của vi rút chứng A/California/07/09 (H1N1) là 1/1280 , Tương tự, kết quả phản ứng HAI của 2 chủng vi rút cúm B trong nghiên cứu (HP-SARI 20201, HP-SARI 20154) đều có hiệu giá là 1/320 HAI khi phản ứng với kháng huyết thanh B/ Brisbane/2009, tương đương với hiệu giá HAI của vi rút cúm B chuẩn thuộc dòng B/Victoria. Kết quả của giám sát cúm quốc gia
67
giai đoạn 2006-2012 cho thấy, vi rút cúm B lưu hành tại Việt nam đồng thời có đặc tính kháng nguyên của cả 2 dòng Victoria và Yamagata, tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi chỉ phát hiện vi rút cúm B mang đặc tính KN giống dòng Victoria, tương tự vi rút cúm B lưu hành tại Australia năm 2009 và là vi rút dự tuyển cho vắc xin cúm mùa 2010 - 2011 và 2011 - 2012 tại khu vực Bắc bán cầu (B/ Brisbane /60/2008 ) [69]. Kết quả phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu HAI cho phép kết luận vi rút cúm A/H1N1pdm/09 xác định trong nghiên cứu có đặc tính kháng nguyên tương tự vi rút cúm dự tuyển vắc xin A/ California/07/09 (H1N1) cho cả 2 khu vực địa lý Bắc bán cầu và Nam bán cầu trong giai đoạn 2009-2012. Tương tự,vi rút cúm B xác định trong nghiên cứu có đặc tính kháng nguyên tương tự vi rút cúm B dòng Victoria- đại diện là vi rút dự tuyển vắc xin năm 2010-2011 và 2011-2012 cho khu vực Bắc bán cầu (B/ Brisbane /60/2008 )
3.4.2. Xác định đặc điểm di truyền vi rút cúm
Vật liệu di truyền của virút cúm luôn thay đổi thích nghi với hệ thống miễn dịch của tế bào vật chủ. Những nghiên cứu về đặc điểm di truyền học luôn đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện các chủng virút cúm mới, có khả năng tiềm tàng gây dịch trên diện rộng. Tổng số 4 chủng vi rút cúm phân lập trong nghiên cứu được tiến hành giải trình tự phân đoạn gen HA nhằm phân tích đặc điểm di truyền liên quan đến sự tiến hóa của các chủng virút này. Trong nghiên cứu này trình tự nucleotide của virút cúm A/California/7/2009 (H1N1) và vi rút cúm B/Brisbane/60/2008 , cùng với một số trình tự của các chủng vi rút cúm tương tự lưu hành tại Việt Nam và các chủng trên thế giới trong các năm gần đây được sử dụng như thông số tham chiếu. Các trình tự nucleotide của các vi rút tham chiếu được thu thập về từ GenBank.
Cây gia hệ gen HA của virút cúm được xây dựng bằng phần mềm MEGA 4 trên cơ sở phương pháp ước tính khả năng chênh lệch tối đa (maximum likelihood) thông qua mô hình NJ (Neighbor-Joining). Các virút A/California/7/2009 (H1N1) và B/Brisbane/60/2008 làm gốc của cây gia hệ.
68
69
Kết quả cây gia hệ HA của chủng cúm A/H1N1 đại dịch cho thấy, virút cúm A/H1N1 đại dịch có thể tách thành 2 nhóm (nhóm I và nhóm II), nhóm II được chia ra thành 4 phân nhóm phụ (phân nhóm IIa, IIb, IIc, IId), trong đó chủng HP-SARI 2095 thuộc phân nhóm IIa và chủng HP-SARI 20216 thuộc phân nhóm IIb. Khi so sánh trình tự gen HA của chủng vắc xin với trình tự HA đã được giải trình tự của 2 chủng cúm H1N1 đại dịch chúng tôi thấy cả 2 chủng có độ tương đồng di truyền cao đạt 99%.
So sánh vớí vi rút dự tuyển vắc xin A/California/07/2009 (H1N1), vi rút cúm A/H1N1pdm/09 thu thập được trong nghiên cứu có số nucleotide sai khác được xác định là 12 nucleotide (bảng 3.14), tuy nhiên không có sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên (hình 3.7) có thể hiểu rằng sự khác biệt của nucleotide không ảnh hưởng đến cấu trúc protein HA, vì vậy đặc tính kháng nguyên không có sự khác biệt đáng kể.
Bảng 3.14: Sự sai khác nucleotide trong phân đoạn gen HA của vi rút A/H1N1pdm/2009 .
Vi rút dự tuyển vắc xin Vi rút Sự sai khác số nucleotide A/California/07/2009 (1636 bp) HP-SARI 20216 (1636 bp) 12 HP-SARI 2095 (1636 bp) 12
70
71
Kết quả cây gia hệ HA của chủng cúm B cho thấy, virút cúm B phân lập HP- SARI 20154 và HP-SARI 20201 đều thuộc dòng B/Victoria và nhóm vào cùng vi rút cúm dự tuyển vắc xin B/Brisbane/60/2008 và một số vi rút cúm B lưu hành tại Honkong, Trung quốc, Hàn quốc… năm 2009-2010.
Tương tự số nucleotide khác biệt của vi rút cúm B phân lập trong nghiên cứu với vỉrut dự tuyển vắc xin B/Brisbane/60/2008 được xác định là 2 nucleotid (HP- SARI 20201) và 12 nucleotide (HP-SARI 20154), sự khác biệt này cũng được khẳng định trên hình ảnh cây gia hệ khi HP-SARI 20154 có khoảng cách xa hơn vỉrut dự tuyển vắc xin B/Brisbane/60/2008 .
Bảng 3.15. Sự sai khác nucleotide trong phân đoạn gen HA của vi rút cúm B
Vi rút dự tuyển vắc xin Vi rút Sự sai khác số nucleotide B/Brisbane/60/2008 (1710 bp) HP-SARI 20154 (1105 bp) 12 HP-SARI 20201 (1110 bp) 2
3.5 HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN VĐHHC
Để đảm bảo chất lượng kết quả xét nghiệm đồng thời đáp ứng được yêu cầu chẩn đoán sớm căn nguyên tại phòng thí nghiệm, dựa trên kết quả đã thu được từ phương pháp RT-PCR thông dụng và Luminex/xTAG chúng tôi đề xuất quy trình chẩn đoán sớm căn nguyên vi rút gây VĐHHC tại PTN như sau:
72
Mẫu bệnh phẩm
Tách chiết ARN
Tác nhân vi rút cúm A/B
Âm tính Dương tính B Dương tính A
Vi rút họ Picorna H1N1pdm, H3N2, H1N1. H5N1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Âm tính Dương tính Âm tính D/tính
RSV, hMPV, P1, P2, P3 Vi rút entero, Rhino
Cov-229E, Cov-OC43
Âm tính D/tính Âm tính Dương tính
Hình 3.9. Quy trình chuẩn đoán vi rút gây VĐHHC
KL Kết luận KL KL KL KL KL
73
Quy trình chẩn đoán trên cho phép phát hiện 16 tác nhân vi rút gây VĐHHC trên bệnh phẩm lâm sàng, so với quy trình trước 2 tác nhân CoV-229E và CoV- OC43 được bổ sung. Sử dụng RT-PCR thông dụng trong chẩn đoán sớm tại Việt nam là phù hợp trong điều kiện hiện nay, do điều kiện kinh tế không cho phép các phương pháp hiện đại và nhanh như Luminex/xTAG. Để đảm bảo tính kịp thời của chẩn đoán (yếu điểm của RT-PCR thông dụng), dựa vào kết quả nghiên cứu này và các kết quả tham khảo, quy trình chẩn đoán sẽ được tiến hành phát hiện các tác nhân vi rút thường gặp trước như : cúm, vi rút họ Picorna. Các tác nhân vi rút còn lại sẽ tiếp tục được tiến hành trên những mẫu bệnh phẩm âm tính với vi rút cúm và vi rút họ Picorna. Sự sắp xếp như vậy sẽ đảm bảo được yêu cầu chẩn đoán sớm và tiết kiệm trong điều kiện Việt nam.
74
KẾT LUẬN
Phân tích 170 mẫu bệnh phẩm VĐHHC nghi nhiễm vi rút tại bệnh viện đa khoa Việt Tiệp, Hải Phòng từ tháng 9 năm 2010 đến tháng 4 năm 2012. Chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
1. Tổng số 26 mẫu bệnh phẩm được xác định dương tính với các vi rút gây VĐHHC chiếm tỷ lệ 15,2%, các mẫu dương tính được phân bố cho 7 tác nhân vi rút gây VĐHHC được xác định: vi rút cúm A/H1N1pdm/09 (4 mẫu bp); vi rút cúm B(6 mẫu bp), hMPV (1 mẫu bp), á cúm típ 1(3 mẫu bp), vi rút họ Picorna (10 mẫu bp), corona 229E (1 mẫu bp) và corona OC43 (1 mẫu bp). Vi rút họ Picorna phát hiện trong hầu hết thời gian nghiên cứu, chiếm tỷ lệ cao (38,4%). Bệnh phẩm thu thập nhiều vào tháng 11,12. Các tháng có sự đồng lưu hành của nhiều tác nhân vi rút là tháng 1, tháng 3 trong giai đoạn nghiên cứu.
2. Đã phân lập được: vi rút cúm A/H1N1pdm/09, vi rút cúm B, á cúm 1, hMPV và vi rút họ picorna. Tỷ lệ phân lập dương tính đạt 29,1% trong tổng số mẫu được xác định dương tính bằng phương pháp RT-PCR. Vi rút cúm A/H1N1pdm/09 phân lập được trong nghiên cứu có đặc điểm di truyền và đặc tính kháng nguyên tương tự vi rút cúm dự tuyển vắc xin A/California/07/09 (H1N1) cho cả 2 khu vực Bắc và Nam bán cầu 2009-2012. Vi rút cúm B có đặc điểm di truyền và đặc tính kháng nguyên tương đồng với vi rút cúm B/Brisbane/60/08 là vi rút đại diện của dòng kháng nguyên Victoria và là vi rút dự tuyển vắc xin cho khu vực Bắc bán cầu trong mùa cúm 2010- 2011 và 2011-2012.
3. Quy trình chẩn đoán sớm tác nhân vi rút gây VĐHHC bằng phương pháp RT-PCR thông thường theo các thứ tự ưu tiên sau:
- Các tác nhân vi rút cúm theo nhóm (A; B) - Các tác nhân vi rút họ Picorna.
- Phân típ vi rút cúm và enterovirus, Rhinovirus
- RSV, hMPV, á cúm phân típ 1,2,3, SARS - CoV, CoV - 229E và CoV- OC43.
75
KIÉN NGHỊ
- Tiếp tục duy trì giám sát hội chứng VĐHHC tại bệnh viện đa khoa Việt - Tiệp, Hải phòng, mở rộng giám sát tại các bệnh viện có khu vực địa lý và kiểu hình khí hậu khác nhau
76
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bộ Y tế(2003).Dịch tễ, lâm sàng, điều trị và phòng chống bệnh viêm đường hô hấp cấp (SARS), Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
2. Bộ Y tế, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng (2009). Báo cáo kết quả hoạt động giám sát cúm 9 tháng đầu năm 2009. Dự án "Xây dựng hệ thống giám sát cúm tại Việt Nam", Nhà xuất bản Y học, Hà Nội
3. Bộ Y tế(2004), Niên giám thống kê bệnh truyền nhiễm năm 2003, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
4. Ngô Hƣơng Giang (2010). Tìm hiểu căn nguyên vi rút gây viêm phổi tại miền bắc Việt Nam 2007-2009, Luận văn Thạc sĩ công nghệ sinh học, Đại học Bách khoa.
5. Nguyễn Lê Khánh Hằng, Huỳnh Phƣơng Liên, Nghiêm Kim Hà, Lê Quỳnh Mai, Võ Thị Hƣờng, Đặng Tuấn Đạt (2005). "Căn nguyên các vi rút gây viêm đường hô hấp cấp ở Tây Nguyên, 2003-2004," Tạp chí Y học dự phòng, Tập XV, số 5 (76): 17-21.
6. Nguyễn Lê Khánh Hằng (2010). Nghiên cứu căn nguyên của các vụ dịch cúm người đầu những năm 2000 tại miền Bắc, Việt Nam, Luận án Tiến sĩ sinh học, Đại Học Quốc Gia Hà Nội (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7. Trần Thị Thu Hƣơng (2009).Tìm hiểu sự lưu hành của vi rút hợp bào-RSV trên bệnh nhân nhi dưới 2 tuổi với triệu chứng viêm đường hô hấp, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
8. Nguyễn Thanh Liêm (2006). Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, dịch tễ học, phương pháp chẩn đoán sớm, phác đồ điều trị hiệu quả và dự phòng bệnh viêm đường hô hấp cấp do vi rút cúm A/H5N1, vi rút cúm A và vi rút hợp bào đường hô hấp ở Việt Nam, Đề tài cấp nhà nước, Bệnh Viện Nhi Trung Ương. 9. Huỳnh Phƣơng Liên, Nguyễn Lê Khánh Hằng, Nghiêm Kim Hà, Nguyễn Công Đoàn, Hiroshi Suzuki, Saito Reiko (2005). "Nghiên cứu các chủng vi
77
rút cúm và các vi rút gây viêm đường hô hấp cấp ở Hà Nội 2001", Y học thực hành (505), Số 3/2005: 23-26.
10. Nguyễn Hữu Tâm (2006). Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học của các trường hợp mắc bệnh cúm A/H5N1 ở Miền Bắc Việt Nam, năm 2005, Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật, Đề tài cấp Viện, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương, Hà Nội.
11. Trần Văn Tiến và cs.(2001). Thống kê các bệnh truyền nhiễm. tr. 40.
12. Trƣờng Đại học Y Hà Nội, Bộ môn Vi sinh Vật. (2003). Vi sinh Y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. tr. 297-309.
13. PGS. TS. Phạm Văn Ty (2007). Virut học, Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội. tr. 205- 256.
14. Nguyễn Thu Vân (2006). Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm, Đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ nhà nước ĐTDDL-2006/02G, Hà Nội.
15. Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ƣơng (2001). Phân tích số liệu các bệnh truyền nhiễm ở Việt Nam 1996-2000, Nhà xuất bản Bản Đồ, Hà Nội.
Tiếng Anh
16. Anne-Charlotte Sentilhes, Vimatha Xaysitthideth, Sareth Rith, Somvay
Ongkhamme, Thongchanh Sisouk,Darouny Phonekeo, Jean-Jacques
Bernatas, Vincent Deubel, Philippe Buchy, Paul Brey, Phengta
Vongphrachanh (2011). "Identification of viruses in Acute Lower
Respiratory Infections (ALRI) in Lao People's Democratic Republic". BMC
Proc. 2011; 5(Suppl 1): P74.
17. Beckett CG., Kosasih H., Ma'roef C., Listiyaningsih E., Elyazar IR., Wuryadi S., Yowono D., McArdle JL., Corwin AL., Porter KR. (2004). "Influenza surveillance in Indonesia: 1999-2003", Clinical Infectious Disease, 39: 443-449.
78
18. Besselaar TG, Botha L, McAnerney JM, Schoub BD. (2004). "Antigenic and molecular analysis of influenza A (H3N2) virus strains isolated from a localised influenza ourbreak in South Africa in 2003", J Med Virol., 73: 71- 78
19. Carr J., Ives J., Kelly L., Lambkin R., Oxford J., Mendel D., Tai L., N, Roberts (2002). "Influenza virus carrying neuraminidase with reduced sensitivity to oseltamivir carboxylate has altered properties in vitro and is compromised for infectivity and replicative ability in vivo", Antiviral Res, 54: pp. 79-80.
20. Centers for Disease Control and Prevention (April 25-29,2005). Modern Methods for Influenza Detection and Subtyping, Atlanta, Georgia.
21. Centers for Disease Control and Prevention (August 13-14, 2003). "Laboratory Techniques for Influenza Diagnosis", Surveillance Coordinator's Conference Atlanta, Georgia, US.
22. Clinton S. Robbins, Carla M. T. Bauer, Neda Vujicic, Gordon J. Gaschler, Brian D. Lichty, Stämpfli., Earl G. Brown and Martin R. (2006). "Cigarette Smoke Impacts Immune Inflammatory Responses to Influenza in Mice ", American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 174: 1342-1351.
23. Echevarria JE, et al. (1998). J Clin Microbiol, 36: 1388-1391.
24. Ellis JS, Smith JW, Braham S, Lock M, Barlow K, MC, Zambon (2007). "Deign and validation of an H5 Taqman real-time one-step reverse transcription-PCR and confirmatory assays for diagnosis and verification of influenza A virus H5 infections in human," J Clin Microbiol, 45(1535-1543). 25. Enders Ko Ng, Preter KC Cheng, Antia YY Ng, Hoang, TL, Lim, and William WL (2005). "Influenza A H5N1 detection", Emer Inf Dis, 11: 1303- 1305.
26. Fabrice Carrat, Juliette Deshayes, Isabelle Goderel, Gregory Pannetier, Valleron., Céline Lazarovici and Alain-Jacques (June 2004). "Factors
79
associated with intensity of symptoms in patients seeking medical advice for flu", International Congress Series, 1263: 308-311.
27. Fay H Johnston, Anne M Kavanagh, Scott, David M J S Bowman and Randall K (2002). "Exposure to bushfire smoke and asthma: an ecological study", The Medical journal of Australia, 176(11): 535-538. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
28. Gibson UEM, Heid CA., Williams PM.(1996). "A novel method for real time quantitative RT-PCR", Genome Res, 6: 995-1001
29. Glezen, W. P. (1977). "Pathogenesis of bronchiolitis: epidemiologic considerations", Pediatr.Res. 11: 239 - 243.
30. Glezen, W. P., F. W. Denny. (1973). "Epidemiology of acute lower respiratory disease in children", N. Engl. J. Med, 288: 498 - 505.
31. Guy Boivin MD.(2002). Update on human metapneumoniavirus, Laval University, Quebec City, Canada.
32. Hampson AW. (1999). "Epidemiological data on Influenza in Asian countries", Vaccine, 17(19-23).
33. Harmon MW., PA Rota, HH Walls, and AP Kendal (1988). "Antibody response in humans to influenza virus type B host cell-dirived variant after vaccination with standard (egg-devired) vaccine or natural infection", J Clin Microbiol, 26: 333-337.
34. Herlocher ML., Carr J., Ives J., Elias S., Truscon R., Roberts NA., Monto AS. (2002). "Influenza virus carring an R292K mutation in the neuraminidase gene is not transmitted in ferrets", Antivial Res, 54(p.99-111). 35. Herlocher ML., Truscon R., Elias S., Yen HL., Roberts NA., Ohmit SE.,
Monto AS. (2004). "Influenza viruses resistant to the antiviral drug oseltamivir: transmission sudies in ferrets", J Infect Dis, 190: pp.1627-1630. 36. Hien T. Nguyen, Nila J. Dharanb, Mai T.Q. Le, Nguyen B. Nguyen,
Chung T. Nguyen, Dong V. Hoang, Huu N. Tran, Chien T. Bui, Dat T. Dang, Dinh N. Pham, Hoa T. Nguyen, Tu V. Phan, David T. Dennis,
80
Timothy M. Uyeki, Joshua Mottb, Nguyen Yen T. (2010). "National