23
1.5.1.1 Phân lập vi rút
- Phân lập vi rút trên tế bào: vi rút được gây nhiễm trên các dòng tế bào cảm thụ: MDCK (vi rút cúm), Hep-2 (RSV, á cúm), Hela (RSV), Vero E6 (RSV, á cúm, hMPV), LL - MK2 (vi rút họ picorna, hMPV, Rhino)… [61, 81]. Các mẫu có sự hủy hoại tế bào được giữ lại để định loại vi rút.
- Phân lập vi rút cúm được coi là „„tiêu chuẩn vàng” trong giám sát cúm [21]. Vi rút sau khi phân lập được định típ (xác định đặc tính kháng nguyên) bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI). Chủng phân lập trong vụ dịch được nghiên cứu về các đặc điểm sinh học, sự biến đổi vật liệu di truyền và tính chất kháng nguyên để có thể dự báo được sự lan truyền của một chủng vi rút mới có độc lực cao trong giai đoạn tiếp theo và cho sự lựa chọn thành phần vắc xin cúm hàng năm.
1.5.2 Phƣơng pháp phát hiện vật liệu di truyền
1.5.2.1 Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR)
Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược RT-PCR (Reverse transcriptase Polymerase chain reaction) đã được áp dụng và phát triển cho phần lớn các vi rút có vật liệu di truyền là ARN. Phương pháp này có khả năng xác định nhanh sự nhiễm vi rút thông qua xác định vật liệu di truyền của vi rút bằng khả năng phát hiện đoạn ARN đặc hiệu của vi rút cúm trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Đây là phương pháp nhanh, nhạy, có độ đặc hiệu cao và chính xác khi được kiểm soát tốt.
Tuy nhiên, phản ứng này cũng có những hạn chế nhất định trong việc chẩn đoán sớm các trường hợp mắc bệnh do việc lựa chọn loại mẫu bệnh phẩm cũng như thời gian phù hợp để lấy mẫu. Phản ứng RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm với giá thành tương đối cao, khả năng dễ bị tạp nhiễm bởi các tác nhân ngoại lai.
1.5.2.2 Phản ứng real time RT-PCR
Phản ứng real time RT-PCR sử dụng cặp mồi và chất hóa học phát huỳnh quang hoặc probe có đánh dấu huỳnh quang (SYBR Green I, molecular beacon,
24
hybridization probe và Taqman probe) cho phép phát hiện chính xác số bản sao ADN của vi rút từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng theo thời gian thật (real-time) [28]. Phản ứng Real time RT-PCR được ứng dụng để định lượng ADN, ARN, chẩn đoán các vi rút gây bệnh như vi rút cúm, RSV... [24, 25].
Phản ứng real time RT-PCR không cần điện di sản phẩm như phương pháp RT-PCR thông thường nên phương pháp Real time RT-PCR được mô tả như một hệ thống “đóng”. Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, nhạy, có độ chính xác và đặc hiệu cao, giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm [37]. Tuy nhiên, phản ứng real time RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm với giá thành tương đối cao.
1.5.2.3 Kỹ thuật Luminex/xTAG RVP
Tác nhân vi rút gây VĐHHC được xác định rất lớn ( trên 200 loại), để đáp ứng yêu cầu phát hiện sớm, chính xác nhiều loại tác nhân vi rút gây VĐHHC trong cùng một phản ứng, nhiều phương pháp đã được thiết kế: RT-PCR đa mồi, real time RT-PCR đa mồi và Luminex/xTAG đã được phát triển. Luminex/xTAG có khả năng phát hiện nhanh nhiều loại vi rút và phân típ (18 tác nhân vi rút khác nhau) Cúm A, cúm A/H1N1, cúm A/H3N2, cúm B, RSV, hMPV, Para 1,2,3,4, Enterovirus - Rhinovirus, coronavirus và Adenovirus. Đây là một trong những ứng dụng công nghệ dãy vi lượng ( microarray) trên cơ sở sử dụng bộ hạt vi lượng mã hoá màu Luminex ( Luminex 100 sets colour- coded beads). Các hạt vi lượng này có thể được bọc bởi các phân tử probe hoặc Tag, cho phép tóm băt, phát hiện các ADN đích đặc hiệu thông qua hệ thống lase. [49]. Tuy nhiên phương pháp này còn mới, yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm đặc chủng, giá thành cao nên chưa được ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu vi rút
1.5.3 Phƣơng pháp phát hiện kháng thể
Đây là phương pháp phát hiện kháng thể kháng vi rút huyết thanh bệnh nhân. Có 3 phương pháp cơ bản được sử dụng là phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI), thử nghiệm hấp phụ liên kết enzyme (ELISA) và phản ứng trung hòa vi lượng (MN). Kết quả được xác định dựa vào việc phát hiện kháng thể
25
kháng đặc hiệu vi rút cúm (ELISA, MN) hoặc sự biến động kháng thể (tăng gấp 4 lần) giữa 2 mẫu huyết thanh (HI). Chẩn đoán huyết thanh học chỉ có ý nghĩa hồi cứu và có tác dụng rất hạn chế đối với các trường hợp lâm sàng. Tuy nhiên, nó cũng là cơ sở cho việc chẩn đoán nếu như việc phát hiện kháng nguyên hoặc vật liệu di truyền của vi rút không đạt kết quả do chất lượng bệnh phẩm hoặc một lý do nào khác.
1.5.3.1 Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination Inhibition test-HI)
Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) được Hirst GK phát hiện năm 1942 [39]. Nguyên lý của phương pháp là phát hiện kháng thể kháng HA đặc hiệu vi rút cúm (antihemagglutinin) khi kết hợp với kháng nguyên chuẩn (A/H1N1, A/H3N2, A/H1N1/09 đại dịch, A/H5N1, B…) có khả năng ức chế ngưng kết hồng cầu. Hồng cầu chuột lang 0,75% hoặc hồng cầu gà 0,5% được sử dụng trong phản ứng HI để phát hiện kháng thể kháng vi rút cúm mùa, hồng cầu ngựa 1% được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng vi rút cúm A/H5N1 [21].
- Phản ứng HI tương đối đơn giản, kinh tế, có thể áp dụng để phát hiện sự lưu hành của kháng thể kháng đặc hiệu vi rút cúm với một số lượng mẫu lớn. Phần lớn kháng thể kháng HA đều được phát hiện bằng phương pháp HI, vì vậy đây là phản ứng đặc hiệu phân típ đối với chẩn đoán huyết thanh học cúm. Tuy nhiên, phản ứng HI chỉ có giá trị trong chẩn đoán cúm khi có mẫu huyết thanh kép để xác định được sự biến động kháng thể (tăng gấp 4 lần) giữa 2 mẫu huyết thanh. Mẫu huyết thanh đơn không có giá trị trong chẩn đoán. Mặt khác, theo những nghiên cứu gần đây cho thấy phản ứng HI có độ nhạy thấp hơn so với phản ứng trung hòa vi lượng [77].
1.5.3.2 Phản ứng trung hòa vi lượng (Microneutralization test – MN)
Phản ứng trung hòa vi lượng-ELISA được Hormon và cs. phát triển năm 1988 [33, 77]. Nguyên lý của phản ứng là sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu nucloprotein (NP) để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên NP trong tế bào nhiễm vi rút cúm. Sử dụng phương pháp Reed và Muench để tính giá trị liều gây nghiễm 50% trên tế bào (TCID50).
26
Phản ứng trung hòa vi lượng là một phản ứng nhạy và đặc hiệu, có khả năng phát hiện kháng thể kháng đặc hiệu vi rút cúm A/H5N1 và kháng thể kháng các phân típ vi rút cúm gia cầm khác mà phản ứng HI không có khả năng phát hiện được [77]. Phản ứng này dễ tiến hành vì không cần kháng nguyên tinh khiết. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là thí nghiệm phức tạp, thời gian tiến hành thí nghiệm kéo dài (2 ngày) và phải làm việc trực tiếp với vi rút sống, đặc biệt là vi rút cúm A/H5N1, nên thí nghiệm phải tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3.
Tuy nhiên, chẩn đoán huyết thanh học ít sử dụng trong chẩn đoán bệnh VĐHHC, thường được sử dụng để nghiên cứu hồi cứu hoặc giám sát huyết thanh học.
1.6. Cơ sở lý luận để thiết kế và tiến hành nghiên cứu.
Bệnh VĐHHC do căn nguyên vi rút là một trong 10 bệnh truyền nhiễm thường xuyên gây dịch tại Việt nam với tỷ lệ mắc và tử vong cao. [4,5,9] Trong giai đoạn 2003-2012, một số dịch VĐHHC đã được ghi nhận : SARS, cúm gia cầm A/H5N1, cúm đại dịch A/H1N1pdm/09… các vụ dịch này không những gây ảnh hưởng cho sức khoẻ cộng đồng mà còn ảnh hưởng lớn đến kinh tế và xã hội.
Các nghiên cứu đã được triển khai trong những năm qua taị Việt Nam đã cho phép có những thông tin cơ bản nhất về sự lưu hành, mức độ nguy hiểm, tính nổi trội của một số tác nhân virút gây bệnh.[4] Sự nguy hiểm, khả năng lây truyền dễ và nguy cơ tiềm tàng của bùng phát dịch của các vi rút gây VĐHHC trong cộng đồng yêu cầu phải có sự chủ động giám sát vi rút học tại các bệnh viện cũng như trong cộng đồng. Chương trình giám sát cúm Quốc gia đã được triển khai từ năm 2006, một số nghiên cứu khác cũng tập trung tại các cộng đồng cụ thể (Hà nam, Khánh hoà)….
Bệnh viện đa khoa Việt-Tiệp, Hải phòng là bệnh viện loại 4, tuyến y tế cuối cùng chăm sóc sức khoẻ cho nhân dân thành phố Hải phòng và các tỉnh lân cận thuộc khu vực Đông Bắc bộ: Quảng Ninh, Hải Dương, Thái Bình.., đây là một điểm giám sát phù hợp cho các nghiên cứu liên quan đên kiểu hình khí hậu.
27
Để tiếp nối các nghiên cứu đã tiến hành trong giai đoạn trước, đồng thời phát triển các giám sát chủ động trong bệnh viện các vi rút gây VĐHHC, chúng tôi tiến hành xây dựng nghiên cứu “Tìm hiểu các căn nguyên vi rút gây viêm đường hô hấp cấp của một số bệnh nhân điều trị ở bệnh viện đa khoa Việt Tiệp - Hải Phòng 2010-2012”
28
CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. 1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1 Định nghĩa ca bệnh
Các bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp nghi do vi rút có triệu chứng như sau:
- Bệnh khởi phát trong vòng 7 ngày
- Sốt cao đột ngột trên 38oC (xác định bằng cách đo nhiệt độ hoặc qua khai thác bệnh sử).
- Có ho và/hoặc khó thở.
- Và có ít nhất 1 trong những triệu chứng sau: Thở nhanh; tổn thương trên X quang phổi; phải hỗ trợ hô hấp.
2.1.2 Cỡ mẫu
170 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp của bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp nghi do vi rút thu thập tại điểm giám sát bệnh viện đa khoa Việt - Tiệp trong giai đoạn tháng 09/2010 đến tháng 4/2012 (bảng 2.1)
Bảng 2.1. Số bệnh nhân VĐHHC tại bệnh viện Việt Tiệp - Hải Phòng
Năm Bệnh nhân 2010 53 2011 73 2012 44 Tổng số 170 2.2 VẬT LIỆU 2.2.1 Mẫu bệnh phẩm
29
Mẫu bệnh phẩm được lấy ở những bệnh nhân nghi nhiễm virút từ 1-5 ngày kể từ ngày khởi bệnh.
2.2.1.2 Loại bệnh phẩm
Bệnh phẩm để xác định vi rút: Dịch ngoáy họng. Trong trường hợp không lấy được dịch họng có thể lấy dịch mũi, dịch nội khí quản được bảo quản trong môi trường vận chuyển vi rút.
2.2.1.3 Môi trường vận chuyển
Môi trường vận chuyển được chuẩn bị tại phòng thí nghiệm cúm – viện VSDT TƯ, sau đó chuyển đến trung tâm y tế dự phòng Hải Phòng.
Bảo quản môi trường vận chuyển ở 4o
C. Thời hạn sử dụng môi trường: 03 tháng
2.2.1.4 Kỹ thuật lấy mẫu bệnh phẩm
Dịch ngoáy họng: Đưa tăm bông vào vùng hầu họng, để cho thấm ướt toàn bộ đầu tăm bông, sau đó miết mạnh và quay tròn tăm bông tại khu vực 2 amidan và thành sau họng 3 đến 4 lần (để lấy được dịch, tế bào vùng họng). Đưa ngay tăm bông vào tube nhựa đã có sẵn 2-3ml môi trường bảo quản virút.
30
Dịch mũi: Dùng 1 tăm bông thu thập bệnh phẩm trong cả 2 mũi. Đầu tăm bông sau khi thu thập bệnh phẩm chuyển vào tube chứa 2-3 ml môi trường vận chuyển, bỏ bớt đầu thừa của tăm bông.
Hình 2.2. Thu thập mẫu bệnh phẩm dịch mũi
Dịch nội khí quản: Bệnh nhân khi đang thở máy, đã được đặt nội khí quản. Dùng 1 ống hút dịch, đặt theo đường nội khí quản và dùng bơm tiêm hút dịch nội khí quản theo đường ống ta đã đặt.Cho dịch nội khí quản vào tube chứa môi trường bảo quản virút.
2.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ
31
Bảng 2.2. Bảng mô tả trang thiết bị
Trang thiết bị Hãng
Phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2 Viện VSDTTƯ Buồng cấy an toàn sinh học (Biosafety
Cabinet) – Class 2
Bioquell - Anh
Tủ lạnh: 40
C,-200C và -800C Sanyo – Nhật
Máy ly tâm Effendorf
Máy luân nhiệt PCR Biorad
Luminex LX 100/200 System Luminex
Máy sonicator Cole - Palmer
Vortex IKA – Malaysia
Máy soi gel tia UV hãng Gel XL Gel Mate
Máy chạy điện di nằm Advance
Cân điện tử Sartorius
Lò vi sóng 850-1300 W Samsung
Máy chụp gel và phim UVP
Tủ ấm 33o
C, 37oC Sanyo
Kính hiển vi lộn ngược Olympus
2.2.4.2 Dụng cụ
* Dụng cụ lấy mẫu:
- Que ngoáy họng và tỵ hầu.
- Ống chứa môi trường vận chuyển vi rút.
* Trang bị phòng hộ cá nhân: quần áo chống dịch mặc một lần, khẩu trang. * Dụng cụ thí nghiệm:
- Pipet tự động vi lượng các loại: 0,5µl – 1000 µl
32
- Típ ly tâm: 1,5 ml – 2ml.
- Khay chạy điện di 100-250 ml và răng lược, 15-20 răng, dày 1mm. - Cốc đong 100-300 ml.
- Đĩa microtitre hoặc giấy parafilm. - Pipet đa kênh, pipet có lọc.
- Các vật liệu cần thiết khác như: Găng dùng 01 lần, giấy thấm, găng vải chống nhiệt...
2.2.3. Sinh phẩm
33
Bảng 2.3. Hệ thống mồi sử dụng để phát hiện vật liệu di truyền vi rút bằng phương pháp RT - PCR Họ Vi rút Tên mồi Trình tự (5‟-3‟) Sản phẩm khuếch đại (bp) Nguồn gốc O rt hom y xov ir ida e
Cúm A M30F2/08 ATG AGY CTT YTA ACC GAG GTC GAA ACG
232 NIID
M264R3/08 TGG ACA AAN CGT CTA CGC TGC AG H1 H1 HA F AGG CAA ATG GAA ATC TAA TAG CGC
164 CDC, Mỹ H1 HA R CCA TTG GTG CAT TTG AGG TGA TG
H3 H3 HA F AAG CAT TCC YAA TGA CAA ACC
120 CDC, Mỹ H3 HA R ATT GCR CCR AAT ATG CCT CTA GT
H5 H5-1 GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC
219
WHO, Hồng Kông H5-3 CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG
H1pdm swH1 Conv-F1 TGC ATT TGG GTA AAT GTA ACA TTG
349 NIID
swH1 Conv-R1 AAT GTA GGA TTT RCT GAK CTT TGG B Flu B F TCC TCA ACT CAC TCT TCGAGC G
120 CDC, Mỹ Flu B R CGG TGC TCT TGA CCA AAT TGG
P ar am yx ov ir ida e
RSV RSV-AB-F1-FAM AAC AGT TTA ACA TTA CCA AGT GA
368 CDC, Mỹ RSV-AB-R1 TCA TTG ACT TGA GAT ATT GAT GC
hMPV hMPVF-F1-FAM GAG CAA ATT GAA AAT CCC AGA CA
347 CDC, Mỹ hMPFV-R1 GAA AAC TGC CGC ACA ACA TTT AG
HIPV1 PIV1- forward CCG GTA ATT TCT CAT ACC TAT G
317 [22]
PIV1- reverse CCT TGG AGC GGA GTT GTT AAG HIPV2 PIV2- forward CCA TTT ACC TAA GTG ATG GAA T
203 [22]
PIV2- reverse GCC CTG TTG TAT TTG GAA GAG T HIPV3 PIV3- forward ACT CCC AAA GTT GAT GAA AGA T
102 [22]
PIV3- reverse TTA ATC TTG TTG TTG AGA TTG A
P ic or nav ir ida e Họ Picorna
PICO-F3-FAM GGC CCC TGA ATG (CT)G GCT AA
115 [52]
PICO-R3 GAA ACA CGG ACA CCC AAA GTA Rhino OL24 CTA CTT TGG GTG TCC G
530
Niigata, Nhật
Bản OL 68-1 GGT AAY TTC CAC CAC CAN CC
Entero EVP4 CTA CTT TGG GTG TCC GTG TT
650
Niigata, Nhật
Bản OL68 GGG AAC TTC CAG TAC CAY CC
Corona viri
d
a
e SARS- Cov
Cor-p-F2 CTA ACA TGC TTA GGA TAA TGG
368 CDC, Mỹ Cor-p-R1 CAG GTA AGC GTA AAA CTC ATC
- Bộ sinh phẩm tách chiết vật liệu di truyền của vi rút - ARN sử dụng bộ kít QIAamp viral RNA Mini, 250 preps, Cat No 52904, Quiagen.
34
- Bộ sinh phẩm dùng cho phản ứng RT-PCR: QIAGEN Onestep RT-PCR kit, Cat. No 210212
- RNase inhibitor (40U/) – Invitrogen
- Ethanol (96-100%) (1.00983.1000 hãng Merck) - Agarose - 1xTBE buffer - 100bp marker - Loading dye - Ethidium bromide Các chủng vi rút, mẫu chứng:
- Chứng dƣơng: ARN virus cúm mùa (H1N1, H3N2 and B), virút cúm A/H5N1 và virút A/H1N1pdm/09 đại dịch và các vi rút đường hô hấp khác.
- Chứng âm: sử dụng khuôn mẫu là nước cất tinh khiết (No Template Control - NTC)
- Chứng âm tách chiết: khuôn mẫu được tách chiết cùng với bệnh phẩm, sử dụng môi trường vận chuyển sạch làm mẫu tách chiết (Negative Extraction Control - NEC)
2.2.3.2 Sinh phẩm cho phản ứng Luminex/xTAG
Sinh phẩm Cat. No