Phân lập

2.3.4.1 Nguyên lý

Virút cúm có thể phân lập trên dòng tế bào MDCK, các vi rút hô hấp khác có thể sử dụng dòng tế bào Hep2, LL - CMK2…

Quan sát sự có mặt của vi rút trong tế bào dựa trên sự thay đổi hình dạng tế bào (sự huỷ hoại tế bào - CPE) hoặc phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) đối với vi rút cúm, định týp vi rút bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HAI)

2.3.4.2 Phân lập vi rút trên tế bào

Tất cả các bước đều phải được tiến hành trong tủ an toàn sinh học cấp độ II. - Kiểm tra tế bào trên kính hiển vi lộn ngược ở độ phóng đại 40x

- Rửa tế bào

+ Đối với vi rút cúm: 2 lần với PBS (-) và 1 lần với D-MEM chứa 2g/ml trypsin TPCK.

+ Đối với vi rút hô hấp khác: 2 lần với PBS (-) và 1 lần với D-MEM - Cấy 250  l bệnh phẩm vào týp tế bào.

- Ủ 60 phút trong tủ ấm 33oC. - Thêm 2 ml môi trường

+ Đối với vi rút cúm: 2 ml D-MEM 2% Bovine serum albumine chứa 2g/ml trypsin TPCK

46

+ Đối với vi rút khác: 2 ml D-MEM 2% Fetal bovine serum - Quan sát hủy hoại tế bào (CPE) hàng ngày dưới kính hiển vi.

- Thu hoạch hỗn dịch nuôi cấy vi rút khi chai nuôi cấy xuất hiện huỷ hoại từ 70-90 %. Thu hoạch hỗn dịch nuôi cấy vi rút vào ngày thứ 6 hoặc 7 nếu không xuất hiện huỷ hoại.

Đối với vi rút á cúm 1, hMPV, họ vi rút picorna… xuất hiện CPE, tiến hành tách chiết ARN, chạy RT-PCR kiểm tra

Đối với vi rút cúm, xuất hiện CPE tiến hành thử nghiệm ngưng kết hồng cầu (HA)

Các bước tiến hành:

- Cho 50 ul đệm PBS vào các giếng từ B1 đến H11 và cột 12 của phiến 96 giếng (cột 12 dùng để làm chứng hồng cầu)

- Nhỏ 100 ul mỗi mẫu vào giếng từ A1 đến A11. Pha loãng bậc 2 dịch nuôi cấy vi rút bằng cách chuyển 50 ul từ hàng A sang hàng B, từ háng B sang hàng C, … cứ như vậy cho đến hàng H, loại bỏ 50 ul ở hàng H.

- Cho 50 ul hồng cầu gà 0,5% vào mỗi giếng của phiến 96 giếng. Lắc nhẹ phiến, để 30 phút ở nhiệt độ phòng.

- Nhận định kết quả: kết quả phản ứng HA được đọc sau khi nhỏ hồng cầu 30 phút, khi đó hồng cầu sẽ lắng xuống ở cột chứng hồng cầu. Hiệu giá vi rút độ pha loãng cuối cùng của vi rút mà tại đó gây ngưng kết hồng cầu hoàn toàn.

+ HA (+): cấy chuyển sang chai nuôi cấy 25 cm2

+ HA (-): cấy chuyển tiếp 2-3 lần - Định týp phân lập

+ Hiệu giá HA > 1/8, có thể định týp bằng phản ứng HAI - Bảo quản chủng ở -80oC

47

2.3.4.3 Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu HAI

Chủng vi rút cúm, các kháng nguyên chuẩn A/H1N1 đại dịch, H3N2, B trước khi thực hiện phản ứng HAI phải được chuẩn độ hiệu giá HA bằng 8 đơn vị, sử dụng kit HI của WHO cung cấp (Phụ lục 1).