Trong tổng số 24 mẫu dương tính được phát hiện trong nghiên cứu bằng phương pháp RT-PCR thông thường và 23 mẫu dương tính được phát hiện bằng phương pháp Luminex/xTAG RVP, các tác nhân vi rút cụ thể được xác định như sau:
58 Bảng 3.7. Tác nhân vi rút gây VĐHHC Tác nhân vi rút RT-PCR Luminex/xTAG RVP Số mẫu dương tính (n) Tỷ lệ (%) Số mẫu dương tính (n) Tỷ lệ (%) A/H1N1pdm/09 4 16,7 4 17,3 Vi rút cúm B 6 25,0 1 4,3 hMPV 1 4,1 1 4,3 Vi rút á cúm típ 1 3 12,5 3 13,0 Họ picorna 10 41,2 12 52,5 Vi rút Corona 229E 0 0 1 4,3 Vi rút Corona OC43 0 0 1 4,3 Tổng số 24 100 23 100 Hình 3.4. Tác nhân vi rút dương tính
59
Kết quả trên cho thấy, có 7 vi rút được xác định là căn nguyên của VĐHHC trong tổng số 170 mẫu thu thập tại bệnh viện đa khoa Việt Tiệp, Hải phòng trong giai đoạn 10/2010 đến 4/2012. Các vi rút đó được xác định là vi rút cúm A/H1N1pdm/09, vi rút cúm B, vi rút hMPV, vi rút á cúm típ 1, vi rút họ picorna, vi rút Corona 299E và vi rút Corona OC43. Trong tổng số 7 vi rút nói trên vi rút Corona 299E và vi rút Corona OC43 chỉ có thể phát hiện bằng phương pháp Luminex/xTAG RVP. Tuy rằng cả 2 phương pháp RT-PCR và Luminex/xTAG RVP đều cho phép phát hiện phần lớn các tác nhân vi rút được thiết kế trong nghiên cứu, tuy nhiên sự chênh lệch về số dương tính thực của vi rút cúm B và vi rút họ picorna cũng được xác định, số mẫu dương tính với vi rút cúm B là 6 khi sử dụng phương pháp RT-PCR thông thường, trong khi chỉ phát hiện được 1 mẫu dương tính với vi rút cúm B bằng phương pháp Luminex/xTAG RVP. Số mẫu dương tính với vi rút cúm B (6 mẫu) đều được phát hiện vào tháng 2-4/2011 là thời điểm vi rút cúm B đang hoạt động mạnh tại miền Bắc, Việt Nam ( nguồn GSC quốc gia, chưa công bố) vì vậy kết quả trên của phương pháp RT-PCR có độ tin cây. Sự khác biệt rõ rệt kết quả của RT-PCR thông thường và Luminex/xTAG RVP có thể giải thích do độ nhạy thấp của Luminex/xTAG RVP với tác nhân là vi rút cúm B, khi một phương pháp có khả năng phát hiện trong cùng 1 phản ứng 23 tác nhân vi rút khác nhau, thì độ nhạy không đồng đều giữa các tác nhân riêng biệt là có thể, vì vậy muốn khẳng định một kết quả chẩn đoán trong PTN, việc thực hiện chẩn đoán bẳng 2 phương pháp khác nhau là rất cần thiết, đặc biệt với các tác nhân vi rút đặc biệt như cúm A/H5N1, SARS-CoV.
Tổng hợp kết quả phát hiện tác nhân vi rút gây VĐHHC bằng 2 phương pháp RT-PCR thông thường và Luminex/xTAG RVP, dựa theo tiêu chí nhận định kết quả và so sánh với kết quả thu thập từ hệ thống giám sát cúm quốc gia, chúng tôi có kết luận về kết quả của nghiên cứu này như sau:
60
Bảng 3.8. Kết quả phát hiện mẫu dương tính
Tác nhân vi rút RT-PCR Số mẫu dương tính (n) Tỷ lệ (%) A/H1N1pdm/09 4 15,3 Vi rút cúm B 6 23,1 hMPV 1 3,8 Vi rút á cúm típ 1 3 11,5 Vi rút họ Picorna 10 38,4 Vi rút Corona 229 1 3,8 Vi rút Corona OC43 1 3,8 Tổng số 26 100
Hình 3.5. Tỷ lệ % các căn nguyên vi rút gây VĐHHC
Bảng 3.8 cho thấy vi rút họ picorna được phát hiện trong 10 mẫu bệnh phẩm chiếm tỷ lệ 38,4%, vi rút cúm B được xác định là 23,1%, vi rút cúm 15.30% 23.10% 3.80% 11.50% 38.40% 3.80% 3.80% A/H1N1pdm/09 Vi rút cúm B hMPV Vi rút á cúm típ 1 Picorna Vi rút Corona 229 Vi rút Corona OC43
61
A/H1N1pdm/09 có tỷ lệ 15,3%, vi rút á cúm típ 1 đạt tỷ lệ 11,5%, các vi rút khác (hMPV, CoV-229E, CoV-OC43) đều có tỷ lệ 3,8% trong tổng số mẫu được xác định dương tính.
3.2.4 Phân tích sự lƣu hành của các tác nhân vi rút theo tháng
Việc xác định sự lưu hành theo thời gian là hết sức cần thiết trong quá trình phân tích kết quả các vi rút gây VĐHHC, kết quả thu được từ phương pháp RT- PCR và luminex/xTAG chúng tôi tiến hành phân tích theo tháng để xác định mùa lưu hành của các vi rút gây bệnh VĐHHC. Kết quả phân tích cho thấy
Bảng 3.9. Kết quả xét nghiệm theo tháng
H1pdm B hMPV Para 1 Picorna Corona
229E
Corona OC43
Orthomyxoviridae Paramyxoviridae Picornaviridae Coronaviridae
Tháng 1 1 1 1 1 Tháng 2 2 3 Tháng 3 1 1 1 1 3 Tháng 4 2 Tháng 9 1 Tháng 10 1 1 Tháng 11 4 Tháng 12 1 Tổng 4 6 1 3 10 1 1
62
Hình 3.6. Mẫu dương tính các tác nhân theo tháng
Bệnh phẩm thu thập trong nghiên cứu từ tháng 10/2010 đến tháng 4/2012, tuy nhiên trong 8 tháng liên tục (từ tháng 9 đến tháng 4 năm sau) có số lượng bệnh phẩm tập trung nhiều ( bảng 3.1) Kết quả trên dương tính của từng tác nhân vi rút theo tháng (bảng 3.9) cho thấy vi rút cúm A/H1N1pdm/09 đại dịch và cúm B xác định chủ yếu vào các tháng 2, 3, 4 trong năm vi rút họ picorna lưu hành hầu hết trong các tháng thu thập, và đạt cao điểm tại tháng 3,11. Kết quả trên phù hợp kết quả của chương trình giám sát cúm quốc gia trong giai đoạn 2010-2012, vi rút cúm A/H1N1pdm/09 lưu hành vào tháng 1-4/2011 và vi rút cúm B lưu hành mạnh vào tháng 2-4/2011 và tháng 2, 3 năm 2012. Tương tự, theo nghiên cứu của Buchy vi rút Rhino/Picorna cũng lưu hành quanh năm tại Lào và hoạt động mạnh vào các tháng 1, 5 ,9 và 11 [16 ]. 0 1 2 3 4 5 Tháng 1 Tháng 2 Tháng 3 Tháng 4 Tháng 9 Tháng 10 Tháng 11 Tháng 12 H1pdm B hMPV Para 1 Pico Coronavirus 229E Coronavirus OC43
63
Bảng 3.10. Mẫu dương tính trên mẫu bệnh phẩm thu thập theo tháng
Sự đồng lưu hành của nhiều vi rút gây VĐHHC cũng được xác định vào tháng 1 và tháng 3 trong năm 2011, 2012, các tác nhân vi rút lưu hành trong cùng thời điểm được xác định: hMPV, á cúm 1, corona 229E, OC43, họ vi rút picorna, cúm. Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Ngô Hương Giang và một số nghiên cứu khác tại Việt nam trong giai đoạn 2007-2009 cho thấy sự đồng lưu hành của các vi rút gây VĐHHC cũng tập trung vào các tháng 1,2,4,5 là các tháng giao mùa giữa mùa xuân và mùa hè [4]. Sự đồng lưu hành nhiều vi rút gây bệnh trong cùng thời điểm là nguyên nhân tăng số bệnh nhân VĐHHC và phù hợp với kết quả phân bố mẫu theo tháng của nghiên cứu này.
3.2.5 Sự liên quan giữa tác nhân lây nhiễm và các lứa tuổi
Theo thống kê dịch tễ học, hầu hết các bệnh nhiễm vi rút VĐHHC đều có tính chất theo mùa và sự cảm nhiễm của mỗi lứa tuổi cũng khác nhau. Nghiên cứu của chúng tôi phân tích sự liên quan về lứa tuổi với các tác nhân vi rút gây VĐHHC nhằm xác định tính cảm nhiễm, khả năng lây truyền của các vi rút này trong cộng đồng. 20 16 34 17 7 11 34 31 4 5 7 2 1 2 4 1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Tháng 1 Tháng 2 Tháng 3 Tháng 4 Tháng 9 Tháng 10 Tháng 11 Tháng 12 Mẫu bp Dương tính
64
Dựa vào kết quả phân bố theo độ tuổi các mầu thu thập trong nghiên cứu, kết quả về sự liên quan giữa độ tuổi và các tác nhân vi rút gây bệnh được trình bày tại bảng
Bảng 3.11. Phân bố các tác nhân vi rút theo nhóm tuổi Nhóm
tuổi
Số mẫu thu thập (n)
Số mẫu dương tính theo các tác nhân . A/H1N1 pdm/09 B hMPV Á cúm típ 1 Họ Picorna CoV- 229E CoV- OC43
Orthomyxoviridae Paramyxoviridae Picorna viridae Coronaviridae 6-18 7 0 0 1 0 1 0 0 19-60 86 2 3 0 1 7 0 1 >60 77 2 3 0 2 2 1 0 Tổng 170 4 6 1 3 10 1 1
Kết quả trên cho thấy mọi nhóm tuổi đều có thể cảm nhiễm với vi rút họ Picorna, trong khi vi rút cúm A/H1N1pdm/09 và vi rút cúm B chỉ phát hiện tại các nhóm tuổi trưởng thành ( > 18 tuổi), và các vi rút hMPV, CoV-299E hoặc CoV- OC43 chỉ phát hiện 1 trường hợp trong nghiên cứu nên khó có thể xác định được tuổi cảm nhiễm của các vi rút này. Sự cảm nhiễm cao với vi rút họ Picorna của mọi nhóm tuổi cũng như sự lưu hành thường xuyên của họ vi rút này cho phép nghĩ đến môi trường sống, điều kiện sinh hoạt, kinh tế ... là những nguyên nhân gây nên hiệu ứng cảm nhiễm này. Các nghiên cứu của các tác giả khác về các vi rút họ Picorna ( vi rút Rhino, Entero) cũng cho kết quả tương tự.[70]
65
3.3 PHÂN LẬP
Trong nghiên cứu này toàn bộ mẫu dương tính khi sử dụng phương pháp RT - PCR tiếp tục được phân lập trên các dòng tế bào thường trực cảm nhiễm: vi rút cúm A/H1N1pdm/09 và vi rút cúm B (10 mẫu) được sử dụng tế bào MDCK, vi rút Para 1 sử dụng tế bào Hep 2 (human epidermoid cancer), hMPV, vi rút họ Picorna sử dụng dòng tế bào LLC- MK2 (Rhesus Monkey Kidney Cells). Kết quả phân lập cụ thể như sau:
Bảng 3.12. Kết quả phân lập các tác nhân vi rút
Mẫu dƣơng tính Mẫu phân lập Tỷ lệ phân lập (%) A/H1N1pdm/09 4 2 50,0 B 6 2 33,3 Para 1 3 1 33,3 hMPV 1 1 100,0 Picorna 10 1 10,0 Tổng 24 7 29,1
Tổng số mẫu phân lập thành công là 7/24 mẫu chiếm tỷ lệ 29,1%, tỷ lệ này dao động theo các tác nhân nghiên cứu. Kết quả trên cho thấy, vi rút họ Picorna dễ dàng phát hiện bằng phương pháp RT-PCR tuy nhiên hồi phục vi rút trên dòng tế bào cảm nhiễm còn hạn chế (đạt 10%), trong khi các vi rút khác có thể đạt tỷ lệ phân lập cao như hMPV (100%) hoặc cúm A/H1N1pdm/09 (50%). Kết quả này cũng tương tự với một số kết quả được nghiên cứu trước đó[52,56], trong những nghiên cứu trước tỷ lệ phân lập vi rút cúm luôn ở mức cao hơn so với các tác nhân vi rút khác.
66
3.4 XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC CỦA VI RÚT CÚM 3.4.1. Đặc tính kháng nguyên 3.4.1. Đặc tính kháng nguyên
Bảng 3.13: Kết quả phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HAI)
Tên chủng virút
Hiệu giá HAI của vi rút phân lập với các kháng huyết thanh chuẩn.
Kết luận A/H3N2 B/Brisban e B/Wisconsi n A/H1N1pd m/09 HP-SARI 20154 (B) 10 320 20 10 (B/ Brisbane /60/2008) - Victoria lineage HP-SARI 20201 (B) 10 320 10 10 (B/ Brisbane /60/2008) - Victoria lineage HP-SARI 20216 (A/H1N1pdm/09) 10 <10 10 640 A (H1N1) pdm09 HP-SARI 2095 (A/H1N1pdm/09) <10 <10 10 >640 A (H1N1) pdm09 A/H3 (Kháng nguyên chuẩn) >=1280 10 20 1/40 B/Victoria (Kháng nguyên chuẩn) <10 320 20 <10 B/Yamagata (Kháng nguyên chuẩn) <10 <10 160 <10 A/H1pdm (Kháng nguyên chuẩn) <10 <10 <10 >=1280
Kết quả cho thấy các chủng vi rút cúm phân lập trong nghiên cứu: HP-SARI 20216, HP-SARI 2095 được xác định là cúm A/H1N1pdm/09 bằng phương pháp RT-PCR có phản ứng tốt với kháng huyết thanh chuẩn A/H1N1pdm/09 và đạt hiệu giá HI tương ứng >=1/640, kết quả trên tương đương với hiệu giá ngăn ngưng kết hồng câù (HAI) của vi rút chứng A/California/07/09 (H1N1) là 1/1280 , Tương tự, kết quả phản ứng HAI của 2 chủng vi rút cúm B trong nghiên cứu (HP-SARI 20201, HP-SARI 20154) đều có hiệu giá là 1/320 HAI khi phản ứng với kháng huyết thanh B/ Brisbane/2009, tương đương với hiệu giá HAI của vi rút cúm B chuẩn thuộc dòng B/Victoria. Kết quả của giám sát cúm quốc gia
67
giai đoạn 2006-2012 cho thấy, vi rút cúm B lưu hành tại Việt nam đồng thời có đặc tính kháng nguyên của cả 2 dòng Victoria và Yamagata, tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi chỉ phát hiện vi rút cúm B mang đặc tính KN giống dòng Victoria, tương tự vi rút cúm B lưu hành tại Australia năm 2009 và là vi rút dự tuyển cho vắc xin cúm mùa 2010 - 2011 và 2011 - 2012 tại khu vực Bắc bán cầu (B/ Brisbane /60/2008 ) [69]. Kết quả phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu HAI cho phép kết luận vi rút cúm A/H1N1pdm/09 xác định trong nghiên cứu có đặc tính kháng nguyên tương tự vi rút cúm dự tuyển vắc xin A/ California/07/09 (H1N1) cho cả 2 khu vực địa lý Bắc bán cầu và Nam bán cầu trong giai đoạn 2009-2012. Tương tự,vi rút cúm B xác định trong nghiên cứu có đặc tính kháng nguyên tương tự vi rút cúm B dòng Victoria- đại diện là vi rút dự tuyển vắc xin năm 2010-2011 và 2011-2012 cho khu vực Bắc bán cầu (B/ Brisbane /60/2008 )
3.4.2. Xác định đặc điểm di truyền vi rút cúm
Vật liệu di truyền của virút cúm luôn thay đổi thích nghi với hệ thống miễn dịch của tế bào vật chủ. Những nghiên cứu về đặc điểm di truyền học luôn đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện các chủng virút cúm mới, có khả năng tiềm tàng gây dịch trên diện rộng. Tổng số 4 chủng vi rút cúm phân lập trong nghiên cứu được tiến hành giải trình tự phân đoạn gen HA nhằm phân tích đặc điểm di truyền liên quan đến sự tiến hóa của các chủng virút này. Trong nghiên cứu này trình tự nucleotide của virút cúm A/California/7/2009 (H1N1) và vi rút cúm B/Brisbane/60/2008 , cùng với một số trình tự của các chủng vi rút cúm tương tự lưu hành tại Việt Nam và các chủng trên thế giới trong các năm gần đây được sử dụng như thông số tham chiếu. Các trình tự nucleotide của các vi rút tham chiếu được thu thập về từ GenBank.
Cây gia hệ gen HA của virút cúm được xây dựng bằng phần mềm MEGA 4 trên cơ sở phương pháp ước tính khả năng chênh lệch tối đa (maximum likelihood) thông qua mô hình NJ (Neighbor-Joining). Các virút A/California/7/2009 (H1N1) và B/Brisbane/60/2008 làm gốc của cây gia hệ.
68
69
Kết quả cây gia hệ HA của chủng cúm A/H1N1 đại dịch cho thấy, virút cúm A/H1N1 đại dịch có thể tách thành 2 nhóm (nhóm I và nhóm II), nhóm II được chia ra thành 4 phân nhóm phụ (phân nhóm IIa, IIb, IIc, IId), trong đó chủng HP-SARI 2095 thuộc phân nhóm IIa và chủng HP-SARI 20216 thuộc phân nhóm IIb. Khi so sánh trình tự gen HA của chủng vắc xin với trình tự HA đã được giải trình tự của 2 chủng cúm H1N1 đại dịch chúng tôi thấy cả 2 chủng có độ tương đồng di truyền cao đạt 99%.
So sánh vớí vi rút dự tuyển vắc xin A/California/07/2009 (H1N1), vi rút cúm A/H1N1pdm/09 thu thập được trong nghiên cứu có số nucleotide sai khác được xác định là 12 nucleotide (bảng 3.14), tuy nhiên không có sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên (hình 3.7) có thể hiểu rằng sự khác biệt của nucleotide không ảnh hưởng đến cấu trúc protein HA, vì vậy đặc tính kháng nguyên không có sự khác biệt đáng kể.
Bảng 3.14: Sự sai khác nucleotide trong phân đoạn gen HA của vi rút A/H1N1pdm/2009 .
Vi rút dự tuyển vắc xin Vi rút Sự sai khác số nucleotide A/California/07/2009 (1636 bp) HP-SARI 20216 (1636 bp) 12 HP-SARI 2095 (1636 bp) 12
70
71
Kết quả cây gia hệ HA của chủng cúm B cho thấy, virút cúm B phân lập HP- SARI 20154 và HP-SARI 20201 đều thuộc dòng B/Victoria và nhóm vào cùng vi rút cúm dự tuyển vắc xin B/Brisbane/60/2008 và một số vi rút cúm B lưu hành tại Honkong, Trung quốc, Hàn quốc… năm 2009-2010.
Tương tự số nucleotide khác biệt của vi rút cúm B phân lập trong nghiên cứu với vỉrut dự tuyển vắc xin B/Brisbane/60/2008 được xác định là 2 nucleotid (HP- SARI 20201) và 12 nucleotide (HP-SARI 20154), sự khác biệt này cũng được khẳng định trên hình ảnh cây gia hệ khi HP-SARI 20154 có khoảng cách xa hơn vỉrut dự tuyển vắc xin B/Brisbane/60/2008 .
Bảng 3.15. Sự sai khác nucleotide trong phân đoạn gen HA của vi rút cúm B
Vi rút dự tuyển vắc xin Vi rút Sự sai khác số nucleotide B/Brisbane/60/2008 (1710 bp) HP-SARI 20154 (1105 bp) 12 HP-SARI 20201 (1110 bp) 2
3.5 HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN VĐHHC
Để đảm bảo chất lượng kết quả xét nghiệm đồng thời đáp ứng được yêu cầu chẩn đoán sớm căn nguyên tại phòng thí nghiệm, dựa trên kết quả đã thu được từ phương pháp RT-PCR thông dụng và Luminex/xTAG chúng tôi đề xuất quy trình chẩn đoán sớm căn nguyên vi rút gây VĐHHC tại PTN như sau:
72
Mẫu bệnh phẩm
Tách chiết ARN
Tác nhân vi rút cúm A/B
Âm tính Dương tính B Dương tính A
Vi rút họ Picorna H1N1pdm, H3N2, H1N1. H5N1
Âm tính Dương tính Âm tính D/tính
RSV, hMPV, P1, P2, P3 Vi rút entero, Rhino
Cov-229E, Cov-OC43
Âm tính D/tính Âm tính Dương tính
Hình 3.9. Quy trình chuẩn đoán vi rút gây VĐHHC