Bệnh VĐHHC do căn nguyên vi rút là một trong 10 bệnh truyền nhiễm thường xuyên gây dịch tại Việt nam với tỷ lệ mắc và tử vong cao. [4,5,9] Trong giai đoạn 2003-2012, một số dịch VĐHHC đã được ghi nhận : SARS, cúm gia cầm A/H5N1, cúm đại dịch A/H1N1pdm/09… các vụ dịch này không những gây ảnh hưởng cho sức khoẻ cộng đồng mà còn ảnh hưởng lớn đến kinh tế và xã hội.
Các nghiên cứu đã được triển khai trong những năm qua taị Việt Nam đã cho phép có những thông tin cơ bản nhất về sự lưu hành, mức độ nguy hiểm, tính nổi trội của một số tác nhân virút gây bệnh.[4] Sự nguy hiểm, khả năng lây truyền dễ và nguy cơ tiềm tàng của bùng phát dịch của các vi rút gây VĐHHC trong cộng đồng yêu cầu phải có sự chủ động giám sát vi rút học tại các bệnh viện cũng như trong cộng đồng. Chương trình giám sát cúm Quốc gia đã được triển khai từ năm 2006, một số nghiên cứu khác cũng tập trung tại các cộng đồng cụ thể (Hà nam, Khánh hoà)….
Bệnh viện đa khoa Việt-Tiệp, Hải phòng là bệnh viện loại 4, tuyến y tế cuối cùng chăm sóc sức khoẻ cho nhân dân thành phố Hải phòng và các tỉnh lân cận thuộc khu vực Đông Bắc bộ: Quảng Ninh, Hải Dương, Thái Bình.., đây là một điểm giám sát phù hợp cho các nghiên cứu liên quan đên kiểu hình khí hậu.
27
Để tiếp nối các nghiên cứu đã tiến hành trong giai đoạn trước, đồng thời phát triển các giám sát chủ động trong bệnh viện các vi rút gây VĐHHC, chúng tôi tiến hành xây dựng nghiên cứu “Tìm hiểu các căn nguyên vi rút gây viêm đường hô hấp cấp của một số bệnh nhân điều trị ở bệnh viện đa khoa Việt Tiệp - Hải Phòng 2010-2012”
28
CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. 1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1 Định nghĩa ca bệnh
Các bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp nghi do vi rút có triệu chứng như sau:
- Bệnh khởi phát trong vòng 7 ngày
- Sốt cao đột ngột trên 38oC (xác định bằng cách đo nhiệt độ hoặc qua khai thác bệnh sử).
- Có ho và/hoặc khó thở.
- Và có ít nhất 1 trong những triệu chứng sau: Thở nhanh; tổn thương trên X quang phổi; phải hỗ trợ hô hấp.
2.1.2 Cỡ mẫu
170 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp của bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp nghi do vi rút thu thập tại điểm giám sát bệnh viện đa khoa Việt - Tiệp trong giai đoạn tháng 09/2010 đến tháng 4/2012 (bảng 2.1)
Bảng 2.1. Số bệnh nhân VĐHHC tại bệnh viện Việt Tiệp - Hải Phòng
Năm Bệnh nhân 2010 53 2011 73 2012 44 Tổng số 170 2.2 VẬT LIỆU 2.2.1 Mẫu bệnh phẩm
29
Mẫu bệnh phẩm được lấy ở những bệnh nhân nghi nhiễm virút từ 1-5 ngày kể từ ngày khởi bệnh.
2.2.1.2 Loại bệnh phẩm
Bệnh phẩm để xác định vi rút: Dịch ngoáy họng. Trong trường hợp không lấy được dịch họng có thể lấy dịch mũi, dịch nội khí quản được bảo quản trong môi trường vận chuyển vi rút.
2.2.1.3 Môi trường vận chuyển
Môi trường vận chuyển được chuẩn bị tại phòng thí nghiệm cúm – viện VSDT TƯ, sau đó chuyển đến trung tâm y tế dự phòng Hải Phòng.
Bảo quản môi trường vận chuyển ở 4o
C. Thời hạn sử dụng môi trường: 03 tháng
2.2.1.4 Kỹ thuật lấy mẫu bệnh phẩm
Dịch ngoáy họng: Đưa tăm bông vào vùng hầu họng, để cho thấm ướt toàn bộ đầu tăm bông, sau đó miết mạnh và quay tròn tăm bông tại khu vực 2 amidan và thành sau họng 3 đến 4 lần (để lấy được dịch, tế bào vùng họng). Đưa ngay tăm bông vào tube nhựa đã có sẵn 2-3ml môi trường bảo quản virút.
30
Dịch mũi: Dùng 1 tăm bông thu thập bệnh phẩm trong cả 2 mũi. Đầu tăm bông sau khi thu thập bệnh phẩm chuyển vào tube chứa 2-3 ml môi trường vận chuyển, bỏ bớt đầu thừa của tăm bông.
Hình 2.2. Thu thập mẫu bệnh phẩm dịch mũi
Dịch nội khí quản: Bệnh nhân khi đang thở máy, đã được đặt nội khí quản. Dùng 1 ống hút dịch, đặt theo đường nội khí quản và dùng bơm tiêm hút dịch nội khí quản theo đường ống ta đã đặt.Cho dịch nội khí quản vào tube chứa môi trường bảo quản virút.
2.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ
31
Bảng 2.2. Bảng mô tả trang thiết bị
Trang thiết bị Hãng
Phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2 Viện VSDTTƯ Buồng cấy an toàn sinh học (Biosafety
Cabinet) – Class 2
Bioquell - Anh
Tủ lạnh: 40
C,-200C và -800C Sanyo – Nhật
Máy ly tâm Effendorf
Máy luân nhiệt PCR Biorad
Luminex LX 100/200 System Luminex
Máy sonicator Cole - Palmer
Vortex IKA – Malaysia
Máy soi gel tia UV hãng Gel XL Gel Mate
Máy chạy điện di nằm Advance
Cân điện tử Sartorius
Lò vi sóng 850-1300 W Samsung
Máy chụp gel và phim UVP
Tủ ấm 33o
C, 37oC Sanyo
Kính hiển vi lộn ngược Olympus
2.2.4.2 Dụng cụ
* Dụng cụ lấy mẫu:
- Que ngoáy họng và tỵ hầu.
- Ống chứa môi trường vận chuyển vi rút.
* Trang bị phòng hộ cá nhân: quần áo chống dịch mặc một lần, khẩu trang. * Dụng cụ thí nghiệm:
- Pipet tự động vi lượng các loại: 0,5µl – 1000 µl
32
- Típ ly tâm: 1,5 ml – 2ml.
- Khay chạy điện di 100-250 ml và răng lược, 15-20 răng, dày 1mm. - Cốc đong 100-300 ml.
- Đĩa microtitre hoặc giấy parafilm. - Pipet đa kênh, pipet có lọc.
- Các vật liệu cần thiết khác như: Găng dùng 01 lần, giấy thấm, găng vải chống nhiệt...
2.2.3. Sinh phẩm
33
Bảng 2.3. Hệ thống mồi sử dụng để phát hiện vật liệu di truyền vi rút bằng phương pháp RT - PCR Họ Vi rút Tên mồi Trình tự (5‟-3‟) Sản phẩm khuếch đại (bp) Nguồn gốc O rt hom y xov ir ida e
Cúm A M30F2/08 ATG AGY CTT YTA ACC GAG GTC GAA ACG
232 NIID
M264R3/08 TGG ACA AAN CGT CTA CGC TGC AG H1 H1 HA F AGG CAA ATG GAA ATC TAA TAG CGC
164 CDC, Mỹ H1 HA R CCA TTG GTG CAT TTG AGG TGA TG
H3 H3 HA F AAG CAT TCC YAA TGA CAA ACC
120 CDC, Mỹ H3 HA R ATT GCR CCR AAT ATG CCT CTA GT
H5 H5-1 GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC
219
WHO, Hồng Kông H5-3 CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG
H1pdm swH1 Conv-F1 TGC ATT TGG GTA AAT GTA ACA TTG
349 NIID
swH1 Conv-R1 AAT GTA GGA TTT RCT GAK CTT TGG B Flu B F TCC TCA ACT CAC TCT TCGAGC G
120 CDC, Mỹ Flu B R CGG TGC TCT TGA CCA AAT TGG
P ar am yx ov ir ida e
RSV RSV-AB-F1-FAM AAC AGT TTA ACA TTA CCA AGT GA
368 CDC, Mỹ RSV-AB-R1 TCA TTG ACT TGA GAT ATT GAT GC
hMPV hMPVF-F1-FAM GAG CAA ATT GAA AAT CCC AGA CA
347 CDC, Mỹ hMPFV-R1 GAA AAC TGC CGC ACA ACA TTT AG
HIPV1 PIV1- forward CCG GTA ATT TCT CAT ACC TAT G
317 [22]
PIV1- reverse CCT TGG AGC GGA GTT GTT AAG HIPV2 PIV2- forward CCA TTT ACC TAA GTG ATG GAA T
203 [22]
PIV2- reverse GCC CTG TTG TAT TTG GAA GAG T HIPV3 PIV3- forward ACT CCC AAA GTT GAT GAA AGA T
102 [22]
PIV3- reverse TTA ATC TTG TTG TTG AGA TTG A
P ic or nav ir ida e Họ Picorna
PICO-F3-FAM GGC CCC TGA ATG (CT)G GCT AA
115 [52]
PICO-R3 GAA ACA CGG ACA CCC AAA GTA Rhino OL24 CTA CTT TGG GTG TCC G
530
Niigata, Nhật
Bản OL 68-1 GGT AAY TTC CAC CAC CAN CC
Entero EVP4 CTA CTT TGG GTG TCC GTG TT
650
Niigata, Nhật
Bản OL68 GGG AAC TTC CAG TAC CAY CC
Corona viri
d
a
e SARS- Cov
Cor-p-F2 CTA ACA TGC TTA GGA TAA TGG
368 CDC, Mỹ Cor-p-R1 CAG GTA AGC GTA AAA CTC ATC
- Bộ sinh phẩm tách chiết vật liệu di truyền của vi rút - ARN sử dụng bộ kít QIAamp viral RNA Mini, 250 preps, Cat No 52904, Quiagen.
34
- Bộ sinh phẩm dùng cho phản ứng RT-PCR: QIAGEN Onestep RT-PCR kit, Cat. No 210212
- RNase inhibitor (40U/) – Invitrogen
- Ethanol (96-100%) (1.00983.1000 hãng Merck) - Agarose - 1xTBE buffer - 100bp marker - Loading dye - Ethidium bromide Các chủng vi rút, mẫu chứng:
- Chứng dƣơng: ARN virus cúm mùa (H1N1, H3N2 and B), virút cúm A/H5N1 và virút A/H1N1pdm/09 đại dịch và các vi rút đường hô hấp khác.
- Chứng âm: sử dụng khuôn mẫu là nước cất tinh khiết (No Template Control - NTC)
- Chứng âm tách chiết: khuôn mẫu được tách chiết cùng với bệnh phẩm, sử dụng môi trường vận chuyển sạch làm mẫu tách chiết (Negative Extraction Control - NEC)
2.2.3.2 Sinh phẩm cho phản ứng Luminex/xTAG
Sinh phẩm Cat. No
QIAGEN® OneStep RT-PCR Enzyme Mix
5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer dNTP Mix
RNase-free
Cat. No.210210
TaKaRa Taq™ Hot Start Polymerase Đệm 10X PCR
2.5 mM TaKaRa dNTPs
TAKARA BIO Cat. No. R007A
35
Exonuclease I USB Cat No. 70073Z
Streptavidin, R-phycoerythrin conjugate Molecular Probes Cat. No S-866
Bộ sinh phẩm dùng cho kỹ thuật Luminex/xTAG: xTAG RVP kit, 96 preps Cat. No I019C0290, Luminex
Chứng dƣơng
E. coli phage MS 2 ATCC Cat. No. 15597-B1
Bacteriophage Lambda DNA New England Biolabs Cat. No. N3011S
2.2.3.3 Nguyên vật liệu hóa chất cho phân lập
Tế bào thường trực thận chó MDCK (Mardin – Darby Kidney cells), Hep2, LLC-MK2
CDC, NIID
Chai nuôi cấy tế bào T-75 Corning Cat.No. #430720 Phiến 96 giếng đáy chữ U Corning – Cat.No. # 3898 Dulbecco‟s Modified Eagle Medium (D-MEM)* GIBCO Cat.No. # 11965-092 Penicillin-Streptomycin, stock solution (10,000 U/ml
penicillin G; 10,000 μg/ml streptomycin sulfate)
GIBCO Cat.No. # 15140-023
Bovine serum albumin fraction V, 7.5% solution GIBCO Cat.No. # 15260-011 Fetal bovine serum, 40 nm filtered HyClone Laboratories, Inc
Cat.No. # A-1111-L Trypsin-EDTA
(0.05% trypsin; 0.53 mM EDTA.4Na)
GIBCO Cat.No. # 25300-054
Trypsin, TPCK treated Sigma Cat.No. # T-8642
Gentamicin reagent solution (50mg gentamicin sulfate/ml)
GIBCO Cat.No # 15750-011 Dung dịch đệm PBS
Ethanol (96-100%) Merck Cat.No. 1.00983.1000
2.2.2.3 Sinh phẩm sử dụng cho phương pháp xác định trình tự gen
- Uni 12 primer (CDC – Mỹ)
36
- Hotstar Hifidelity Polymerase Kit, Cat No 202605, Qiagen
- Bộ sinh phẩm tinh sạch sản phẩm PCR: Qiaquick PCR Purification kit 250, Cat.No. 28106, Qiagen.
- Bộ sinh phẩm cho chu kỳ nhiệt tạo đoạn ADN gắn các dideoxynucleotide (Cycle sequencing): BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit P/N: 4336917,ABI. - Bộ sinh phẩm tinh sạch sản phẩm đã gắn các dideoxynucleotide : DyeEx 2.0 Spin kit, Cat. No. 63206, Qiagen.
- HiDi Formamide ABI 25ml P/N: 4311320, ABI
Bảng 2.4. Hệ thống mồi tổng hợp sản phẩm PCR
Vi rút Tên mồi Trình tự
H1N1 đại dịch
HA-Mồi xuôi(1)
TGT AAA ACG ACG GCC AGT ATA CGA CTA GCA AAA GCA GGG G
HA-Mồi ngược(461)
CAG GAA ACA GCT ATG ACC TCA TGA TTG GGC CAY GA
HA-Mồi xuôi(351)
TGT AAA ACG ACG GCC AGT ACR TGT TAC CCW GGR GAT TTC A
HA-Mồi ngược(943)
CAG GAA ACA GCT ATG ACC GAA AKG GGA GRC TGG TGT TTA
HA-Mồi xuôi(379)
TGT AAA ACG ACG GCC AGT ATG ARG ARC TRA GAG AGC A
HA-Mồi ngược(1204)
CAG GAA ACA GCT ATG ACC CAA TGG CRT TYT GTG TGC TC
HA-Mồi xuôi(1204)
TGT AAA ACG ACG GCC AGT AAG ATG AAY ACR CAR TTC ACA G
HA-Mồi ngược (1778)
CAG GAA ACA GCT ATG ACC GTG TCA GTA GAA ACA AGG GTG TTT
B
BHA25F-Mồi xuôi ATC CAC AAA ATG AAG GCA
BHA1140R-Mồi
ngược ACC AGC AAT AGC TCC GAA
Bảng 2.5. Hệ thống mồi được sử dụng cho quá trình giải trình tự
Tên mồi Trình tự
HA H1N1pdm
HA 1R: TGT AAA ACG ACG GCC AGT ATA CGA CTA GCA AAA GCA GGG G HA 351R: TGT AAA ACG ACG GCC AGT ACR TGT TAC CCW GGR GAT TTC A HA-379R: TGT AAA ACG ACG GCC AGT ATG ARG ARC TRA GAG AGC A
HA-1778F: CAG GAA ACA GCT ATG ACC GTG TCA GTA GAA ACA AGG GTG TTT
HA B
BHA36F: GAA GGC AAT AAT TGT ACT BHA660R: TAT CAG AGT GGA ACC CC BHA1140R: ACC AGC AAT AGC TCC GAA
37
2.3 PHƢƠNG PHÁP
2.3.1 Tách chiết vật liệu di truyền của vi rút ARN
2.3.1.1 Nguyên lý
Sử dụng bộ sinh phẩm của hãng QIAgen (CHLB Đức) để tách chiết ARN của vi rút. Hiện nay, phương pháp này được đánh giá là phương pháp lý tưởng nhất để tách chiết ARN từ vi rút.
Sử dụng một dung dịch ly giải vi rút AVL có chất mang ARN, khi cho mẫu cần tách chiết ARN vào dung dịch AVL, vi rút sẽ bị ly giải, ARN của vi rút sẽ được gắn vào chất mang ARN. Với sự có mặt của ethanol 100 %, ARN của vi rút sẽ bị tủa. Khi cho lọc qua màng QIA amp Silicagel, ARN của vi rút sẽ được gắn chọn lọc trên màng QIA amp Silicagel nhờ chất mang ARN. Sử dụng dung dịch rửa AW I, AW II để loại các thành phần tạp bám trên màng QIA amp Silicagel. Dung dịch chiết xuất AVE sẽ tách ARN của vi rút bám trên màng QIA amp Silicagel.
2.3.1.2 Các bước tiến hành
Thực hiện tách chiết vật liệu di truyền ARN theo thường quy hướng dẫn của bộ kit (Phụ lục 1). ARN được lưu giữ ở – 20o
C hoặc – 80o
C, ARN vi rút có thể bền vững khoảng 1 năm.
Khi tiến hành tách chiết vật liệu di truyền của vi rút trong các mẫu bệnh phẩm phải có chứng âm tách chiết đi kèm. Các mẫu ARN đã được tách chiết phải được kiểm tra qua phản ứng di truyền phân tử RT-PCR, chứng âm tách chiết phải được thể hiện âm tính.
2.3.2. Phản ứng di truyền phân tử (RT - PCR)
Sản phẩm sau khi tách chiết thu được là ARN, sẽ được khuếch đại bằng phản ứng RT-PCR. Lượng hỗn dịch sinh phẩm và mẫu ARN cần cho một phản ứng và sẽ được chạy theo chu kì nhiệt tương ứng với mỗi loại mồi được sử dụng.
38 Bảng 2.6. Thành phần cho 1 phản ứng Thành phần cho một phản ứng Orthomyxoviridae Paramyxoviridae Picornaviridae Coronaviridae Cúm A, H5 H1, H3 và B Đệm Q 5 X (kit) 4 4 4 Đệm PCR 5X (kit) 4 4 dNTPs (kit) 0.8 0.8 0.8 1Mồi xuôi (5 M ) 3.6 3.6 2.4 1 Mồi ngược (5 M) 3.6 3.6 2.4
Enzymee mix (kit) 0.8 0.8 0.8
RNase Inhibitor (40U/l) 0.1 0.1 0.1
Nước cất tinh sạch 4.1 0.1 2.5
ARN mẫu 3 3 3
Total 20 20 20
Sử dụng bộ kit QIAGEN Onestep RT- PCR: cat. No 210212
1Mồi: tuỳ thuộc vào mục đích chẩn đoán mà sử dụng mồi như bảng 2.3 Thể tích cho mỗi một phản ứng: 20l
39
Bảng 2.7. Chu kỳ nhiệt của phản ứng RT-PCR
Nhiệt độ (o
C) Thời gian Chu kỳ
Cúm A, H1/09 đại dịch 50 30:00 1 95 15:00 1 94 0:30 x 40 50 0:30 72 0:40 72 7:00 1 10 Cúm A/H1 A/H3 và B 50 30:00 1 95 15:00 1 94 0:30 x 40 50 0:30 72 0:30 72 7:00 1 10 Cúm A/H5 50 30:00 1 95 15:00 1 94 0:30 x 40 55 0:30 72 0:30 72 7:00 1 10
40 Vi rút Chu kỳ Nhiệt độ và chu kỳ RSV 1 500C 30:00 950C 15:00 940C 0:30 540C 0:30 720C 0:30 720C 7:00 40C ∞ x40 Human metapneumovirus (hMPV) Picornavirus Enterovirus HIPV1 2 500C 30:00 950C 15:00 940C 1:00 560C 1:00 720C 1:00 720C 10:00 40C ∞ x40 HIPV2 HIPV3 Human Rhinovirus 3 500C 30:00 950C 15:00 940C 2:00 500C 2:00 720C 3:00 720C 3:00 40C ∞ x30 SARS-CoV 4 500C 30:00 950C 15:00 940C 1:00 540C 1:00 720C 1:00 720C 10:00 40C ∞ x40
41
Điện di sản phẩm
Điện di sản phẩm trên thạch 2% có ethidium bromide (10µl ethidium bromide/100ml dung dịch Agarose), hiệu điện thế 100V trong 30 phút. Sử dụng thang trọng lượng phân tử 100bp. Các băng ADN có thể quan sát và chụp ảnh dưới tia UV.
Kết quả điện di các băng ADN đặc trưng cho các tác nhân vi rút gây VĐHHC. Với kích thước sản phẩm theo bảng 2.3. Dưới đây là một trong những mẫu dương tính với một số tác nhân đã phát hiện được sau khi cho sản phẩm của RT-PCR điện di trên gel agarose 2,0% trong TBE.