(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu mức độ tạo mô sẹo phôi hóa và khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh, phục vụ công tác chuyển gen ở sắn (manihot esculenta crantz) (manihot esculenta crantz)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Tống Thị Hƣờng NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ TẠO MÔ SẸO PHƠI HĨA VÀ KHẢ NĂNG TÁI SINH CÂY HỒN CHỈNH, PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHUYỂN GEN Ở SẮN (MANIHOT ESCULENTA CRANTZ) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Tống Thị Hƣờng NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ TẠO MÔ SẸO PHƠI HĨA VÀ KHẢ NĂNG TÁI SINH CÂY HỒN CHỈNH, PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHUYỂN GEN Ở SẮN (MANIHOT ESCULENTA CRANTZ) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Nguyễn Văn Đồng TS Lê Hồng Điệp Hà Nội – 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin trân trọng cảm ơn thầy, cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tận tình giảng dạy, dìu dắt tơi thời gian học tập Trường Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Văn Đồng TS Lê Hồng Điệp, người thầy tận tình bảo, hướng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu khoa học thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán học viên làm việc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp hết lịng giúp đỡ tơi thực thành công luận văn Cuối cùng, vô biết ơn gia đình bạn bè khích lệ, động viên, giúp đỡ chỗ dựa vững cho quãng thời gian qua Luận văn thực với hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Công nghệ thông qua Hợp đồng Thực nhiệm vụ hợp tác quốc tế khoa học công nghệ theo nghị định thư số: 08/2013/HĐ-NĐT Tôi xin chân thành biết ơn hỗ trợ Hà Nội, tháng năm 2014 Học viên Tống Thị Hường MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH .v DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung sắn .3 1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học sắn 1.1.3 Giá trị sắn 1.2 Tình hình sản xuất sử dụng sắn giới Việt Nam .8 1.2.1 Trên giới 1.2.2.Ở Việt Nam 1.3 Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 1.4 Nguyên lý ứng dụng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .14 1.4.1 Cơ sở lí thuyết .14 1.4.2 Ưu, nhược điểm phương pháp nhân giống in vitro 15 1.4.3 Các hướng ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật .16 1.5 Môi trƣờng nuôi cấy tế bào mô thực vật 17 1.5.1 Các chất khoáng 17 1.5.2.Các vitamin 18 1.5.3 Các chất điều hoà sinh trưởng 19 1.6 Các phƣơng pháp chuyển gen thực vật .21 i 1.6.1 Chuyển gen trƣc tiếp 21 a Chuyển gen xung điện 21 b Chuyển gen vi tiêm (microinjection) 22 c Chuyển gen vi tiêm qua ống phấn (pollen tube) 22 d Chuyển gen súng bắn gen (Microprojectile bombardment biolistics) 22 1.6.2 Chuyển gen gián tiếp 23 a Chuyển gen gián tiếp nhờ virus 23 b Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .23 1.7 Tình hình nghiên cứu ni cấy mơ sẹo phơi hóa tạo hệ thống tái sinh chuyển gen vào sắn 24 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu nghiên cứu 27 2.1.1 Mẫu thực vật .27 2.1.2 Vi khuẩn vector .27 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 28 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Phương pháp khử trùng tạo mẫu 28 2.2.2 Phương pháp nhân giống ống nghiệm 29 2.2.3 Nghiên cứu khả tạo mơ sẹo phơi hóa .29 2.2.4 Nghiên cứu khả tái sinh thành hồn chỉnh từ mơ sẹo phơi hóa .30 2.2.5 Phương pháp biến nạp .31 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Nghiên cứu tạo mẫu 33 3.2 Nghiên cứu thí nghiệm tạo chồi, nhân cụm chồi kéo dài chồi 36 ii 3.3 Nghiên cứu tạo mơ sẹo phơi hóa từ chồi nách sắn 37 3.4 Kết tái sinh thành hồn chỉnh từ mơ sẹo phơi hóa giống TMS 60444 47 3.5 Kết chuyển gen vào mơ sẹo phơi hóa giống TMS 60444 49 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Diện tích trồng sắn Việt Nam (x1000 ha) từ năm 1995 – 2012 [66] Bảng Sản lượng sắn (x 1000 tấn) trồng Việt Nam từ 1995 – 2012 [66] 10 Bảng 3.Các nhà máy sản xuất Ethanol rượu từ sắn Việt Nam năm 2012 [67] 11 Bảng 4: Khái quát bước tạo mô sẹo phơi hóa sắn 30 Bảng Hệ số thí nghiệm tạo cụm chồi, thí nghiệm nhân cụm chồi thí nghiệm kéo dài chồi .36 Bảng Kết tạo mô sẹo từ chồi nách môi trường CIM 38 Bảng 7.Đánh giá chất lượng mô sẹo sau tuần nuôi cấy môi trường DKW 40 Bảng 8: Đánh giá tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi giai đoạn 28 ngày tuổi môi trường DKW 41 Bảng Đánh giá khả tạo mơ sẹo phơi hóa môi trường MMS 43 Bảng 10 Tỷ lệ tạo mơ sẹo phơi hóa giống sắn nghiên cứu 46 Bảng 11 Đánh giá khả tái sinh thành hoàn chỉnh từ mơ sẹo phơi hóa 48 Bảng 12 Ảnh hưởng Cefotaxime đến tỉ lệ sống khả tái sinh từ mơ sẹo phơi hóa TMS 60444 (theo dõi sau tuần) .55 Bảng 13 Ảnh hưởng nồng độ OD600 đến khả tiếp nhận gen mô sẹo phôi hóa 51 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Hình thái sắn [47] .3 Hình Diện tích, suất sản lượng sắn giới từ năm 1995 – 2012 [66] Hình Sản lượng sắn (năm 2008) nước giới [65] Hình Các hệ thống sử dụng để thu sắn biến đổi gen [59] 24 Hình 5: Tỷ lệ mẫu sống giống sắn nghiên cứu nồng độ NaClO khác .33 Hình 6: Tỷ lệ mẫu giống sắn nghiên cứu nồng độ NaClO khác .34 Hình Kết thí nghiệm tạo cụm chồi giống HL 2004-28 sau 28 ngày nuôi cấy .37 Hình Các cụm mô sẹo tuần tuổi môi trường CIM 40 Hình Khối mơ sẹo giống môi trường DKW sau tuần ni cấy 42 Hình 10 Khối mơ sẹo HL 2004-28 (A); KM 140 (B); KM 419 (C) TMS 60444 (D) giai đoạn tuần tuổi môi trường MMS 45 Hình 11 Cụm mơ sẹo phơi hóa tái sinh 48 Hình 12: Sơ đồ quy trình chuyển gen vào sắn thơng qua A tumefaciens .50 Hình 13: Chồi tái sinh cụm mơ sẹo phơi hóa ngâm dịch khuẩn có OD600 = 0,5 biểu gen GFP 53 Hình 14: Chồi tái sinh cụm mơ sẹo phơi hóa ngâm dịch khuẩn có OD600 = 0,7 biểu gen GFP 53 Hình 15: Chồi tái sinh cụm mơ sẹo phơi hóa ngâm dịch khuẩn có OD600 = 0,25 biểu gen GFP 54 v DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu/viết tắt Tên đầy đủ AS Acetosyringone BAP 6-Benzyl amino purin GFP Green Flourescen Protein EC Embryogenic Callus FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations IAA Acid-β-indolacetic NAA Napthanele acetic acid 2,4D Axit 2,4 Diclorophenoxiaxetic ADN Acid deoxiribonucleic Picloram 4-Amino-3,5,6-trichloro-2-pyridinecarboxylic Glufosinate (RS)-2-Amino-4 (hydroxy(methyl)phosphonoyl)butanoic acid MS Murashige and Skoog OD Optical Density w/v Weight per volume vi MỞ ĐẦU Biến đổi khí hậu làm nhiệt độ trái đất tăng lên, dẫn đến tượng hạn hán, lũ lụt xảy thường xuyên hơn, với dịch bệnh, gây ảnh hưởng không nhỏ đến sinh trưởng phát triển suất trồng Điều ảnh hưởng trực tiếp đến đời sống người, đặc biệt vấn đề an ninh lương thực, người khu vực thường xảy thiên tai có điều kiện tự nhiên khơng thuận lợi Trước tình hình đó, việc tạo nguồn giống mới, lương thực có suất cao, phẩm chất tốt, thích nghi rộng với điều kiện mơi trường, trở nên cấp thiết Công nghệ chọn giống trước chủ yếu tiến hành phép lai giống có tính trạng khác để thu hệ lai có tính trạng mong muốn Tuy nhiên phương pháp có hạn chế định khiến tiềm bị giảm sút, chẳng hạn hệ lai bất thụ, giới hạn cá thể loài Chọn tạo giống sắn phương pháp đột biến xem phương pháp nhằm khắc phục hạn chế phương pháp lai tạo nói Hơn nữa, năm gần đây, công nghệ sinh học thực vật đạt số thành tựu khả quan, cho phép nhà chọn giống tạo giống có nhiều phẩm chất tốt từ nguồn gốc khác Đặc biệt, công nghệ nuôi cấy mô sẹo phơi hóa (ký hiệu EC – embryogenic callus) khơng tạo giống bệnh, mà cịn nghiên cứu phát sinh hình thái phơi vơ tính, nhân sinh khối tế bào dịch lỏng, nuôi cấy dung hợp tế bào trần để tạo giống lai tứ bội thể, tạo trồng chuyển gen bảo quản nguồn gen Trong lĩnh vực lương thực, bên cạnh lúa, ngô đậu tương, sắn lồi đóng vai trị quan trọng góp phần ổn định nhu cầu lương thực người giải vấn đề an ninh lương thực giới, sắn nguồn nguyên liệu quan trọng cho ngành công nghiệp thực phẩm nhiên liệu sinh học Sắn trồng nhiều nơi giới, Việt Nam Tuy nhiên, kĩ thuật thâm canh khơng đồng dẫn đến tình trạng đất đai bị xói mịn, rửa trơi, kết hợp với điều kiện môi trường không thuận lợi, sâu bệnh ngày nhiều, nên sắn có sản lượng thấp chất lượng suy giảm Vì vậy, để sản xuất sắn cách bền vững cần phải tạo nghiên cứu chúng tơi có cải tiến số thành phần môi trường giai đoạn cảm ứng tạo mô sẹo phơi hóa để chất lượng mơ sẹo phơi hóa tạo tốt a Ảnh hƣởng nồng độ dịch khuẩn đến khả tiếp nhận gen mô sẹo phơi hóa giai đoạn tái sinh Nồng độ dung dịch khuẩn có ảnh lớn đến hiệu biến nạp Nồng độ khuẩn cao dẫn đến khả khối mơ sẹo phơi hóa bị nhiễm khuẩn trở lại lớn, điều làm ảnh hưởng đến khả sống khả tái sinh khối mơ sẹo phơi hóa sau biến nạp Nếu nồng độ khuẩn thấp hiệu biến nạp vào mơ sẹo phơi hóa thấp Nghiên cứu thăm dị khả sống khả tiếp nhận gen khối mơ sẹo phơi hóa biến nạp nồng độ khuẩn khác Từ tìm nồng độ khuẩn thích hợp để sử dụng cho thí nghiệm biến nạp sau Thử nghiệm khả biểu gen GFP cụm mô sẹo phơi hóa tái sinh giá trị OD600 = 0,25; 0,5 0,7 cho thấy, giá trị OD600=0,5, mơ sẹo phơi hóa biểu gen GFP lớn với tỷ lệ 11,5% tổng số mô sẹo thử nghiệm Tỷ lệ cao gấp lần tỷ lệ biểu mô sẹo xử lý dịch khuẩn có giá trị OD600 = 0,25 0,7 (Bảng 13) Bảng 13 Ảnh hƣởng nồng độ OD600 đến khả tiếp nhận gen mô sẹo phơi hóa 51 CT OD600 0,25 0,5 0,7 Lần thí nghiệm Số cụm mơ sẹo phơi hóaban đầu sử dụng cho biến nạp Tỷ lệ cụm mô sẹo phơi hóa biểu gen GFP mơi trƣờng tái sinh Tỷ lệ trung bình cụm mơ sẹo phơi hóa biểu gen GFP (%) (%) 2,7 150 2 150 3,3 150 10,2 150 12,7 150 5,4 150 4,6 11,5 Tỷ lệ cụm mơ sẹo phơi hóa biểu gen GFP lớn 11,5% sử dụng dịch khuẩn có OD600 = 0,5 cho biến nạp, tỷ lệ giảm nhiều sử dụng dịch khuẩn có OD600 = 0,25 OD600 = 0,7 để biến nạp (Bảng 13) Kết phù hợp với nghiên cứu số nhà khoa học Thụy Sĩ nghiên cứu chuyển gen vào sắn [65] Dưới hình ảnh cụm mơ sẹo phơi hóa biểu genGFP sau biến nạp 16 tuần tuổi môi trường tái sinh MSN với công thức OD600 khác soi kính hiển vi phát huỳnh quang 52 Hình 13: Chồi tái sinh cụm mơ sẹo phơi hóa ngâm dịch khuẩn có OD600 = 0,5 biểu gen GFP (A), (C): hình ảnh chồi tái sinh soi ánh sáng trắng; (B), (D): hình ảnh chồi tái sinh soi đèn phát huỳnh quang Vùng khoanh đỏ vị trí biểu gen GFP Hình 14: Chồi tái sinh cụm mơ sẹo phơi hóa ngâm dịch khuẩn có OD600 = 0,7 biểu gen GFP 53 Hình 15: Chồi tái sinh cụm mơ sẹo phơi hóa ngâm dịch khuẩn có OD600 = 0,25 biểu gen GFP b Ảnh hƣởng Cefotaxime đến diệt khuẩn có mơ sẹo phơi hóa khả tái sinh chồi từ mô sẹo phôi hóa Sự ảnh hưởng chất kháng sinh Cefotaxime đến tỉ lệ sống khả tái sinh chồi mơ sẹo phơi hóa sắn thể bổ sung kháng sinh Cefotaxime từ nồng độ 300 đến 600 mg/l cho tỉ lệ sống mô sẹo phôi hóa đạt 100% tất cơng thức Điều cho thấy mơ sẹo phơi hóa có khả sống mạnh bị ức chế kháng sinh Cefotaxime Kháng sinh Cefotaxime ức chế khả tái sinh ảnh hưởng đến thời gian hình thành chồi từ mơ sẹo phơi hóa Điều thể rõ qua tiêu sinh trưởng phát triển như: thời gian tạo chồi, màu sắc chồi… (Bảng 11) Khi khơng bổ sung Cefotaxime tỷ lệ mơ sẹo phơi hóa sau biến nạp bị nhiễm khuẩn lại 100% Bổ sung Cefotaxime 400mg/l có tỷ lệ mơ sẹo bị nhiễm khuẩn lại thấp (chỉ khoảng 10,2%), tỷ lệ tạo chồi đạt 68,7% cao so với nồng độ Cefotaxime lại, thời gian bắt đầu tạo chồi ngắn số cụm mô sẹo nhiều (xem bảng 12) Khi bổ sung nồng độ Cefotaxime 300mg/l vào môi trường nuôi cấy mô sẹo phôi hóa tỷ lệ tạo chồi thời gian bắt đầu tạo chồi tương tự với nồng độ Cefotaxime 400mg/l tỷ lệ mơ sẹo bị nhiễm khuẩn lại cao Bổ sung 500mg/l 600mg/l vào môi trường ni cấy mơ sẹo phơi hóa tỷ lệ tạo chồi thấp thời gian tạo chồi dài so với bổ sung nồng độ 54 300mg/l 400mg/l Vì nồng độ Cefotaxime 400mg/l nồng độ thích hợp để loại bỏ khuẩn cụm mơ sẹo phơi hóa sau biến nạp Bảng 12 Ảnh hƣởng Cefotaxime đến tỉ lệ sống khả tái sinh từ mơ sẹo phơi hóa TMS 60444 (theo dõi sau tuần) CT Cefotaxime Số cụm mô sẹo (mg/L) phơi hóa Các tiêu theo dõi Tỷ lệ cụm Tỷ lệ tạo Thời gian số lá/cụm mô sẹo bị chồi (%) bắt đầu (lá) nhiễm tạo chồi khuẩn lại (%) (ngày) CT1 50 100 10 30 2,2 CT2 300 50 20,3 65,7 25,6 3,7 CT3 400 50 10,2 68,7 26,3 3,1 CT4 500 50 5,6 24,5 27 2,1 CT5 600 50 14,7 30,3 1,5 CT6 700 50 0 Theo số nghiên cứu, biến nạp gen thực tế bào thực vật phân chia mạnh có tổ hợp ADN tế bào Mặt khác, dung hợp ADN ngoại lai phụ thuộc vào dạng tế bào thực vật điều kiện ni cấy thích hợp chúng [64] Trong nghiên cứu này, mơ sẹo phơi hóa 15 ngày tuổi thích hợp để chuyển gen thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Dựa vào chất tự nhiên vi khuẩn A.tumefaciens nhiễm vào tế bào bị thương phân chia mạnh, tế bào tiết hợp chất có nguồn gốc phenol acetosyringone (là chất dẫn dụ vi khuẩn A tumefaciens) cần thiết cho trình xâm nhập T-ADN A tumefaciens vào tế bào Do đó, trước lây nhiễm với vi khuẩn, phải bổ sung thêm acetosyringone để kích thích xâm nhiễm vi khuẩn vào mô sẹo phôi hóa Các khối mơ sẹo phơi hóa đưa vào ống falcon 30ml chứa dung dịch vi khuẩn nồng độ OD600 = 0,25; OD600 = 0,5 OD600 = 0,7 có bổ sung acetosyringone 200M, lắc nhẹ phút Sau mẫu lấy cho lên giấy 55 thấm khơ đặt vào mơi trường MMS có bổ sung 200μM acetosyringone Thời gian đồng nuôi cấy ngày nhiệt độ 240C, điều kiện chiếu sáng 16h/ ngày Đây môi trường làm cho tế bào có khả phân chia mạnh, thành tế bào mỏng tạo điều kiện thuận lợi cho trình xâm nhập vi khuẩn nhiệt độ 24oC nhiệt độ tối ưu cho trình Khả chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens phụ thuộc nhiều vào đối tượng trồng, nguồn mẫu lây nhiễm Một số trồng, trình sinh trưởng sản sinh phytoxic chất có khả ức chế sinh trưởng mạnh vi khuẩn [27] Khi đồng ni cấy với mơ sẹo phơi hóa sắn, sinh trưởng vi khuẩn A tumefaciens mạnh không phụ thuộc vào phương pháp lây nhiễm Rõ ràng, đối tượng này, vi khuẩn A tumefaciens dễ dàng sinh trưởng phát triển Đây thuận lợi cho trình lây nhiễm lại khó khăn giai đoạn Thơng thường, vi khuẩn sinh trưởng phát triển mạnh q trình đồng ni cấy, q trình phục hồi chọn lọc sau khó khăn để loại bỏ vi khuẩn Trong quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens, việc bổ sung kháng sinh tiến hành diệt vi khuẩn A tumefaciens ảnh hưởng đến khả tái sinh [27], [44], [63] Bên cạnh đó, cần xác định ngưỡng có tác dụng gây chết 100% chất chọn lọc để làm sở cho chọn lọc Chính vậy, xác định ảnh hưởng yếu tố đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo phơi hóa giống TMS 60444 quan trọng Nguồn mẫu cấy mơ sẹo phơi hóa khoai mì sử dụng kháng sinh Cefotaxime nồng độ từ 300 - 500mg/l để diệt vi khuẩn A.tumefaciens.Sau ngày đồng ni cấy, mơ sẹo phơi hóa rửa lần dung dịch 1/10MS lỏng có bổ sung Cefotaxime 500mg/l, sau tiếp tục chuyển mơ sẹo phơi hóa vào mơi trường MMS (là mơi trường 1/10MS có bổ sung picloram 12mg/l) bổ sung Cefotaxime 400mg/l, theo dõi khối mơ sẹo phơi hóa tuần Nếu có khối mơ sẹo phơi hóa bị nhiễm khuẩn trở lại rửa lại, nhiên công đoạn phải hạn chế đến mức tối đa ảnh hưởng đến khả tái sinh chồi mơ sẹo phơi hóa giai đoạn Những khối mơ sẹo phơi hóa khơng bị nhiễm tiếp tục chuyển sang môi trường MMS kháng sinh ni cấy 2-3 tuần để tạo điều kiện cho tế bào biến nạp phân chia 56 nhân lên với số lượng lớn sau chuyển sang mơi trường tái sinh MSN giúp cho khối mơ sẹo phơi hóa tái sinh tốt 57 KẾT LUẬN Đã xác định phương thức khử trùng mẫu sử dụng NaClO 0,7%, thời gian 15 phút tạo nguồn mẫu vô trùng cho nhân giống in vitro Đã xác định thành phần môi trường phản ứng giống tạo cụm chồi, nhân kéo dài chồi: + Tạo cụm chồi: môi trường MS bổ sung BAP 3mg/l: giống HL 2004-28 đạt hệ số tạo cụm chồi cao 4,28 giống TMS 60444 đạt hệ số tạo cụm chồi thấp 3,68 + Nhân cụm chồi: môi trường MS bổ sung 1mg/l BAP: giống HL 2004-28 đạt hệ số nhân cụm chồi cao 3,95 giống TMS 60444 đạt hệ số nhân cụm chồi thấp 3,37 + Kéo dài cụm chồi: môi trường MS bổ sung 0,2mg/l GA3: Hai giống KM 140 KM 419 có hệ số kéo dài chồi cao (7,05 7,03) Giống TMS 60444 có hệ số kéo dài chồi thấp 5,12 Đã xác định khả tạo mô sẹo giống sắn nghiên cứu môi trường CIM bổ sung picloram 12mg/l: tỉ lệ tạo mô sẹo đạt 96,3% giống TMS 60444; 88,7% giống KM 140; 81,3% giống KM 419 77,7% giống HL 2004-28 Giống TMS 60444 cho chất lượng mô sẹo tốt Đã mô tả xác định khả tạo mơ sẹo phơi hóa giống TMS 60444 đạt 64,3% môi trường MMS bổ sung 12 mg/l picloram Các giống sắn Việt Nam nghiên cứu khơng có khả tạo mơ sẹo phơi hóa; 73,8% mơ sẹo phơi hóa có khả bật chồi sau 20,7 ngày mơi trường MSN bổ sung NAA 1mg/l rễ mơi trường CEM có chứa BAP 0,4 mg/l sau khoảng 69,8 ngày Bước đầu đánh giá khả tiếp nhận gen mơ sẹo phơi hóa giống TMS 60444 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang vector pzy101Asc:35s:GFP chứa gen thị GFP 58 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa q trình tạo mơ sẹo phơi hóa cho giống sắn Việt Nam thử nghiệm môi trường phù hợp để tái sinh chồi/cây từ mơ sẹo phơi hóa - Tiếp tục thử nghiệm chuyển gen mong muốn khác vào giống sắn TMS 60444 giống sắn Việt Nam Đánh giá tiếp nhận biểu gen ngoại lai qua GFP, PCR 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Lan Anh, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Trần Nguyên Vũ, Bùi Văn Lệ(2008), “Xây dựng quy trình biến nạp gen bar- gen kháng thuốc diệt cỏ vào khoai mì (Manihot esculenta Crantz) phương pháp bắn gen”,Tạp chí phát triển KH&CN, 11(1), tr 90-95 Phạm Văn Biên, Hoàng Kim(1995), Cây sắn, NXB Nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp Nguyễn Đức Doanh (1998), “Tổng quan chuyển gen từ 1986 – 1997”, Báo cáo hội nghị toàn quốc lần thứ công nghệ sinh học lúa, Huế Vũ Văn Kiên, Nguyễn Du Sanh (2011), Khảo sát phát sinh phơi hệ khoai mì, Tạp chí phát triển KH&CN, 14(T3) Trần Văn Minh(2003), Công nghệ sinh học thực vật, Giáo trình cao học – nghiên cứu sinh, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Lã Tuấn Nghĩa, Trần Lan Hương, Nguyễn Đức Doanh, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (1995), “Bước đầu nghiên cứu chuyển gen vào cà chua qua Agrobacterium”,Tạp chí cơng nghệ sinh học ứng dụng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, tr 18 – 23 Trần Ngọc Ngoạn (2007), Giáo trình sắn, NXB Nông nghiệp, Hà nội Nguyễn Quang Thạch (2007), Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Đại học Sư phạm 10 Đoàn Thị Phương Thùy, Bùi Trang Việt (2006), Tìm hiểu phát sinh phơi hệ từ mơ sẹo có nguồn gốc khoai mì (Manihot esculenta Crantz) dịng cuống trầu,Tạp chí khoa học kĩ thuật Nông lâm nghiệp, (1), tr 19-23 11 Nguyễn Văn Uyển (1993), Tóm tắt lịch sử phát triển ni cấy mơ thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 60 Tài liệu tiếng nƣớc 12 Abrahamian, P and A Kantharajah (2011), "Effect of Vitamins on In Vitro Organogenesis of Plant", American Journal of Plant Sciences, 2, pp 669-674 13 Akhter, J., M Qutub, N Burnham, and M Akhtar (2001), "Genetically modified foods: Health and safety issues", Annals of Saudi Medicine, 21(3-4), pp 161-164 14 Allem, A.C (2002), "The Origins and Taxonomy of Cassava", in Cassava: Biology, Production and Utilization, (Eds) R.J Hillocks, J.M Thresh, and A.C Bellotti CABI Publishing: New York, USA, pp 1-16 15 Amasino, R (2005), "1955: Kinetin Arrives The 50th Anniversary of a New Plant Hormone", Plant Physiology, 138(3), pp 1177-1184 16 Arnholdt-Schmitt, B and H Lörz (2003), "Plant Tissue Culture: 100 Years Since Gottlieb Haberlandt", Plant Tissue Culture, (eds) Laimer Margit and R Waltraud, Vol 17 Bhojwani, S.S and M.K Razdan (1983), "Plant Tissue Culture: Theory and Practice", Elsevier, India 18 Bull, S.E., J.A Owiti, M Niklaus, J.R Beeching, W Gruissem, and H Vanderschuren (2009), "Agrobacterium-mediated transformation of friable embryogenic calli and regeneration of transgenic cassava", Nat Protocols, 4(2), pp 1845-1854 19 Ceballos, H and G.d.l Cruz (2012), "Cassava Taxonomy and Morphology", in Cassava in the Third Millenium Modern: Production, Processing, Use and Market System, (Eds) CIAT Vol 377, CIAT Publication: Colombia, pp 15-28 20 Cocking, E.C (1960), "A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles", Nature, 187(4741), pp 962-963 21 Frébort, I., M Kowalska, T Hluska, J Frébortová, and P Galuszka (2011), "Evolution of cytokinin biosynthesis and degradation", Journal of Experimental Botany, 62(8), pp 2431-2452 22 Fresco, L.O (1986), "Cassava in shifting cultivation A systems approach to agricultural technology development in Africa", Royal Tropical Institute, Netherland 23 Gamborg, O.L., T Murashige, T.A Thorpe, and I.K Vasil (1976), "Plant tissue culture media", In Vitro, 12(7), pp 473-478 24 George, E., M Hall, and G.-J Klerk (2008), "Plant Growth Regulators I: Introduction; Auxins, their Analogues and Inhibitors", in Plant Propagation by Tissue Culture, (Eds) E George, M Hall, and G.-J Klerk, Springer Netherlands,pp 175-204 61 25 Haggblade, S and G Tembo (2003), "Conservation Farming in Zambia", EPTD discussion papers 108, International Food Policy Research Institute (IFPRI) 26 HoangKim, N.V Bo, N Phuong, H Long, T.C Khanh, N.T Hien, H Ceballos, R Lefroy, K Fahrney, R Howeler, and T.M Aye (2010), "Current situation of cassava in Vietnam and the breeding of improved cultivars", http://foodcrops.blogspot.com/2010/05/current-situation-of-cassava-in vietnam.html 27 Hoshi, Y., M Kondo, S Mori, Y.Adachi, M Nakano, and H Kobayashi (2004), "Production of transgenic lily plants by Agrobacterium-mediated transformation.", Plant Cell Rep, 22, pp 359-364 28 Huetteman, C and J Preece (1993), "Thidiazuron: a potent cytokinin for woody plant tissue culture", Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 33(2), pp 105-119 29 Ikeuchi, M., K Sugimoto, and A Iwase (2013), "Plant Callus: Mechanisms of Induction and Repression", Plant Cell25, pp 3159-3173 30 Jones, W.O (1959), "Manioc in Africa", Stanford University Press 31 Kim, H., P.V Bien, and R.H Howeler (2000), "Status of cassava in Viet Nam: Implications for future research and development", in Proceedings of the validation forum on the global cassava development strategy A review of cassava in Asia with country case studies on Thailand and Viet Nam Rome 32 King, P.J and H.E Street (1973), "Growth patterns in cell cultures.", in Plant tissue and cell culture., (Eds) Vol 11,pp 307-387 33 Koehorst-van Putten, H.J.J., E Sudarmonowati, M Herman, I.J PereiraBertram, A.M.A Wolters, H Meima, N Vetten, C.J.J.M Raemakers, and R.G.F Visser (2012), "Field testing and exploitation of genetically modified cassava with low-amylose or amylose-free starch in Indonesia", Transgenic Research, 21(1), pp 39-50 34 Ladino, J.J., M Echeverry, L.I Mancilla, D Lopez, P Chavarriaga, J Tohme, and W Roca (2002) "Genetic transformation of cassava: Confirmation of transgenesis in clone 60444 and analysis of CRY1Ab protein in transgenic lines Preliminary data on transformation of farmer-preferred cultivars SM1219-9 and CM3306-4", Centro Internacional de Agricultura Tropical, Cali, Colombia 35 Latham, M.C (1997), "Human Nutrition in the Development World",FAO 36 Li, H.-Q., C Sautter, I Potrykus, and J Puonti-Kaerlas (1996), "Genetic transformation of cassava (Manihot esculenta Crantz)", Nat Biotech, 14(6), pp 736-740 37 Liu, S., W Chen, K Fang, X Jiang, and Y Gai (2012), "Classification and characterization of unknown cytokinins into essential types by in-source collision-induced dissociation electrospray ionization ion trap mass 62 spectrometry", Rapid Communications in Mass Spectrometry, 26(17), pp 20752082 38 Lizarraga, R., T P., J U., and D J (1986), "Tissue culture for elimination of pathogens", in Specialized Technology Document In ternational Potato Center, Lima, Peru 39 McGaw, B and L Burch (1995), "Cytokinin Biosynthesis and Metabolism", in Plant Hormones, (Eds) P Davies, Springer Netherlands,pp 98-117 40 Miller, C (1961), "A kinetin-like compound in maize", Proc Natl Acad Sci USA 47, pp 170-174 41 Msikita, W., U Ihemere, D Siritunga, and R Sayre (2007), "Cassava (Manihot esculenta Crantz)", in Agrobacterium Protocols Volume 2, (Eds) K Wang Vol 344, Humana Press, pp 13-24 42 Murashige, T (1980), "Plant Growth Substances in Commercial Uses of Tissue Culture", in Plant Growth Substances 1979, (Eds) F Skoog, Springer Berlin Heidelberg,pp 426-434 43 Murashige, T and F Skoog (1962), "A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures", Physiologia Plantarum, 15(3), pp 473-497 44 Nagaraju, V., G.S.L.Srinivas, and G.L Sita (1998), "Agrobacterium-mediiated genetic transformation in Gerbera hybrida", Current Science, 74(7), pp 630634 45 Opabode, J.T., O.O Oyelakin, O.A Akinyemiju, and I.L Ingelbrecht (2014), "Influence of Type and Age of Primary Somatic Embryo on Secondary and Cyclic Somatic Embryogenesis of Cassava (Manihot esculenta Crantz)", British Biotechnology Journal, 4(3), pp 254-269 46 Paqui, D (2012), "Magic Cassava", in IFAD Social reporting blog 47 Raemakers, C.J.J.M., E Sofiari, E Jacobsen, and R.G.F Visser (1997), "Regeneration and transformation of cassava", Euphytica, 96(1), pp 153-161 48 Raemakers, K., M Schreuder, I Pereira, T Munyikwa, E Jacobsen, and R Visser (2001), "Progress made in FEC transformation of cassava", Euphytica, 120(1), pp 15-24 49 Ramage, C.M and R.R Williams (2002), "Mineral nutrition and plant morphogenesis", In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant38(2), pp 116-124 50 Ramakrishna, N., J Lacey, and J.E Smith (1991), "Effect of surface sterilization, fumigation and gamma irradiation on the microflora and germination of barley seeds", International Journal of Food Microbiology, 13(1), pp 47-54 51 Rogers, D (1965), "Some botanical and ethnological considerations ofManihot esculenta", Economic Botany, 19(4), pp 369-377 63 52 Rogers, D.J (1963), "Studies of Manihot esculenta Crantz and Related Species", Bulletin of the Torrey Botanical Club90(1), pp 43-54 53 Sarria, R., E Torres, F Angel, and P Chavarriga (2000), "Transgenic plants of cassava (Manihot esculenta) with resistance to basta obtained by Agrobacerium-mediated transformation", Plant Cell Rep.19, pp 339-344 54 Schmülling, T (2004), "Cytokinin", in Encyclopedia of Biological Chemistry, (Eds) W Lennarz and M.D Lane Academic Press/Elsevier Science 55 Schöpke, C., C Franche, D Bogusz, P Chavarriaga, C Fauquet, and N.R Beachy (1993), "Transformation in Cassava (Manihot esculenta Crantz)", in Biotechnology in Agriculture and Forestry, (Eds) Y.P.Z Bajaj Vol 23 Plant Protoplast and Genetics Engineering IV, Springer-Verlag Berlin, pp 273-289 56 Schöpke, C., N Taylor, R Cárcamo, N Konan, P Marmey, G Henshaw, R Beachy, and C Fauquet (1996), "Regeneration of transgenic cassava plants (Manihot esculeitta Crantz) from microbombarded embryogenic suspension cultures".Nature Biotechnology, 14, pp 731-735 57 Siritunga, D and R Sayre (2004), "Engineering cyanogen synthesis and turnover in cassava (Manihot esculenta)", Plant Molecular Biology, 56, pp 661–669 58 Skoog, F., F Strong, and C Miller (1965), "Cytokinins", Science, 148, pp 532– 533 59 Taylor, N., P Chavarriaga, K Raemakers, D Siritunga, and P Zhang (2004), "Development and application of transgenic technologies in cassava", Plant Molecular Biology, 56, pp 671–688 60 Thorpe, T., C Stasolla, E.C Yeun, G.-J.d Klerk, A Roberts, and E.F George (2008), "The Components of Plant Tissue Culture Media ll: Organic Additions, Osmotic and pH Effects and support systems ", in Plant Propagation by Tissue Culture 3rd Edition., (Eds) E.F George, Springer, pp 115-173 61 Tinjuangjun, P., N.T Loc, A.M.R Gatehouse, J.A Gatehouse, and P Christou (2000), "Enhanced insect resistance in Thai rice varieties generated by particle bombardment", Molecular Breeding, 6(4), pp 391-399 62 Tribadi, Suranto, and Sajidan (2010), "Variation of morphological and protein pattern of cassava (Manihot esculenta) varieties of Adira1 and Cabak makao in Ngawi, East Java ".Bioscience, 2(1), pp 14-22 63 Tyagi, P and S.L Kothari (2004), "Rapid in-vitro regeneration of Gerbera jamesonii from different explants Indian".Journal of Biotechnology, 3, pp 584588 64 Van Onckelen, H., E Prinsen, D Inzé, P Rüdeisheim, M Van Lijsebettens, A Follin, J Schell, M Van Montagu, and J De Greef (1986), "Agrobacterium TDNA gene codes for tryptophan 2-monooxygenase activity in tobacco crown gall cells".FEBS Letters, 198(2), pp 357-360 64 65 Zainuddin, I., K Schlegel, W Gruissem, and H Vanderschuren (2012), "Robust transformation procedure for the production of transgenic farmerpreferred cassava landraces".Plant Methods, 8(1) Tài liệu website 66 http://faostat.fao.org/site/567/DesktopDefault.aspx? PageID=567#ancor 67 http://cropsforbiofuel.blogspot.com/2011/04/cassava-for-biofuel-in vietnam.html 68 http://cassavaviet.blogspot.com/2013/01/vietnam-cassava-breeding-overviewbroad.html 69 Tổng cục Thống kê, 2013 http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=390&idmid=3&ItemID=12923 65 ... - - Tống Thị Hƣờng NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ TẠO MÔ SẸO PHƠI HĨA VÀ KHẢ NĂNG TÁI SINH CÂY HỒN CHỈNH, PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHUYỂN GEN Ở SẮN (MANIHOT ESCULENTA CRANTZ) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm... đề tài: ? ?Nghiên cứu mức độ tạo mơ sẹo phơi hóa khả tái sinh hồn chỉnh, phục vụ cơng tác chuyển gen sắn (Manihot esculenta Crantz)? ?? với mục đích nghiên cứu sau: MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI - Tạo lượng... nguồn nguyên liệu sắn vô trùng, phục vụ cho việc tạo mơ sẹo phơi hóa - Xác định mức độ tạo mơ sẹo phơi hóa khả tái sinh từ mơ sẹo phơi hóa - Thăm dị khả chuyển gen vào mơ sẹo phơi hóa thông qua Agrobacterium