Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã cho thụ thể neurokinin 1 ở người việt nam

́ ĐAỊ HOCC̣ QUÔC GIA HÀNÔỊ TRƯỜNG ĐAỊ HOCC̣ KHOA HOCC̣ TỰNHIÊN - Lê Hồng Thu TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 Ở NGỪƠI VIỆT NAM LUÂṆ VĂN THACC̣ SĨKHOA HOCC̣ Hà Nợi - 2012 ́ ĐAỊ HOCC̣ QC GIA HÀNƠỊ TRƯỜNG ĐAỊ HOCC̣ KHOA HOCC̣ TỰNHIÊN Lê Hồng Thu TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 Ở NGƯỜI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 604230 LUÂṆ VĂN THACC̣ SĨKHOA HOCC̣ ̃ NGƢỜI HƢỚNG DÂN KHOA HOC:C̣ PGS.TS Võ Thị Thƣơng Lan Hà Nội - 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Ch¬ng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1 THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN 11 1.1.1 G protein 11 1.1.2 Thụ thể liên kết với G protein 11 1.2 HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ .14 1.3 THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ-1 18 1.3.1 Giới thiệu chung thụ thể họ tachykinin 18 1.3.2 Thụ thể neurokinin – 20 1.4 ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH 23 1.5 VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 26 Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 NGUYÊN LIỆU 28 2.1.1 Mẫu vật 28 2.1.2 Các cặp mồi sử dụng 28 2.1.3 Các hệ thống vector 29 2.1.4 Chủng vi khuẩn 29 2.1.5 Hóa chất và thiết bị 29 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 30 2.2.2 Các kỹ thuật dùng nghiên cứu 31 2.2.2.1 Tách RNA tổng số 31 2.2.2.2 Phản ứng phiên mã ngược 32 2.2.2.3 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.2.2.4 Tinh DNA phương pháp gel 2.2.2.5 Nối ghép đoạn DNA vào vector 2.2.2.6 Kỹ thuật biến nạp 2.2.2.7 Sàng lọc khuẩn lạc 2.2.2.8 Tách plasmid 2.2.2.9 Kĩ thuật cắt sử dụng enzyme giới hạn 2.2.2.10 Kỹ thuật điện di 2.2.2.11 Phân tích trình tự cDNA cDNA-NK1 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 TÁCH DỊNG GEN MÃ HĨA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 TỪ PHỔI NGƢỜI 3.1.1 Tổng hợp cDNA từ mẫu phổi người 3.1.2 Khuếch đại đoạn 5’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 37 3.1.3 Khuếch đại đoạn 3’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 39 3.1.4 Tách dòng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 3.1.5 Tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1 3.1.6 Giải trình tự cDNA hịan chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 3.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 3.2.1 Thiết kế mồi 3.2.2 Tách dịng vector biểu mang cDNA mã hóa cho th ụ thể neurokinin1 3.2.3 Giải trình tự gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 vector biểu KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 57 KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 \ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Họ thụ thể liên kết với G protein (GPCRs) Hình 2: Cấu trúc chung thụ thể xuyên màng lần liên kết với G protein Hình 3: Sơ đồ cắt-nới gen mã hóa cho tachykinin đợng vật có vú Hình 4: Cấu trúc thụ thể NK1 mang chiều dài hịan chỉnh và NK1 có đầu carboxyl bị xén cụt Hình 5: Sơ đồ nghiên cứu tách dịng và thiết kế vector biểu cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin – phổi người Việt Nam Hình 6: Sơ đồ khuếch đại đoạn 5’ và 3’-NK1 gen mã hóa cho neurokinin-1…………9 Hình 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Hình 8: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Hình 9: Điện di sản phẩm PCR dùng khuôn cDNA tổng hợp từ mồi oligo T khuếch đại đoạn 3’-NK1 Hình 10: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc khuẩn lạc với cặp mồi NK1 F/ NK1 R1 Hình 11: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1 cặp mồi NK1 F1/ NK1 R Hình 12 Sơ đồ tách dịng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1 Hình 13: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 cặp mồi pJET R/ NK1 R………………………………………………………………………………………….37 Hình 14: Điện di sản phẩm cắt trước và sau tinh kit QIAquick Gel Extraction……………………………………………………………………………… 38 Hình 15: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn cDNA NK1 hoàn chỉnh Hình 16: Sơ đồ thiết kế mồi NK1 F3/R3 để khuếch đại cDNA-NK1 từ vector pNK13 Hình 17: Điêṇ di san phẩm PCR với khuôn là vector tai tổhơpC̣ pNK F3/NK1 R3 ̉̉ Hình 18: Điêṇ di san phẩm cắt ve Hind HI Hình 19: Điêṇ di san phẩm PCR kiểm tra khuẩn lacC̣ mang vector NK1 Hình 20: Điêṇ di san phẩm PCR kiểm tra khuẩn lacC̣ mang vector tai tổhơpC̣ pGFPN NK1 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA Dedeoxyribonuleic acid pb base pair (cặp bazơ) kb kilobase = 1000 bp dNTP deoxyribonucleoside triphosphate E.col Escherichia coli LB Lubertani Both PCR Polymerase Chain Reception RNA Ribonucleic acid GPCR G protein coupled receptor TACR Tachykinin Receptor TM Transmembrane IL Ỉntacellular CIN V Chemotherapy induced nausea and vomiting MỞ ĐẦU Thụ thể neurokinin – thuộc nhóm thụ thể xuyên màng liên kết với G protein Khi thụ thể này tương tác với cấu tử gắn đặc hiệu SP dẫn truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh ngoại vi trung ương thần kinh, gây trạng thái lo âu và triệu chứng giớng trầm cảm, mặt khác chúng có tác dụng gây kích thích co trơn và điều hòa phản ứng miễn dịch thể Trên sở nghiên cứu cấu trúc và chức thụ thể neurokinin-1, hãng dược phẩm đã cớ gắng tìm chất đới vận với thụ thể neurokinin-1 nhằm sản xuất thuốc giảm đau cho bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, thuốc chống nôn cho bệnh nhân ung thư, … Tuy nhiên, cơng trình nghiên cứu thụ thể này người Việt Nam cịn chưa cơng bớ Chính vậy, với mục đích phân lập đoạn cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể này người Việt Nam và biểu chúng hệ thớng tế bào đợng vật để chủ động nguồn gen và hệ thống sàng lọc thuốc từ nguồn dược liệu Việt Nam, chúng tơi đã tiến hành đề tài “Tách dịng thiết kế vector biểu gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ngườiViệt Nam” Đề tài thực Phịng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học; Phịng Genomic tḥc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme - Protein và Phịng Sinh học Phân tử tḥc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sống,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Q́c Gia Hà Nợi Ch-¬ng 1.1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN 1.1.1 G protein G protein lần phát và mô tả Alfred và Martin hai ông nghiên cứu tác động adrenaline đới với tế bào Với cơng trình này, hai ông đã giành giải Nobel lý sinh – y học năm 1994 [4] G protein mợt nhóm protein lớn có chất là enzyme GTPases [46] Dựa vào kích thước người ta chia chúng thành hai họ: GTPases dạng monomer kích thước nhỏ và G protein dạng trimer kích thước lớn G protein kích thước lớn tạo thành từ tiểu đơn vị alpha (Gα), beta (Gβ) và gamma (Gγ) Hai tiểu đơn vị beta (Gβ) và gamma (Gγ) hình thành phức dimer bền vững (Gβγ); phức này liên kết với tiểu đơn vị alpha (Gα) [29] G protein định vị mặt màng tế bào và hoạt hóa nhờ thụ thể liên kết với G protein (GPCRs) phân bố bề mặt màng tế bào 1.1.2 Thụ thể liên kết với G protein Họ thụ thể liên kết với G protein là phân tử protein kích thước nhỏ (350-500 acid amine) [45], phân thành phân họ khác dựa theo độ tương đồng trình tự acid amine, chức và khả liên kết với cấu tử Đến đã người ta đã phát 367 thụ thể liên kết với G protein người, có khoảng 150 GPCRs tìm thấy chưa biết chức [52] Điều kiện Ủ 37 Ctrong Tổng Qua bước cắt sản phẩm tinh High Pure Product Purification kit (Roche) và điện di kiểm tra Kết cuối thể Hình 18 Hình 18: Điêṇ di sản phẩm cắt vector pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK với hai enzyme Hind III và Bam HI Giếng 1, 2, lần lươṭ làvector pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK1 không cắt; 1’, 2’, 3’: lần lươṭ làvect or pCDNA3, pEGFP-N1 và eNK1 sau cắt ; M1: marker kb; M2: thang chuẩn SY-500 Sau tinh , eNK1 đưa vào vector pCDNA và pEGFP -N1 với thành phần trình bày Bảng 22 Bảng 22: Thành phần và điều kiện phản ứng nối cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 vào vector pCDNA3 và pEGFP-N1 Thành phần Đệm 10x eNK1cắt Plasmid pCDNA3 cắt T4 ligase Tổng Hai hỗn hơpC̣ nối đươcC̣ biến napC̣ riêng biệt vao chung vi khuẩn theo phương phap sốc nhiệt ̉́ mọc mơi trường có kháng sinh ampicillin (50µg/ml) Khuẩn lạc nhận plasmid pEGFP-N1 mọc môi trường có kháng sinh Kanamycin (50µg/ml) Trên hai loại mơi trường , thu nhiều khuẩn lạc Để sàng locC̣ khuẩn lacC̣ mang cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho NK1, chúng tơi chọn 14 khuẩn lạc môi trường chứa kháng sinh ampicillin và 15 khuẩn lạc môi trường chứa kháng sinh kanamycin làm khuôn cho phản ứng PCR với căpC̣ mồi NK F3/ NK1 R3 Thành phần và điều kiện phản ứng đươcC̣ thểhiêṇ Bảng 23 Bảng 23: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR kiểm tra cDNA-NK1 thể biến nạp Thành phần H2O Điều kiện Thể tích (µl) 10.0 - Thời gian biến tính đầu Đệm 10x 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F3 (10 µM) 0.5 +Biến tính: 94 C, 30 giây NK1 R3 (10 µM) 0.5 Taq DNA polymerase (1 u/ µl) 0.5 +Gắn mồi : 60 C, 30 giây +Tổng hợp: 72 C, 135 giây Khuôn 1.0 Tổng 15.0 o tiên: 94 C, phút - Lặp lại 40 chu kì: 0 - Thời gian tổng hợp sau cùng: 72 C, 10 phút Sản phẩm PCR điện di gel agarose (Hình 19 và Hình 20) Kết cho thấy với dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp pCDNA3, đã thu 15 khuẩn lạc mang đoạn chèn cDNA-NK1 có kích thước mong ḿn (Hình 19).Với dịng chứa vector tái tổ hợp peGFP-N1, thu 13 15 khuẩn lạc chứa đoạn chèn cDNA-NK1 có kích thước mong ḿn (Hình 20) Hình 19: Điêṇ di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn lacC̣ mang vector tái tổhơpC̣ pCDNA3-NK1 Giếng 1A-14A: khuẩn lạc đánh số tương ứng ; giếng M: thang chuẩn SY-500 Hình 20: Điêṇ di sả n phẩm PCR kiểm tra khuẩn lacC̣ mang vector tái tổhơpC̣ pGFPN1-NK1 Giếng 1E-15E: khuẩn lạc đánh số tương ứng ; giếng M: thang chuẩn SY-500 Như đa t̃ ách dòng hai vector tái tổhơpC̣ pCDNA 3-NK1 và pEGFPN1-NK1 mang cDNA hoàn chỉnh mã cho NK Dựa vào ảnh điện di , lựa chọn hai khuẩn lạc 11A và 5E Các vector tái tổ hợp hai khuẩn lạc này kí hiệu là pCDNA 3-NK1-11 và pEGFP -N1-NK1-5 Chúng tách chiết hai loại plasmid tái tổ hợp để giải trinh̀ tư.C̣ 3.2.3 Giải trình tự gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 vector biểu Để khẳng định có mặt cDNA-NK1 vector biểu hiện, hai vector biểu hiêṇ pCDNA3-NK1-11 và peGFP -N1-NK1-5 đươcC̣ giải trinh ̀ tư C̣ m ột chiều từ đầu 5’ đoạn chèn NK1 mồi vector Kết quảgiải trinh̀ tư C̣cDNA-NK1 hai tC̣ hống vector biểu hiêṇ cho thấy 750 bp phía đầu 5’ cDNA-NK1 khơng cóbất kỳsư sC̣ khác nào so vơi trinh tư C̣cDNA gớc vector tách dịng pNK1-3 Điều đo chưng to ̉́ ̉̀ đã thành công việc thiết kế vector bi chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 người Việt Nam KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Với kết thu đưa kết luận sau: Tách dịng thành cơng cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin – phổi người Việt Nam cDNA-NK1 có kích thước 1338 bp có nucleotide (ở vị trí 184, 333, 370, 641, 996) khơng giớng với trình tự cDNANK1 ngân hang liệu, chứng tỏ đa hình gen mã cho thụ thể NK1 người Việt Nam Thiết kế thành công vector biểu pCDNA3 và pEGFP-N1 mang cDNA mã cho thụ thể NK1 phân lập từ phổi người Việt Nam KIẾN NGHỊ Chuyển nhiễm vector biểu pCDNA3 và pEGFP-N1 mang cDNA-NK1 vào hệ thống tế bào động vật để biểu thụ thể neurokinin – TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Võ Thị Thương Lan (2004), Sinh học phân tử, Nhà xuất Đại học Quốc gia, Hà Nội Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở di truyền học phân tử tế bào, NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội Tiếng Anh Almeida T A., Rojo J., Nieto P M., Pinto F M., Hernandez M., Martín J D., Candenas M L (2004), “Tachykinins and tachykinin receptors: structure and activity relationships”, Bentham Science Publishers, 11, pp 2045-2081 Alberts B., Johnson A., Lewis J., et al (2002), Molecular Biology of the Cell 4th edition, New York: Garland Science Baker S J., Morris J L., Gibbins I L (2003), “Cloning of a C-terminally truncated NK-1 receptor from guinea-pig nervous system”, Brain Res Mol Brain Res., 11(1-2), pp 136-47 Berger M (2012), “The Role of Neurokinin-1 Receptor in the Microenvironment of Inflammation and Cancer”, The Scientific World Journal, 2012, pp 381434 Bonner T I., Affolter H U., Young A C., Young W S (1987), “A cDNA encoding the precursor of the rat neuropeptide, neurokinin B”, Brain Res,388, pp 243–249 Boot J D., de Haas S., Tarasevych S., et al (2007), "Effect of an NK1/NK2 receptor antagonist on airway responses and inflammation to allergen in asthma", Am J Respir Crit Care Med., 175(5), pp 450–457 Buck S H., Burcher E., Shults C W., Lovenberg W., O'Donohue T L (1984), “Novel pharmacology of substance K-binding sites: a third type of tachykinin receptor”, Science, 226(4677), pp 987–989 10 Buck S H., Helke C J., Burcher E., Shults C W., O'Donohue T L (1986), “Pharmacologic characterization and autoradiographic distribution of binding sites for iodinated tachykinins in the rat central nervous system”, Peptides, 7(6), pp 1109-1120 11 Caberlotto L., Hurd Y L., Murdock P., Wahlin J P., Melotto S., Corsi M., Carletti R.(2003), “Neurokinin receptor and relative abundance of the short and long isoforms in the human brain”, Eur J Neurosci, 17(9), pp 1736-1746 12 Carter M S., Krause J E (1990), "Structure, expression, and some regulatory mechanisms of the rat preprotachykinin gene encoding substance P, neurokinin A, neuropeptide K, and neuropeptide gamma", J Neurosci., 10(7), pp 2203–2214 13 Chamindi S., Nassima A D., Jennie Z M., Guobo C., Bankole A J., Ming D L (2009), “Susceptibility locus in neurokinin-1 receptor gene associated with alcohol dependence”, Neuropsychopharmacology, 34(11), pp 2442– 2449 14 Chang M M., Leeman S E (1970), “Isolation of a sialagogic peptide from bovine hypothalamic tissue and its characterization as substance P.”, J Biol Chem, 245, pp 4784–4790 15 Cinzia S., Giovanna I., Giuliana F E., Severo S.,Vittorio E (2002), “The Tachykinin Peptide Family”, Pharmacological Reviews, 54(2), pp 285- 322 16 Cao Y Q., Mantyh P W., Carlson E J., Gillespie A J., Basbaum A I (1998), “Primary afferent tachykin experience moderate to intense pain”, Nature, 392(6674) 17 CreutzfeldtW (1996), “Carcinoid tumors: development of our knowledge”, World J Surg, 20, pp 13126–13143 18 De Felipe C., Herrero J F., O'Brien J A., Palmer J A., Doyle C A., Smith A J., Laird J M., Belmonte C., Cervero F., Hunt S P (1998), “Altered nociception, analgesia and aggression in mice lacking the receptor for substance P”, Nature., 392(6674), pp 394-397 19 Erspamer V (1949), “Ricerche preliminari sulla moschatina”, Experientia, 5, pp 79 20 Erspamer V (1994), “Bioactive secretions of the integument in Amphibian Biology I The Integuments, eds Heatwole H., Barthalmus G T., Surrey Beatty & Sons, Chipping Norton, NSW, Australia, pp 178–350 21 Euler U S., Gaddum J H (1931), “An unidentified depressor substance in certain tissue extracts”, J Physiol., 72(1), pp 74–87 22 Fong T M., Anderson S A., Yu H., Huang R R., Strader C D (1992), “Differential activation of intracellular effector by two isoforms of human neurokinin-1 receptor”, Mol Pharmacol, 41(1), pp 24-30 23 Gerard N P., Eddy R L J., Shows T B., Gerard C (1990), “The human neurokinin A (substance K) receptor Molecular cloning of the gene, chromosome localization, and isolation of cDNA from tracheal and gastric t issues”, J Biol Chem, 265(33), pp 20455-20462 24 Gerard N P., Garraway L A., Eddy R L., Shows T B, (1991), “Human substance P receptor (NK-1): organization of the gene, chromosome localization and functional expression of cDNA clones”, Biochemistry, 30(44), pp 10640-10646 25 Groneberg D A., Harrison S., Dinh Q T., Geppetti P., Fischer A (2006), "Tachykinins in the respiratory tract", Curr Drug Targets, 7(8), pp 1005– 1010 26 Guard S., WatsonS P (1991), “Tachykinin receptor types: classification and membrane signaling mechanism”, Neurochem Int, 18, pp 149–165 27 Ho W Z., Lai J P., Zhu X H., Uvaydova M., Douglas S D (1997), “Human monocytes and macrophages express substance P and neurokinin- receptor”, Journal of Immunology, 159, pp 5654–5660 28 Hopkins B P., Steven J D., Petra B., Ian G., Alexander (1991), “Isolation and characterisation of the human lung NK-1 receptor cDNA”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 180(2), pp 11101117 29 Hurowitz E H., Melnyk J M., Chen Y J., Kouros-Mehr H., Simon M.I., Shizuya H (2000), "Genomic characterization of the human heterotrimeric G protein alpha, beta, and gamma subunit genes", DNA Res, 7(2), pp 111–120 30 Jian P L., Saien L., Florin T., Morris F T., Laurie E K., Susan E L., Steven D D (2008), “Differences in the length of the carboxyl terminus mediate function properties of neurokinin-1 receptor”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105 (34), pp 1260512610) 31 Kangawa K., Minamino N., Fukuda A., Matsuo H (1983), “Neuromedin K: a novel mammalian tachykinin identified in porcine spinal cord”, Biochem Biophys Res Commun., 114(2), pp 533-540 32 Kathryn E M., Catherine D S., Tung M F (1994), “Expression and solubilization of a recombinant human neurokinin-1 receptor in insect cells”, Journal of receptor research, 14(1), pp 63-73 33 Kimura S., Goto K., Ogawa T., Sugita Y., Kanazawa (1984), “Pharmacological characterization of novel mamamlian tachykinin, neurokinin alpha and neurokimin beta”, Neuroscience Research, 2, pp 97104 34 Marcinkiewicz N., Seidah N G., Chretien M (1993), “Les convertases des prohormones et le systéme nerveus”, Médecine/Science (Wash DC), 9, pp 553–561 35 Nakajima Y., Tsuchida K., NegishiM., Ito S., Nakanishi S (1992), “Direct linkage of three tachykinin receptors to stimulation of both phosphatidylinositol hydrolysis and cyclic AMP cascades in transfected Chinese hamster ovary cells”, J Biol Chem, 267, pp 2437–2442 36 Nakanishi S (1987), “Substance P precursor and kininogen: their structures, gene organizations and regulation”, Physiol Rev, 67, pp 1117– 1142 37 Nawa H., Kotani H., Nakanishi S (1984), “Tissue-specific generation of two preprotachykinin mRNAs from one gene by alternative RNA splicing”, Nature (Lond), 312, pp 729–734 38 Oka Y., Saraiva L R., Kwan Y Y., Korsching S I (2009), “The fifth class of G alpha proteins”, Proc Natl Acad Sci USA, 106(5), pp 1484-1489 39 Page N M (2004), “Hemokinins and endokinins”, Cell Mol Life Sci, 61, pp 1652-1663 40 41 Pernow B (1983), “Substance P”, Pharmacol Rev, 35(2), pp 85-141 Rosso M., Mu˜noz M (2006), "Pharmacology Guide: In vitro pharmacology: concentration-response curves.", GlaxoWellcome 42 Quartara L.; Maggi C A (1997), "The tachykinin NK1 receptor Part I: Ligands and mechanisms of cellular activation", Neuropeptides, 31(6), pp 537–563 43 Rogers M P., Blackburn L (2010), “Use of neurokinin-1 receptor antagonists in patients receiving moderately or highly emetogenic chemotherapy”, Clin J Oncol Nurs., 14(4), pp 500-504 44 Rupnipak M J N, Kramer M S, (2002), “Substance P and related tachykinins”, Neuropsychopharmacology: The Fifth Generation of Progress, pp 169 – 177 45 Severini C., Salvadori S., Guerrini R., Falconieri-Erspamer G., Mignogna G., ErspamerV (2000), “Parallel bioassay of 39 tachykinins on 11 smooth muscle preparations Structure and receptor selectivity/affinity relationship”, Peptides, 21, pp 1587–1595 46 Spiegel A M (1987), “Signal transduction by guanine nucleotide binding proteins”, Mol Cell Endocrinol, 49(1), pp 1-16 47 Steiner D F., Smeekens S P., Ohagi S., Chan S J (1992), “The new enzymology of precursor processing endoproteases”, J Biol Chem,267, pp 23435–23438 48 Steven D D Kenvin G L, Jian P L (2008), “Neurokinin-1 receptor mARN expression diffirences in brains of HIV-infected individuals”, Journal of the neurological sciences, 272(1-2), pp 174-177 49 Stratowa C., Machat H., Burger E., Himmler A., Schafer R., Spevak W., Weyer U., Wiche-Castanon M., Czernilofsky A P (1995), “Functional characterization of the human neurokinin receptor NK1, NK2, NK3 based on a cellular assay system”, J of receptor and signal transduction research, 15(1-4), pp 617-630 50 Studer R., Trzeciak A., Lergier W (1973), “Isolierung und Aminosauren Sequenz von Substanz P aus Pferdedarm”, Helv Chim Acta, 56, pp 860– 866 51 Tae H J., Mathis G., Inhae J (1998) “G protein – coupled receptors”, The Journal of Biological Chemistry, 273(28), pp 17299-17302 52 Vassilatis D K., Hohmann J G., Zeng H., Li F., Ranchalis J E., Mortrud M T., Brown A., Rodriguez S S., Weller J R., Wright A C., Bergmann J E., Gaitanaris G A., (2003), “The G protein-coupled receptor repertoires of human and mouse”, PNAS, 100, pp 4903–4908 53 Wettschureck N., Offermanns S (2005), "Mammalian G proteins and their cell type specific functions", Physiol Rev., 85(4), pp 1159–204 54 Yu Z., Liwei L., Caren F., Gillian E W., Christopher J P (2000), “Hemokinin is a hematopoietic-specific tachykinin that regulates B lymphopoiesis”, Nature Immunology, 1, pp 392 – 397 55 Zimmer A., Zimmer A M., Baffi J., Usdin T., Reynolds K., König M., Palkovits M., Mezey E (1998), “Hypoalgesia in mice with a targeted deletion of the tachykinin gene”, Proc Natl Acad Sci USA., 95(5), pp 26302635 Trang web 56 http://gpcr.scripps.edu/ 57 http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1994/pr ess.html 62 58 http://www.uniprot.org/uniprot/P25 59 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M81797.1 60 http://themedicalbiochemistrypage.org/signal-transduction.php 61 http://pharmrev.aspetjournals.org/content/54/2/285/T5.expansion.ht the neurokinin-1 receptor www.pnas.org ... hành đề tài ? ?Tách dòng thiết kế vector biểu gen mã hóa cho thụ thể neurokinin – người Việt Nam? ?? 1. 5 VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ- 1 Gen mã hóa cho thụ thể liên kết với G protein... hóa cho thụ thể neurokinin- 1 3 .1. 5 Tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin- 1 3 .1. 6 Giải trình tự cDNA hịan chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 3.2 THIẾT KẾ VECTOR. .. protein 11 1. 2 HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ .14 1. 3 THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ- 1 18 1. 3 .1 Giới thiệu chung thụ thể họ tachykinin 18 1. 3.2 Thụ thể neurokinin –