Phân tích đa dạng di truyền mất đoạn APOBEC3B và nguy cơ bị ung thư vú ở người việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Bùi Thị Thu Anh PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MẤT ĐOẠN APOBEC3B VÀ NGUY CƠ BỊ UNG THƢ VÚ Ở NGƢỜI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Bùi Thị Thu Anh PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MẤT ĐOẠN APOBEC3B VÀ NGUY CƠ BỊ UNG THƢ VÚ Ở NGƢỜI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS VÕ THỊ THƢƠNG LAN Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt luận văn này, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn PGS TS Võ Thị Thương Lan, ln tận tình giúp đỡ bảo em thí nghiệm, gặp vấn đề định hướng giúp em làm thí nghiệm cách độc lập Cô dạy dỗ em thí nghiệm mà cịn giúp em biết cách trình bày luận văn phân tích báo khoa học Cô dạy dỗ em biết cách cư xử với người nguyên tắc ứng xử xã hội Cô nhà giáo mà em quý mến muốn học hỏi thêm nhiều điều từ cô Em xin gửi lời cảm ơn đến Ths Tạ Bích Thuận, cô người an ủi động viên em em gặp khó khăn, nhờ có mà giây phút căng thẳng làm thí nghiệm trở nên nhẹ nhàng Cơ giúp em có thêm nhiều động lực để hoàn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến Phịng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Bệnh viện K Hà Nội, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương Bệnh viện Nhi Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tốt luận văn Tiếp đến em xin cảm ơn Ths Ngô Thị Hà, Hv Nguyễn Thùy Ngân bảo giúp đỡ em tận tình q trình thí nghiệm xin gửi lời cảm ơn tới Hv Nguyễn Minh Khôi, em Nguyễn Thị Thanh Phịng thí nghiệm Sinh Y giúp đỡ chia sẻ khó khăn giúp em hoàn thành luận văn Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn đến với gia đình, bạn bè ln bên cạnh động viên nguồn động lực lớn giúp em vượt qua khó khăn cơng việc Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm Học viên Bùi Thị Thu Anh Luận văn thạc sĩ khoa học Viết tắt bp CGH CNV Ct DCIS DD DNA dNTPs EDTA HW ID IDC II ILC kb LCIS Mb MLPA mRNA NAHR Luận văn thạc sĩ khoa học OD OR PCR SNP ssDNA TBE TNM TD-PCR UDG UTR ZD-CDAs : Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng cho nghiên cứu Bảng 2.2 Thành phần điều kiện tối ƣu phản ứng PCR Bảng 3.1 Điều kiện phản ứng PCR ban đầu Bảng 3.2 Tổng hợp kiểu gen đoạn APOBEC3B nhóm mẫu Bảng 3.3 Kết kiểm tra cân HW nhóm đối chứng Bảng 3.4 Kết kiểm tra cân HW nhóm bệnh nhân thalassemia Bảng 3.5 Kết phân tích đa dạng đoạn APOBEC3B với nguy ung thƣ vú Bảng 3.6 Số lƣợng mẫu nghiên cứu số cơng bố Bảng 3.7 Kết phân tích đa dạng đoạn APOBEC3B với nguy mắc bệnh di truyền thalassemia Bảng 3.8 Liên hệ đa dạng đoạn APOBEC3B với số lâm sàng ung thƣ vú Bảng 3.9 Sự thay đổi đa dạng đoạn APOBEC3B cặp ung thƣ vú liền kề Bảng 3.10 Xu hƣớng thay đổi đa dạng đoạn APOBEC3B cặp ung thƣ vú liền kề Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Hình 1.1 Đặc điểm họ gen APOBEC3 ngƣời Hình 1.2 Mối liên hệ APOBEC3A với ung thƣ Hình 1.3 Vai trị APOBEC3B tiến trình ung thƣ Hình 1.4 Tái tổ hợp tƣơng đồng khơng alen (NAHR) hình thành CNVs Hình 1.5 Mất đoạn hình thành hai gen APOBEC3A APOBEC3B nằm nhiễm sắc thể 22 Hình 1.6 Phân bố tần suất alen đoạn APOBEC3B số nơi giới Hình 1.7 Tình hình ung thƣ vú giới Việt Nam năm 2018 Hình 1.8 Độ mơ học ung thƣ vú Hình 1.9 Các bƣớc phƣơng pháp MLPA Hình 1.10 Vị trí đầu dị mồi kỹ thuật MLPA phát đa dạng đoạn APOBEC3B Hình 1.11 Phƣơng pháp phát sản phẩm realtime-PCR Hình 1.12 Vị trí mồi xác định đa dạng đoạn APOBEC3B kỹ thuật PCR Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu Hình 3.1 Kết điện di DNA tổng số số mẫu Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm Hình 3.2 Kết phản ứng PCR Hình 3.3 Kết tối ƣu tăng nhiệt độ gắn mồi phản ứng PCR Hình 3.4 Kết PCR kiểm tra đa dạng đoạn APOBEC3B bệnh phẩm ung thƣ vú Hình 3.5 Kết tối ƣu điều kiện phản ứng PCR Hình 3.6 Kết so sánh trình tự đoạn gen 490 bp khuếch đại cặp mồi Ins-F Ins-R với ngân hàng gen NCBI Hình 3.7 Kết so sánh trình tự đoạn gen 700 bp khuếch đại mồi DelF Del-R với ngân hàng gen NCBI Hình 3.8 Vị trí xảy đa dạng đoạn APOBEC3B đoạn gen 700 bp khuếch đại mồi Del-F Del-R Hình 3.9 Kết kiểm tra đa dạng đoạn APOBEC3B nhóm mẫu Hình 3.10 Biểu đồ thể tỷ suất nguy (OR) đa dạng đoạn APOBEC3B với ung thƣ vú Hình 3.11 Sự phân bố số ca mắc ung thƣ vú tần suất alen đoạn APOBEC3B giới Hình 3.12 Biểu đồ tần suất alen đoạn APOBEC3B nghiên cứu ung thƣ vú Hình 3.13 Biểu đồ thể đặc điểm phân bố nhóm tuổi, độ mơ học, giai đoạn ung thƣ vú kích thƣớc u bệnh nhân ung thƣ vú Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Họ gen APOBEC3 .2 1.1.1 Đặc điểm họ gen APOBEC3 1.1.2 Mối liên hệ họ gen APOBEC3 với ung thƣ 1.2 Vai trò gen APOBEC3A APOBEC3B ung thƣ 1.3 Đa dạng di truyền .9 1.3.1 Đa dạng số (Copy Number Variation - CNV) .9 1.3.2 Đa dạng đoạn APOBEC3B nguy ung thƣ vú 12 1.4 Tổng quan ung thƣ vú 15 1.4.1 Tình hình ung thƣ vú 15 1.4.2 Phân loại ung thƣ vú 16 1.4.3 Độ mô học ung thƣ vú 18 1.4.4 Các giai đoạn ung thƣ vú 18 1.4.5 Các yếu tố tăng nguy ung thƣ vú 20 1.5 Phƣơng pháp xác định đa dạng đoạn APOBEC3B 21 1.5.1 Phƣơng pháp MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) 21 1.5.2 Phƣơng pháp PCR định lƣợng (Realtime-PCR) 23 1.5.3 Phƣơng pháp PCR 25 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu 27 2.2 Hóa chất thiết bị 27 2.2.1 Hóa chất 27 2.2.2 Thiết bị 28 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 28 Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm 2.3.2 Phƣơng pháp tách DNA tổng số 29 2.3.3 Phƣơng pháp PCR 30 2.3.4 Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR 30 2.3.5 Phƣơng pháp điện di 31 2.3.6 Phƣơng pháp đo mật độ quang học 31 2.3.7 Phƣơng pháp phân tích thống kê 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .34 3.1 Tách chiết, kiểm tra chất lƣợng, nồng độ DNA tổng số 34 3.2 Tối ƣu điều kiện phản ứng PCR 35 3.3 Giải trình tự sản phẩm PCR 39 3.4 Xác định đa dạng đoạn APOBEC3B 42 3.5 Kiểm tra cân Hardy-Weinberg 44 3.5.1 Kiểm tra cân Hardy-Weinberg nhóm đối chứng .44 3.5.2 Kiểm tra cân Hardy-Weinberg nhóm bệnh di truyền thalassemia .46 3.6 Phân tích đa dạng đoạn APOBEC3B 47 3.6.1 Đa dạng đoạn APOBEC3B với nguy mắc ung thƣ vú phụ nữ Việt Nam 47 3.6.2 Đa dạng đoạn APOBEC3B với nguy mắc bệnh di truyền thalassemia .50 3.7 Tần suất alen đoạn APOBEC3B ngƣời Việt Nam 51 3.8 Mối liên hệ đa dạng đoạn APOBEC3B với thông số mô bệnh học, giai đoạn ung thƣ vú nhóm tuổi 53 3.9 Sự khác biệt đa dạng đoạn APOBEC3B mẫu ung thƣ vú mẫu liền kề (U - L) 55 KẾT LUẬN 59 KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 261 L261 ID 262 L262 ID 263 L263 ID 264 L264 ID 265 L265 ID 266 L266 ID 267 L267 ID Luận văn thạc sĩ khoa học 268 L268 ID 269 L269 ID 270 L270 ID 271 L271 ID 272 L272 II 273 L273 DD 274 L274 ID 275 L275 ID 276 L276 ID 277 L277 ID 278 L278 ID 279 L279 ID 280 L280 ID 281 L281 ID 282 L282 ID 283 L283 ID 284 L284 ID 285 L285 II 286 L286 ID 287 L287 ID 288 L288 ID 289 L289 ID 290 L290 ID 291 L291 ID 292 L292 ID Luận văn thạc sĩ khoa học 293 L293 ID 294 L294 ID 295 L295 II 296 L296 ID 297 L297 ID 298 L298 II 299 L299 II 300 L300 ID Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm PHỤ LỤC Thông tin mẫu máu ngƣời khám sức khỏe ngƣời tình nguyện STT Ký hiệu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Luận văn thạc sĩ khoa học 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 M34 M35 M36 M37 M38 M39 M40 M41 M42 M43 M44 M45 M46 M47 M48 M49 M50 M51 M52 M53 M54 M55 M56 M57 M58 M59 M60 M61 M62 M63 M64 M65 M66 M67 M68 M69 M70 Luận văn thạc sĩ khoa học 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 Luận văn thạc sĩ khoa học 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 M108 M109 M110 M111 M112 M113 M114 M115 M116 M117 M118 M119 M120 M121 M122 M123 M124 M125 M126 M127 M128 M129 M130 M131 M132 M133 M134 M135 M136 M137 M138 M139 M140 M141 M142 M143 M144 M145 Luận văn thạc sĩ khoa học 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 M146 M147 M148 M149 M150 M151 M152 M153 M154 M155 M156 M157 M158 M159 M160 M161 M162 M163 M164 M165 M166 M167 M168 M169 M170 M171 M172 M173 M174 M175 M176 M177 M178 M179 M180 M181 M182 M183 M184 Luận văn thạc sĩ khoa học 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 M185 M186 M187 M188 M189 M190 M191 M192 M193 M194 M195 M196 M197 M198 M199 M200 M201 M202 M203 M204 M205 M206 M207 M208 M209 M210 M211 M212 M213 M214 M215 M216 M217 M218 M219 M220 M221 Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm PHỤ LỤC Danh sách mẫu máu bệnh nhân thalassemia cung cấp Viện Huyết học - Truyền máu Trung ƣơng STT Ký hiệu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20 T21 T22 T23 T24 T25 T26 T27 T28 T29 T30 T31 T32 T33 Luận văn thạc sĩ khoa học 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 T34 T35 T36 T37 T38 T39 T40 T41 T42 T43 T44 T45 T46 T47 T48 T49 T50 T51 T52 T53 T54 T55 T56 T57 T58 T59 T60 T61 T62 Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm PHỤ LỤC Quy trình tách DNA tổng số sử dụng kit PureLink® Genomic DNA (Invitrogen) DNA đƣợc tách chiết từ mẫu mô bệnh nhân ung thƣ vú sử dụng kit ® PureLink Genomic DNA (Invitrogen) Quy trình gồm bƣớc nhƣ sau:  Cân khoảng 25 mg mẫu mô, cắt nhuyễn  Thêm 180 µL Digestion Buffer 20 µL Proteinase K trộn o  Ủ 55 C qua đêm, 15-20 phút trộn mẫu lần, trộn khoảng 4-5 lần trƣớc để mẫu qua đêm  Ly tâm 12 000 vòng/phút phút, chuyển dịch sang ống eppendorf  Thêm 20 µL RNase A, trộn đều, ủ phút nhiệt độ phịng  Thêm 200 µL Lysis Binding trộn  Thêm 200 µL Ethanol 99%, dùng pipet trộn  Chuyển dịch lên cột, ly tâm 12 000 vòng/phút phút  Chuyển cột sang ống thu thêm 500 µL Wash Buffer 1, ly tâm 12 000 vòng/phút phút  Chuyển cột lên ống thu thêm 500 µL Wash Buffer 2, ly tâm 12 000 vòng/phút phút nhiệt độ phòng  Đặt cột lên ống eppendorf 1,5 ml Thêm 100 µL Elution Buffer ủ nhiệt độ phòng phút  Ly tâm 13 000 vòng/phút phút, thu đƣợc DNA tổng số Bảo quản -20 o C Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm PHỤ LỤC Quy trình tách DNA tổng số sử dụng kit ReliaprepTM Blood gDNA MiniPrep System (Promega) DNA đƣợc tách chiết từ mẫu máu ngƣời bệnh thalassemia kit Reliaprep TM Blood gDNA MiniPrep System (Promega) Quy trình gồm bƣớc nhƣ sau:  Mẫu máu đƣợc trộn nhẹ nhàng 10 phút  Chia 20 µL Proteinase K vào ống eppendorf 1,5 ml  Thêm 200 µL máu vào ống o  Thêm 200 µL Cell Lysis Buffer, trộn ủ 10 phút 56 C  Bổ sung 250 µL Binding Buffer, trộn  Chuyển hỗn hợp lên cột Ly tâm với tốc độ 13 000 vòng/phút phút  Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml Bổ sung 500 µL dung dịch Column Wash Ly tâm với tốc độ 13 000 vòng/phút phút, bỏ dịch Lặp lại bƣớc lần  Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml Thêm 200 µL Elution Buffer, ly tâm tốc độ 13 000 vòng/phút phút Thu dịch chứa DNA Bảo quản o dịch chứa DNA -20 C Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm PHỤ LỤC Quy trình tinh sản phẩm PCR sử dụng ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Sản phẩm PCR đƣợc tinh ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent gồm bƣớc:  Cho µL sản phẩm PCR vào ống eppendorf 1,5 ml  Bổ sung µL ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent vào ống trộn o  Ủ hỗn hợp 37 C 15 phút để enzyme phân giải dNTPs mồi thừa phản ứng PCR o  Ủ hỗn hợp 80 C 15 phút để bất hoạt enzyme Sản phẩm tinh sau đƣợc sử dụng để giải trình tự trực tiếp ... ? ?Phân tích đa dạng di truyền đoạn APOBEC3B nguy bị ung thư vú người Việt Nam? ?? nhằm mục tiêu: (1) Đánh giá liên hệ đa đạng di truyền đoạn APOBEC3B nguy ung thƣ vú; (2) Xác định tần suất alen đoạn. .. Việt Nam chƣa có nghiên cứu công bố đa dạng đoạn APOBE3B nhƣ mối liên hệ với ung thƣ vú Vì vậy, chúng tơi thực đề tài: ? ?Phân tích đa dạng di truyền đoạn APOBEC3B nguy bị ung thư vú người Việt Nam? ??... tăng nguy ung thƣ vú gấp lần [57] Nhƣ đề cập đa dạng di truyền đoạn APOBEC3B nguy? ?n nhân tăng nguy ung thƣ vú 1.5 Phƣơng pháp xác định đa dạng đoạn APOBEC3B Đa dạng đoạn APOBEC3B đƣợc phát vào