Phân tích đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa ưu tú (NSC69 NSC93) bằng chỉ thị phân tử SSR

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ------------------------- NGUYỄN THANH HOA PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN GIỐNG LÚA ƢU TÚ (NSC69 - NSC93) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Di truyền học Hà Nội - 2015 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Khuất Hữu Trung đã dành nhiều thời gian,tâm huyết chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận. Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành đến ThS. Kiều Thị Dung đã dành rất nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn kĩ thuật, cung cấp thông tin và tài liệu bổ ích giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi xin trân trọng gửi lời cám ơn đến các cán bộ Bộ môn kĩ thuật di truyền – Viện Di truyền nông nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cám ơn các thầy giáo, cô giáo trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình giảng dạy và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt 4 năm học qua. Lời cuối, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia đình đã luôn ở bên tôi, chăm sóc, động viên tôi và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Hà Nôi, ngày 7 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thanh Hoa LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận này hoàn toàn được thực hiện bằng sự tìm hiểu nghiên cứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn của TS. Khuất Hữu Trung – Viện Di truyền nông nghiệp Việt Nam. Các nội dung nghiên cứu và kết quả được trình bày trong luận văn này là trung thực, không sao chép bất cứ tài liệu, công trình nghiên cứu của người khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội đồng và nhà trường. Hà Nội, ngày 7 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thanh Hoa MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài ........................................................................................ 1 2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................. 2 3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................. 3 NỘI DUNG ....................................................................................................... 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ............................... 4 1.1. Nguồn gốc, phân loại và giá trị kinh tế của cây lúa.............................. 4 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại cây lúa............................................................. 4 1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lúa ở Việt Nam ............................................. 11 1.2. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới và trong nƣớc ..................... 11 1.2.1. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới ........................................... 11 1.2.2. Tình hình sản xuất lúa gạo ở nước ta ............................................... 13 1.3. Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền ......................... 16 1.4. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền lúa trên thế giới và ở Việt Nam.............................................................................................................. 19 1.4.1. Trên thế giới .................................................................................... 19 1.4.2. Ở Việt Nam ...................................................................................... 21 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................................ 24 2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................... 27 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số ................................................................... 27 2.2.2. Phản ứng PCR ................................................................................. 28 2.2.3. Chu trình PCR ................................................................................. 28 2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR ....................................................... 28 2.2.5. Phân tích và xử lý số liệu ................................................................ 29 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 31 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số .......................................................... 31 3.2. Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử SSR trong phân tích đa dạng di truyền ........................................................................................................... 32 3.2.1 . Hệ số PIC, số allele và tổng số băng DNA thể hiện trên từng cặp mồi ............................................................................................................ 32 3.2.2. Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) và tỷ lệ dị hợp tử (H%) của 25 giống lúa nghiên cứu ................................................................................................. 33 3.2.3 Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của 25 giống lúa nghiên cứu ........................................................................................... 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. 43 DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH Danh mục bảng Bảng 1.1. Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa .......... 4 Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lượng lúa ở nước ta qua các năm ........... 13 Bảng 1.3. Xuất khẩu gạo của Việt Nam sang châu Phi, Tây Á, Nam Á năm 2014. Đơn vị: USD........................................................................................... 14 Bảng 1.4. Giá gạo xuất khẩu của Việt Nam so với Thái Lan (USD/tấn) ………16 Bảng 2.1. Danh sách 25 giống lúa nghiên cứu .................................................. 24 Bảng 2.2. Thông tin về các cặp mồi trong nghiên cứu………………………... 25 Bảng 2.3. Chu trình chạy PCR – SSR............................................................... 28 Bảng 2.4. Thành phần gel polyacrylamide ........................................................ 29 Bảng 3.1. Số allele thể hiện và hệ số PIC của 30 cặp mồi SSR ......................... 33 Bảng 3.2. Tỷ lệ di hợp tử (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của các dòng lúa nghiên cứu ........................................................................................ 35 Bảng 3.3. Hệ số tương đồng di truyền giữa 25 mẫu giống lúa nghiên cứu ........ 40 Danh mục hình Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số của 25 mẫu giống lúa nghiên cứu ............. 31 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 25 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi PTA248 (M: marker1kb) ............................................................ 36 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm SSR – PCR của 25 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM212 (M: marker 20bp) .................................................... 37 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm SSR – PCR của 25 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM7102 (M: marker 20bp) .................................................. 37 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm SSR – PCR của 25 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM19429 (M: marker 20bp) ................................................ 38 Hình 3.6. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa 25 giống lúa nghiên cứu ........................................................................................................ 39 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ARN: Acid ribonucleic CTAB: Cetyl trimetyl amonium bromit DNA: Acid deoxyribonucleic dNTP: Dideoxyribo nucleozit triphosphat EtBr: Ethidium Bromide IRRI: International Research Rice Institute PCR: Polymerase chain reaction PIC: Polymorphic Information Content QTL: Quantitative trait loci RAPD: Random amplyfied polymorphic DNA SDS: Sodium dodecyl sunphate SSR: Simple sequence repeats TE: Tris EDTA MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Lúa gạo là cây lương thực lâu đời nhất được trồng ở nhiều nơi trên thế giới. Diện tích gieo trồng của lúa gạo đứng thứ hai sau lúa mì, tổng sản lượng lúa đứng thứ ba sau lúa mì và ngô. Lúa gạo là nguồn lương thực quan trọng cho khoảng 2/3 dân số trên thế giới, vì thế lúa trở thành cây lương thực chính và quan trọng được con người tiêu thụ và ưa chuộng nhiều nhất. Hiện nay, diện tích trồng lúa chiếm trên 1/10 diện tích đất trồng trên thế giới và có 15 nước trên thế giới trồng lúa với diện tích lớn hơn 1 triệu ha, trong đó có tới 13 nước ở Châu Á. Riêng Trung Quốc và Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa và 56% sản lượng lúa toàn cầu. Bangladesh, Indonexia, Thái Lan mỗi nước đều có diện tích trồng lúa lớn hơn tổng diện tích trồng lúa của tất cả các nước Mĩ La tinh. Ở nước ta, lúa là loại cây trồng quan trọng nhất, vừa là nguồn lương thực chủ yếu, vừa là nông sản có kim ngạch xuất khẩu lớn nhất hiện nay. Trong những năm gần đây, nước ta đã có những bước tiến vượt bậc về sản xuất lúa gạo, mang lại nhiều lợi ích cho người sản xuất và cho xuất khẩu nhờ vào việc sử dụng các giống lúa có năng suất cao cùng với việc thâm canh tăng vụ. Năng suất và sản lượng lúa của nước ta không ngừng tăng lên, theo Tổng cục thống kê: năm 1990 năng suất lúa đạt 31,8 tạ/ha với tổng sản lượng 19,2 triệu tấn; năm 2000: 42,4 tạ/ha, tổng sản lượng 32,5 triệu tấn. Sản lượng lúa cả năm 2013 ước tính đạt 44,076 triệu tấn, tăng 1,677 triệu tấn so với năm 2012, diện tích gieo trồng năm 2013 ước tính đạt 7 899,4 nghìn ha [7]. Tuy nhiên, do thị hiếu tiêu dùng của con người đòi hỏi ngày càng cao về chất lượng của lúa gạo. Sự phát triển các giống lúa có năng suất, chất lượng, kháng được sâu bệnh và điều kiên bất lợi là một trong những mục tiêu được chú trọng trong 1 các chương trình phát triển ngày nay. Chính vì vậy, việc thu thập và phân tích nguồn gen của tập đoàn các dòng/giống lúa ưu tú để nhằm khai thác nguồn gen ưu thế của các dòng lúa ưu tú giúp nâng cao năng suất và chất lượng đáp ứng kịp với nhu cầu sản xuất và tiêu dùng. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân tích đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa ưu tú (NSC69 – NSC93) bằng chỉ thị phân tử SSR”. 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các dòng/giống lúa nghiên cứu, xác định các allele đặc trưng, allele hiếm để nhận dạng chính xác các nguồn gen phục vụ nghiên cứu chọn, lai tạo giống và định hướng phát triển giống lúa năng suất và chất lượng cao. Sản phẩm của đề tài là cơ sở để tiến hành các nghiên cứu về di truyền, chức năng gen, kết hợp với các chỉ tiêu về sinh lý, sinh hóa, trao đổi chất, nhằm bảo tồn và chọn tạo các giống có năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường để sẵn sàng ứng phó với biến đổi khí hậu, góp phần nâng cao thu nhập cho người nông dân. 3. Nội dung nghiên cứu - Tách chiết và tinh sạch DNA các mẫu thu thập. - Chạy phản ứng PCR – SSR với mồi SSR trên các nhiễm sắc thể khác nhau. - Điện di kiểm tra sản phẩm PCR. - Xử lý kết quả thu được. 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Đánh giá đa dạng di truyền của các nguồn gen lúa năng suất cao tạo cơ sở cho việc chọn lọc các nguồn gen lúa chất lượng ưu tú phục vụ cho nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa năng suất cao ở mức phân tử. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Phát hiện sai khác di truyền của các giống lúa năng suất cao có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định các allele hiếm, allele đặc trưng để nhận dạng chính xác các nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu phục tráng và lai tạo giống lúa năng suất cao. 3 NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. Nguồn gốc, phân loại và giá trị kinh tế của cây lúa 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại cây lúa  Phân loại cây lúa Trên Trái Đất này chỉ có người dân châu Á và châu Phi biết thuần dưỡng lúa dại thành lúa trồng hiện nay, đó là lúa châu Á (Oryza sativa) và lúa châu Phi (Oryza glaberrima) có hai nguồn gốc, phát triển cũng như phân phối riêng biệt. Tùy theo khí hậu, cây lúa châu Á được chia ra thành 3 nhóm khác nhau: lúa Indica ở vùng nhiệt đới, lúa Japonica (hay Sinica) ở vùng ôn đới và Javanica (còn gọi Japonica nhiệt đới) ở Indonesia là trung gian giữa 2 thứ lúa kia. Những đặc tính hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa được nêu trong bảng 1.1. Bảng 1.1. Đặc trƣng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa Đặc INDICA tính Thân - Thân cao Chồi - Nở bụi mạnh Lá JAVANICA - Thân cao trung bình - Nở bụi thấp - Lá rộng, xanh - Lá rộng, cứng, nhạt xanh nhạt 4 JAPONICA - Thân thấp - Nở bụi trung bình - Lá hẹp, xanh đậm - Hạt thon dài, dẹp - Hạt hầu như không có đuôi Hạt - Trấu ít lông và lông ngắn - Hạt dễ rụng Sinh học - Hạt tròn, ngắn - Hạt to, dầy - Hạt không có đuôi hoặc có đuôi dài - Trấu có lông dài - Ít rụng hạt - Hạt không đuôi tới có đuôi dài - Trấu có lông dài và dầy - Ít rụng hạt -Tính quang cảm - Tính quang cảm rất - Tính quang cảm rất rất thay đổi yếu thay đổi Nguồn: Chang, 1985 [9] Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae (họ Hòa Thảo), phụ họ Pryzoideae, tộc Oryzae, dòng Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima. Loài Oryza sativa là lúa trồng ở châu Á và Oryza glaberrima lúa trồng ở châu Phi. Bên cạnh đó còn có hơn 20 loài lúa dại sống rải rác trên thế giới như ở Đông Nam Á, Nam Á, châu Úc, New Guinea, châu Phi, Trung và Nam Mỹ. Sự xếp loại cho cây lúa trải qua một thời gian hơn 200 năm, với rất nhiều tranh luận giữa các nhà nghiên cứu vì không có hệ thống xếp loại thống nhất. Do vậy, nhiều loài lúa dại được xếp cùng tên hoặc lẫn lộn nhau, tùy theo các nhà nghiên cứu, ngoại trừ hai loài lúa trồng (sativa và glaberrima) và 7 loài lúa dại (australiensis, eichingeri, latifolia, minuta, schlechteri, ridleyi và brachyantha) (Nayar, 1973). Chẳng hạn, loài spontanea và perennis được xem như rất gần với lúa trồng sativa, nên có tên thay đổi rất thường: loài oryza dưới dạng spontanea, hàng niên, xem như một loài độc lập O. fatua hay O. sativa var. fatua hoặc O. rufipogon (Sampath, 1962). Loài đa niên O. perennis được xem như O. rufipogon Griff và loài hàng niên như O. nivara Sharma et Shastry. Vào năm 1753, ông Lineaeus - người đầu tiên đã mô tả và xếp loài lúa sativa trong dòng Oryza. Pilger (1915) tìm được và mô tả loài thứ hai, 5 schlechteri từ mẫu thu thập được bởi Schlechter vào năm 1907 ở miền bắc Tân Guinea. Bà Prodoehl (1922) đã viết bản thảo chi tiết cho giống lúa này và 17 loài được mô tả khá chi tiết. Sau đó, dòng Oryza được đặc biệt quan tâm đến với rất nhiều chi tiết bởi một số nhà nghiên cứu như: Chatterjee (1948), Sharma và Shastry (1965, 1971), Sharma (1973) và Nayar (1973). Trong đó, ông Morinaga (1943, 1954) là người đầu tiên đã sử dụng kĩ thuật phân tích genome để định danh các loài lúa dại. Công trình nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học này (sự tiếp hợp của các nhiễm sắc thể giống nhau) đã giúp phân tích các loài lúa chính xác hơn.  Nguồn gốc cây lúa Trên thế giới có hai loại lúa trồng: lúa châu Á và lúa châu Phi. Cây lúa châu Á hiện chiếm ưu thế trong khâu sản xuất, tiêu thụ và thị trường thế giới vì năng suất cao gấp 2 – 3 lần lúa châu Phi. Nguồn gốc và phân phối của cây lúa châu Á khó có thể xác định rõ ràng vì cây lúa được con người thuần dưỡng và canh tác từ thời tiền sử. Nguồn gốc của cây lúa trồng là đề tài tranh luận sôi nổi từ lâu, xuất phát từ hai nước: Trung Quốc và Ấn Độ. Mãi đến thập niên 1950, các nghiên cứu mới có cơ sở vững chắc hơn khi kĩ thuật di truyền tế bào được áp dụng. Địa điểm nguồn gốc xuất phát cây lúa trồng đầu tiên phải có đủ 4 tiêu chuẩn sau: (i) Tổ tiên trực tiếp của cây lúa hay lúa dại phải hiện diện hoặc đã xuất hiện ở nơi đó. (ii) Di chỉ khảo cổ xác nhận cây lúa đã được trồng ở nơi đó. (iii) Sự hiện diện loài nguyên thủy của cây lúa trồng. (iv) Biến đổi di truyền giữa lúa trồng và lúa dại phải khác biệt ở nơi đó. 6 Có nhiều giả thuyết về nguồn gốc của cây lúa trồng hiện nay, nhưng một cách tổng thể, 4 giả thuyết sau đây được các nhà khảo cứu đề cập đến nhiều nhất: nguồn gốc Trung Quốc, Ấn Độ, Đông Nam Á và đa trung tâm. a. Giả thuyết nguồn gốc Trung Quốc Vào năm 1882, de Candolle đã dựa vào tài liệu của Bretschneider và Stanislav Julien đề cập về một nghi lễ tôn giáo đặt ra bởi hoàng đế Thần Nông (2800 – 2700 trước Công Nguyên – CN) và cho rằng cây lúa trồng xuất hiện ở Trung Quốc sớm hơn Ấn Độ. Trong nghi lễ này, hoàng đế và các quan cao cấp đã gieo 5 loại hạt: lúa, khoai ngọt, lúa mì và hai loại hạt kê. Do đó, ông de Candolle và nhiều người khác cho rằng các loại hạt giống trên xuất xứ từ Trung Quốc. Ông Ting (1949) đề nghị rằng cây lúa xuất phát từ Trung Quốc, vì loại thảo mộc này đã được nói đến lần đầu tiên trong văn học dưới thời Thần Nông (3000 trước CN) và trong thời đại hoàng đế Nghiêu, Thuấn (2600 – 2200 trước CN). Ting cho biết hạt lúa và lá lúa được tìm thấy trong cuộc khai quật Yan-shao 2600 trước CN và cũng tìm thấy bộ xương có khắc đặc tính cây lúa. Ông cũng báo cáo đã tìm được mày lúa và hạt lúa ở địa điểm khai quật cách Uckan 150km trong vùng thung lũng sông Hoàng Hà. Ông cho rằng hạt lúa có liên hệ với “O. sativa f. spontanea ssp. Keng Ting”. Hạt lúa có chiều dài 6,97mm và chiều rộng 3,47mm với mày có lông, hạt có đuôi. Các di vật khác cũng được báo cáo ở thiên niên kỷ thứ III và IV trước CN. Mẫu lúa trồng cổ nhất thuộc loại Indica được tìm thấy ở cuộc khai quật tại Ho-mu-tu, phía đông Trung Quốc vào niên đại 5008  117 trước CN hay cách nay khoảng 7.000 năm. b. Giả thuyết nguồn gốc Ấn Độ Ông Watt (1892) viết rất nhiều sách về lúa, đã tìm thấy vài loài lúa dại ở India như rufipogon (đa niên) và Porterssia coarctata. Lúa gạo cũng được 7 sử dụng trong nhiều nghi lễ ở xứ này. Vậy nên, ông kết luận rằng cây lúa trồng có thể xuất phát từ bán đảo Ấn Độ và lan rộng đến các nơi khác. Ramiah và Ghose (1961) ủng hộ lý thuyết của Watt. Cây lúa đến Trung Quốc vào khoảng 3000 trước CN từ Nam Á và Đông Nam Á. Ở Ấn Độ, di vật lâu đời của lúa được tìm thấy ở vỏ trấu trộn với đất sét (vật dụng kiến trúc) tại Lothal (Quận Ahmedabad, Gujarat) có niên đại 2300 trước CN. Mười một mẫu lúa trên 2.000 năm đã được tìm thấy ở nhiều nơi và được báo cáo ở Ấn Độ. c. Giả thuyết nguồn gốc vùng núi Đông Nam Á Trong vùng Đông Nam Á gồm cả Việt Nam, còn rất ít công cuộc khai quật trên diện tích rộng lớn để nghiên cứu so với các hoạt động khảo cổ qui mô tại hai quốc gia lớn là Trung Quốc và Ấn Độ. Cho nên, các giả thuyết và công cuộc khảo cổ học của vùng này chưa có nhiều tiếng vang để tạo sức thuyết phục trước các nhà khảo cổ học khác trên thế giới. Ngoài ra, trong thiên niên kỷ từ VI đến X các vùng đồng bằng trũng thấp ở ven biển Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương bị biển tiến xâm nhập có lúc lên đến 5m trên mực nước biển hiện nay nên làm ngập lụt, cuốn trôi nhiều di vật trong thời gian 4.000 năm đó. Trong thế kỷ XX, nhiều nhà nghiên cứu đưa ra giả thuyết về nguồn gốc cây lúa trồng ở vùng Đông Nam Á, bên cạnh giả thuyết về Trung Quốc và Ấn Độ. Ông Moringa (1972) nêu giả thuyết rằng cây lúa có thể bắt nguồn từ vùng núi non và thung lũng Đông Nam Á hơn là từ Ấn Độ, vì nhiều nền văn hóa cổ xưa xuất phát từ vùng núi non này. Sau khi lai giống giữa những giống lúa ở chân núi Hymalaya như Nepal, Bhutan và Shikkimu với các giống lúa ở 6 vùng sinh thái như: japonica ở vùng ôn đới; aus (hè – thu), boro (đông – xuân), aman (mùa) ở vịnh Bengal; tjereh và bulu (javanica) ở Indonesia, ông 8 suy đoán rằng lúa trồng xuất phát từ miền đông nam chân núi Hymalaya và phát tán đến 6 vùng sinh thái trên. Lúa aus, boro, aman và tjereh thuộc nhóm lúa Indica. Ông Chang (1976), sau khi quan sát 34.000 giống lúa thế giới ở ngân hàng gen của IRRI, nhận thấy rằng có biến đổi rộng lớn trong các đặc tính và sinh thái của các giống lúa thu thập ở vùng núi non Đông Nam Á, gồm có: Nepal, Shikkim, Ấn Độ, Bangladesh, bắc Myanmar, bắc Thái Lan, bắc Lào và tây nam Trung Quốc. Ông Nakagahra (1976) căn cứ trên nghiên cứu về sự phân bố của 12 loại lúa isozymes từ các vùng khác nhau ở châu Á, nhận thấy có biến đổi lớn của các giống lúa từ Ấn Độ đến Lào và cho rằng nguồn gốc cây lúa trồng ở vùng núi non Đông Nam Á như Myanmar, Thái Lan và Vân Nam của Trung Quốc. d. Giả thuyết đa trung tâm Thông thường công tác nghiên cứu về địa danh và thời gian của nguồn gốc cây lúa căn cứ trên các di chỉ khảo cổ, lịch sử, ngôn ngữ học và chứng cứ thực vật học. Tuy nhiên, nếu chỉ căn cứ vào một vài sự kiện mà kết luận thì không thể chính xác và khoa học, do các nguyên nhân sau đây: (i) Căn cứ vào nghi lễ gieo lúa xa xưa ở Trung Quốc để kết luận về nguồn gốc của cây lúa bắt nguồn từ nước này thì không được chuẩn xác, vì các hạt giống này có thể xuất xứ từ các nơi khác hơn Trung Quốc. Ví dụ: cây lúa mì được biết xuất phát từ Trung Đông. (ii) Di tích khảo cổ được sử dụng nhiều nhất trong quá khứ cho các nghiên cứu về nguồn gốc thảo mộc. Tuy nhiên, các vùng có khí hậu ấm áp và ẩm ướt như Đông Nam Á với khí hậu gió mùa rất khó giữ được các mẫu di vật khảo cổ lâu dài, so với các vùng có khí hậu ôn đới hoặc lạnh và khô hơn như châu thổ sông Hoàng Hà, Trung 9 Quốc. Nếu chỉ căn cứ vào niên đại của các di vật khảo cổ tìm được, khả năng ước đoán về nguồn gốc có thể sai lầm lớn. Chẳng hạn, trong năm 2003, Đại Hàn khám phá nhiều hạt gạo cháy ở tỉnh Chungbuk có niên đại phóng xạ khoảng 15.000 năm (IRC, 2003), nhưng nước này không thể là trung tâm nguồn gốc của cây lúa trồng châu Á. (iii) Ngoài ra, các tranh luận nêu trên thường căn cứ trên số lượng mẫu lúa nghiên cứu còn rất giới hạn. (iv) Sự khác biệt tên lúa dại của loài O. sativa có thể gây ra các suy đoán nhầm lẫn. Các mẫu lúa dại thật sự không còn nữa vì do sự lai giống thiên (v) nhiên giữa các loại lúa trồng và các loại lúa dại hàng niên. (vi) Không áp dụng các biện pháp tổng hợp trong công việc nghiên cứu. Do đó, ông Chang (1985), chuyên gia di truyền lúa của IRRI, xem xét lại tất cả tin liệu và các dữ kiện từ khoa học, khảo cổ, sinh học tiến hóa, hệ thống sinh học và lịch sử nông nghiệp để đưa ra kết luận rằng: lúa trồng ở châu Á có thể bắt nguồn từ nhiều địa điểm một cách độc lập và đồng bộ vì những nơi này hiện có nhiều loài lúa dại và lúa trồng cùng sống trong một môi trường. Những địa điểm này khởi đầu từ đồng bằng sông Ganges đến miền bắc Myanmar, miền đông bắc Thái Lan, bắc Lào, bắc Việt Nam, miền nam và tây nam Trung Quốc và những vùng lân cận khác. Tại Việt Nam, lúa dại rất phong phú và hiện diện rải rác khắp lãnh thổ từ miền Bắc đến miền Trung và miền Nam. Lúa dại đa niên O. rufipogon và lúa dại hàng niên O. Nivara là những loài nguyên thủy, tổ tiên của các giống lúa trồng ngày nay Indica và Japonica, đã hiện diện lâu đời ở nước ta. Đó là một trong những yếu tố quan trọng xác nhận cây lúa có nguồn gốc ở Việt Nam. 10 1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lúa ở Việt Nam Lúa là cây lương thực quan trọng thứ 2 trên thế giới sau cây ngô (Bùi Mạnh Cường, 2007), được gieo trồng ở 112 nước, cung cấp lương thực cho hơn 65% dân số thế giới. Ở nước ta, lúa gạo được sử dụng trong hầu hết các bữa ăn của người dân. Trong 30 năm trở lại đây sản xuất lúa gạo đã có bước tăng trưởng mạnh (70%). Năm 2011, nước ta đã xuất khẩu 7,35 triệu tấn gạo mang về 3,5 tỉ USD cho nền kinh tế quốc dân và đứng thứ 2 thế giới (sau Thái Lan). Cây lúa đã góp phần giúp giải quyết tình trạng thiếu đói và hiện nay là bảo đảm an ninh lương thực trong nước. Ngoài ra, những phụ phẩm của cây lúa như rơm rạ, trấu, cám…đã được ứng dụng trong chăn nuôi và trồng trọt, làm phân bón, chất đốt giúp làm giảm các chi phí trong sản xuất nông nghiệp và bảo vệ môi trường. 1.2. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới và trong nƣớc 1.2.1. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới Lúa gạo được xem là cây lương thực quan trọng cho khoảng 50% dân số thế giới, hiện nay khi dân số thế giới tiếp tục tăng đồng nghĩa với việc diện tích dùng cho trồng lúa ngày càng bị thu hẹp lại. Chính vì vậy vấn đề an ninh lương thực ngày càng trở nên quan trọng với bất kì quốc gia nào trên thế giới. Cây lúa được gieo trồng trong khoảng 30 vĩ độ Bắc và 40 vĩ độ Nam gồm khoảng 150 quốc gia trồng lúa với diện tích gieo trồng khoảng 150 triệu ha, được trồng ở nhiều châu lục như: châu Á, châu Phi, Nam Mỹ…Cây lúa có tầm quan trọng to lớn trong nền kinh tế của nhiều quốc gia trên thế giới nên việc đẩy mạnh sản xuất lúa được thúc đẩy mạnh mẽ cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật. Vì vậy, năng suất lúa của thế giới trong thời gian qua đã tăng lên nhanh chóng: từ 24,5 tạ/ha năm 1976 lên 38,27 tạ/ha năm 1997 và 11 tăng lên 40,04 tạ/ha năm 2005, đến năm 2010 là 43,73 tạ/ha còn về sản lượng lúa thì liên tục tăng với nhịp độ khá nhanh, sản lượng lúa năm 2004 so với năm 2002 tăng 28,64 triệu tấn. Theo dự đoán của các chuyên gia dân số thế giới đến năm 2030 thì dân số thế giới sẽ đạt 8,47 tỉ người, với tốc độ tăng dân số nhanh như vậy thì vấn đề an ninh lương thực luôn là một vấn đề nóng và cấp bách hàng đầu. Châu Á là vùng có số dân cư đông và cũng là vùng có diện tích trồng lúa cao nhất 134 triệu ha, sản lượng đạt 477,267 triệu tấn, năng suất bình quân đạt 36 tạ/ha (chiếm 90% lượng gạo thế giới). Châu Âu tuy có diện tích trồng lúa nước thấp nhất nhưng năng suất bình quân lại cao hơn các châu lục khác. Ở đầu thập niên 90 sản lượng thóc đã tăng 78 – 80% có nước tăng gấp đôi, nhờ có việc lai tạo được nhiều giống lúa mới có năng suất cao và kĩ thuật canh tác hiện đại. Tuy vậy nhưng ở một số nước vẫn còn tình trạng thiếu lương thực. Châu Phi được biết đến là một châu lục có khí hậu khắc nghiệt, có nhiều thiên tai do vậy mà sản lượng lương thực thường bị giảm sút dẫn đến nạn đói xảy ra thường xuyên, sản lượng lương thực bình quân đầu người của châu lục này rất thấp. Với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật thì một số nước có nền nông nghiệp lạc hậu, thiếu đói triền miên nay đã vươn lên trở thành nước xuất khẩu gạo lớn trên thế giới. Nhưng việc sản xuất lúa chưa hẳn đã đồng đều giữa các châu lục và giữa các quốc gia, nhiều nước do nền khoa học chưa phát triển hay điều kiện tự nhiên không thuận lợi làm cho năng suất và sản lượng lúa chưa được cao, chưa đáp ứng được nhu cầu trong nước mà phải nhập khẩu gạo từ các nước khác. 12 1.2.2. Tình hình sản xuất lúa gạo ở nước ta Trước năm 1975, diện tích trồng lúa cả nước ta dao động trong khoảng 4,42 – 4,92 triệu ha, năng suất có tăng nhưng chậm, chỉ khoảng 700 kg/ha chỉ trong vòng 20 năm sản lượng lúa cả hai miền trên dưới 10 triệu tấn. Sau năm 1975, diện tích trồng lúa tăng khá nhanh và ổn định nhưng năng suất bình quân giảm sút khá nghiêm trọng do đất đai mới khai hoang chưa qua cải tạo, thêm vào đó là thiên tai và sâu bệnh, cơ chế quản lí nông nghiệp theo hướng không phù hợp. (Bảng 1.2). Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lƣợng lúa ở nƣớc ta qua các năm Năm Diện tích (triệu ha) 1955 4,42 1960 4,60 1965 4,83 1970 4,72 1975 4,94 1980 5,54 1985 5,70 1990 5,96 1995 6,77 2000 7,67 2005 7,33 2010 7,51 2013 7,89 Nguồn: tổng cục thống kê VN 13 Bước sang năm 1980, năng suất lúa tăng dần do đã khắc phục được những nguyên nhân trên như: thay đổi cơ chế quản lý nông nghiệp bằng chủ trương khoán sản phẩm trong sản xuất, cải thiện hệ thống kênh mương…Sau những nỗ lực khắc phục khó khăn nước ta đã đạt được những thành tựu to lớn. Từ một nước phải nhập khẩu gạo hàng năm thì nay chúng ta đã tự túc được lương thực và đang dần dần tái hoà nhập vào thị trường lương thực thế giới, chiếm lĩnh ngay vị trí quan trọng là nước xuất khẩu gạo đứng thứ 3 rồi hàng thứ 2 trên thế giới sau Thái Lan. Từ năm 1997 cho đến nay, hằng năm nước ta xuất khẩu trung bình trên dưới 4 triệu tấn gạo, đem về một nguồn thu nhập ngoại tệ đáng kể. Hiện nay, Việt Nam đứng hàng thứ 6 về diện tích gieo trồng và đứng thứ 5 về sản lượng lúa. Hạt gạo Việt chẳng những đảm bảo được yêu cầu về an ninh lương thực trong nước mà còn góp phần quan trọng trong thị trường lúa gạo thế giới. Trong những năm qua, gạo xuất khẩu của nước ta tăng trưởng về số lượng và chất lượng cũng như mở rộng thị trường. Đến nay, ngoài các thị trường truyền thống như Iraq, Iran (Trung Đông), thị trường châu Á (Indonesia, Philippine), Việt Nam đã mở rộng và phát triển thêm một số thị trường tiềm năng ở các nước châu Phi, Mỹ La tinh, v.v…(Bảng 1.3). Bảng 1.3. Xuất khẩu gạo của Việt Nam sang châu Phi, Tây Á, Nam Á năm 2014. Đơn vị: USD Thị trƣờng 2014 2013 (+/-%) Châu Phi 425.704.677 775.839.817 -45 Ghana 177.860.875 182.801.079 -3 Bờ Biển Ngà 104.916.670 228.456.297 -54 Mozambique 20.039.314 29.789.300 -33 Nam Phi 17.327.655 14.393.322 +20 14 Algeria 15.810.543 39.933.942 -60 Senegal 15.244.278 17.463.168 -13 Benin 13.210.524 15.612.476 -15 Tanzania 9.558.434 16.107.609 -41 Cameroon 9.198.889 60.860.700 -85 Công-gô 8.766.325 5.967.750 +47 Angola 7.142.763 48.720.312 -85 Gabon 6.696.179 16.609.896 -60 Tây Á 38.847.409 36.007.726 +8 UAE 17.023.462 12.102.878 +41 Ả-rập Xê-út 7.960.938 7.426.895 +7 I-xra-en 4.868.292 5.878.689 -17 Ca-ta 3.455.259 1.481.569 +133 Jordan 3.010.524 2.628.741 +15 Nam Á 949.154 64.260 +1.377 Pakistan 810.935 16.500 +4.815 Sri Lanka 138.219 47.760 +189 Về giá cả của gạo Việt Nam cũng đã dần được nâng lên tương đương với gạo của Thái Lan, vào cùng một thời điểm và cấp loại gạo. Điều này cho thấy, chất lượng gạo và quan hệ thị trường của gạo Việt nam đã có sức cạnh tranh ngang với gạo Thái Lan trên thị trường thế giới (Bảng 1.4). Tại Việt Nam, 9 tháng đầu năm 2014 so với cùng kỳ năm 2013, giá chào bán gạo xuất khẩu loại 5% tấm phổ biến ở mức 370 – 465 USD/tấn, tăng 25 – 45 USD/tấn; giá chào bán gạo xuất khẩu loại 25% tấm phổ biến ở mức 360 – 410 USD/tấn, tăng 15 – 35 USD/tấn. Cụ thể: ĐVT: USD/tấn. 15 Bảng 1.4. Giá gạo xuất khẩu của Việt Nam so với Thái Lan (USD/tấn) Tháng Gạo 5% tấm Gạo 25% tấm Thái Lan Việt Nam Thái Lan Việt Nam Tháng 1/2014 420 – 440 415 – 430 380 – 400 385 – 395 Tháng 2/2014 420 – 440 385 – 405 380 – 400 375 – 380 Tháng 3/2014 413 – 430 370 – 400 365 – 390 360 – 375 Tháng 4/2014 390 – 400 380 – 395 355 – 365 360 – 375 Tháng 5/2014 380 – 395 385 – 410 355 – 365 370 – 375 Tháng 6/2014 370 – 400 395 – 410 350 – 360 360 – 370 Tháng 7/2014 375 – 435 405 – 465 350 – 360 365 – 410 Tháng 8/2014 430 – 445 420 – 460 360 – 400 390 – 410 Tháng 9/2014 430 – 435 445 – 450 400 – 405 400 – 410 370 – 445 370 – 465 350 – 400 360 – 410 420 – 575 355 – 420 410 – 560 325 – 395 9 tháng đầu năm 2014 9 tháng đầu năm 2013 9T/2014 so với 9T/2013 Giảm 50 – 130 Tăng 25 – 45 Giảm 60 – 160 Tăng 15 – 35 Nguồn Cục quản lý giá, Bộ tài chính 1.3. Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) Phản ứng chuỗi polymerase do Mullis PK phát minh năm 1985 và ông đã được trao giải thưởng Nobel về hoá học năm 1993 cho phát minh này. Đây là phương pháp in vitro để nhân bội nhanh một đoạn DNA nào đó mà chỉ cần một lượng mẫu ban đầu rất nhỏ. PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme để nhân 16 bội một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotit tương hợp với hai đầu 3' ở cả hai mạch của đoạn DNA đích (Lê Duy Thành, 2001). Hiện nay có rất nhiều chỉ thị DNA dựa trên PCR đang được áp dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng phổ biến nhất là chỉ thị SSR. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat): Trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền, chỉ thị SSR là một trong những chỉ thị được dùng phổ biến nhất bởi kỹ thuật đơn giản và cho độ chính xác cao. SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự DNA đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ gồm 1 – 6bp (Litt and Luty, 1998). Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn. Thông thường có các kiểu lặp lại: + Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau. +Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotide khác. + Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau. Thông thường các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể như vùng tâm động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hoà phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật. Bản chất đa hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Sự khác nhau về độ dài ở locus SSR được phát hiện bởi sự nhân đoạn DNA nhờ phản ứng PCR. Kích thước của sản phẩm PCR được 17 xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel argose hoặc gel polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp). Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền của cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở cây lúa, lập bản đồ, nghiên cứu locus tính trạng số lượng (QTL). Ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR: Thuận lợi to lớn của sự phân tích SSR là phương pháp này biểu hiện được số lượng lớn sự đa hình, có khả năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locus được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trong các thí nghiệm dòng chảy gel, xác định cây trồng và phân tích mối quan hệ di truyền. SSR được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong nghiên cứu cấu trúc di truyền của lúa trồng O. sativa, nghiên cứu quá trình tiến hoá, làm rõ độ thuần của vật liệu lai tạo giống… do đây là chỉ thị đồng trội cho đa hình cao và ổn định. Hiện nay, hơn 15.000 chỉ thị SSR đã được thiết lập [6], phủ kín trên bản đồ liên kết di truyền của lúa (Giarrocco và ctv, 2007). Trong những năm gần đây, nhiều công trình sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền và DNA fingerprinting để nhận dạng giống lúa được công bố (Kalyan và ctv, 2006). Đã có khoảng 2740 chỉ thị SSR cho toàn bộ gen lúa và như vậy trung bình cứ 157kp của phân tử DNA có một chỉ thị SSR. SSR là maker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định trong quá trình thực nghiệm. Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép toán di truyền quần thể dựa trên những marker này so với những marker khác như RAPD. Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy 18 gel trở nên dễ dàng hơn. SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá các vật liệu di truyền và dùng trong quá trình thiết lập bản đồ di truyền. Hạn chế của kỹ thuật SSR là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi loại primer chỉ đặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau. 1.4. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền lúa trên thế giới và ở Việt Nam 1.4.1. Trên thế giới Tác giả Victoria và cộng sự (2007) tiến hành nghiên cứu đa dạng trên 24 giống lúa ở Philippin có chất lượng tốt bằng 164 chỉ thị SSR. Trong số 164 chỉ thị SSR có 151 chỉ thị cho đa hình với tổng số allele thu được là 890 và trung bình 5,89 allele/locus. Trong đó, có 89 chỉ thị cho 147 allele hiếm. Hệ số đa dạng di truyền PIC từ 0,18 – 0,91 đạt trung bình 0,68/chỉ thị. Theo kết quả phân tích UPGMA, ở độ tương đồng 40%, tổng số 24 giống lúa được chia thành ba nhóm: Nhóm 1 gồm 8 giống Japonica, nhóm 2 và 3 là các giống lúa Indica. Nghiên cứu này cho ta thấy việc sử dụng chỉ thị SSR là rất hiệu quả trong phân nhóm các loài phụ của lúa, những giống lúa có chất lượng tốt thì thường có khoảng cách di truyền cao hơn và vì thế chúng là nguồn vật liệu cho công tác chọn giống. Tác giả Malik Ashiq (2010), đã tiến hành đánh giá đa dạng di truyền giữa các giống lúa truyền thống và giống lúa đã được cải tiến ở Pakistan. Nghiên cứu thực hiện trên hai giống lúa Basmati thơm và không thơm thuộc nhóm lúa Indica. Tổng số 41 dòng được đưa vào đánh giá bởi 30 marker SSR được phân bố trên khắp bộ gen của lúa. Kết quả phân tích thu được tổng số 104 allele và tất cả đều đa hình, hệ số allele dao động 2 – 6 allele, trung bình là 3,5 allele/marker, hệ số PIC dao 19 động từ 0,259 – 0,782 (trung bình là 0,571). Sau khi số liệu được phân tích bằng phần mềm UPGMA, 41 giống lúa đã được chia thành 2 nhóm chính: Nhóm I gồm có 22 giống (15 giống lúa thơm Basmati và 5 giống không thơm, hai giống lúa Japonica). Nhóm II bao gồm 19 giống lúa không thơm. Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy rằng các marker SSR có thể được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền và chỉ ra sự khác biệt giữa giống lúa Basmati thơm và giống lúa Basmati không thơm. Hơn nữa, việc xác định giống lúa Basmati truyền thống dựa vào marker SSR có thể giúp ích cho việc duy trì và bảo tồn các giống lúa có chất lượng cao vì lợi ích của cả người nông dân và người tiêu dùng. Theo Shahid Masood Shah (2013), sử dụng marker phân tử đánh giá đa dạng di truyền của 40 giống lúa thơm và không thơm bằng chỉ thị SSR, 40 giống lúa này được đánh giá bởi 24 mồi. Kết quả cho thấy có tổng cộng 66 allele và hệ số allele dao động từ 2 – 4, trung bình là 2,75 allele/marker, hệ số PIC dao động từ 0,4250 (RM252) đến 0,9750 (RM315). Hệ số PIC trung bình của 24 cặp mồi nghiên cứu trên 40 giống lúa là 0,6472. Kết quả phân tích đa dạng di truyền với hệ số tương đồng, 40 giống lúa được chia thành 3 nhóm khác biệt. Kết quả này được sử dụng hữu ích cho việc theo dõi, xác định kiểu gen và bảo vệ giống lúa. Harsh Bansal (2013), sử dụng chỉ thị phân tử đánh giá đa dạng di truyền của 20 giống lúa (được thu thập từ phòng di truyền học, Viện nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ) bằng chỉ thị RAPD và chỉ thị SSR. Sử dụng 20 mồi RAPD thu được 116 băng trong đó có 114 băng đa hình. Sản phẩm sau khi khuếch đại thu được 4 – 7 băng, trung bình 5,8 băng/marker, hệ số PIC dao động từ 0,33 – 0,88. Sử dụng 20 mồi SSR tạo ra 65 allele, trung bình 3,2 allele/marker, hệ số PIC dao động từ 0,62 – 0,97. Kết quả phân tích hệ số tương đồng di truyền được chia thành hai nhóm là Nhóm I và nhóm II (được 20 chia thành 2 nhóm phụ: Nhóm phụ I: gồm 17 giống trong khi nhóm phụ II: Gồm có 2 giống). Dựa vào những kết quả được tạo ra từ nghiên cứu này được sử dụng để tối ưu hóa để lựa chọn bố mẹ đa dạng và mở rộng cơ sở giống cây cho các chương trình nhân giống lúa trong tương lai. 1.4.2. Ở Việt Nam Việt Nam được xem là một trong những trung tâm khởi nguyên của cây lúa, tài nguyên di truyền lúa của nước ta được đánh giá là phong phú cả về số lượng và chất lượng. Các công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền và phân loại một cách hệ thống lúa trồng ở Việt Nam còn hạn chế. Tuy vậy, trong những năm gần đây các nhà khoa học đã rất quan tâm đến vấn đề đánh giá đa dạng tài nguyên lúa để phục vụ cho việc lai tạo ra các giống mới có chất lượng và khả năng chống chịu bệnh. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của 101 giống lúa địa phương bằng 9 locus thuộc 5 enzymes. Kết quả cho thấy, trong số các giống thu từ huyện Nho Quan, Ninh Bình và huyện Đà Bắc, Hoà Bình thì có 44 giống (chiếm 43,6%) thuộc lúa Indica và 57 giống (56,4%) thuộc lúa Japonica (Trần Danh Sửu, 2004). Năm 2004, Nguyễn Đức Thành đã sử dụng 9 mồi RAPD (OPB8, OPB9, OPB11, OPB12, OPB13, OPC4, OPC6, OPC19, 0PC20) chạy PCR với DNA genome của 15 dòng lúa thu được 341 băng đa hình. Trong đó dòng Japonica thể hiện sự khác nhau rất rõ đối với các dòng Indica còn lại. Do đó hệ số tương đồng rất thấp ở mức độ 0,03. Các dòng Indica có hệ số có hệ số tương đồng di truyền là 0,35. Dựa vào các kết quả của thí nghiệm trên có thể thiết lập được các cặp lai cho ưu thế lai cao phục vụ cho công tác chọn tạo giống. Năm 2010, tác giả Khuất Hữu Trung và Nguyễn Thị Phương Đoài đã sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn nguồn gen lúa 21 Tám đặc sản bản địa của Việt Nam. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy tập đoàn lúa Tám nghiên cứu khá đa dạng: phân tích 36 cặp mồi SSR trên 26 giống lúa Tám thu được tổng số 938 băng DNA thuộc 88 loại allele khác nhau (trung bình 2,44 allele/cặp mồi). Hệ số PIC dao động từ 0 đến 0,65 (trung bình 0,27). Các giống lúa Tám nghiên cứu có độ thuần di truyền khá cao, tỉ lệ dị hợp tử trung bình của cả tập đoàn là 0,86. Hệ số tương đồng di truyền của các giống trong tập đoàn nghiên cứu dao động trong khoảng 0,14 – 1,00. Ở mức tương đồng di truyền 40%, tập đoàn 26 giống lúa Tám được chia thành 3 nhóm lớn. Trong đó, hai giống Tám Nghĩa Hồng và Tám con có kiểu gen giống nhau ở cả 36 locus nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu rất có ý nghĩa phục vụ công tác nghiên cứu lai, chọn tạo giống lúa chất lượng (Khuất Hữu Trung, Nguyễn Thị Phương Đoài, 2010). Tiếp đó, Khuất Hữu Trung và cộng sự cũng đã sử dụng 29 cặp mồi SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn 27 nguồn gen lúa nếp, lúa nương bản địa ở Việt Nam. Kết quả thu được 96 loại allele, hệ số PIC dao động từ 0 đến 0,808. Trong số 96 allele thu được, xuất hiện 8 allele hiếm (trung bình 0,27 allele hiếm trên mỗi locus) ở 5 cặp mồi khác nhau: cặp mồi RM241 xác định được 3 allele hiếm nhân dạng được các giống Ka tiêu, Plẩu tâu đằng dạng 2 và Nếp cẩm đen; cặp mồi RM229 xác định được 2 allele hiếm nhận dạng được giống Nếp lùn và Kháu căm pị; các cặp mồi RM13, RM172 và RM318, xác định được 1 allele hiếm trên mỗi locus nhận dạng được các giống Lia tón, Tan lanh và Nếp cẩm tương ứng. Các kết quả thu được rất hữu ích trong việc xác định nguồn gen phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng có hiệu quả các nguồn gen lúa nếp, lúa nương của Việt Nam (Khuất Hữu Trung và cs., 2010). Năm 2012, Vũ Thị Thu Hiền và Phạm Văn Cường đã phân tích đa dạng di truyền của 64 dòng/giống lúa đang canh tác trong điều kiện nhờ nước trời 22 thông qua sự có mặt và mức độ đa hình của các chỉ thị phân tử SSR. Bằng việc sử dụng 34 chỉ thị phân tử SSR, có 8 chỉ thị không cho xuất hiện vạch ở tất cả các dòng/giống và 2 chỉ thị xuất hiện vạch đơn hình. Hai mươi tư chỉ thị còn lại xuất hiện đa hình với tổng số 90 allen chiếm tỷ lệ trung bình 3,75 allen/locus. Kết quả phân tích đa dạng di truyền với hệ số tương đồng là 0,65 đã phân chia nguồn vật liệu thành 7 nhóm chính. Số lượng lớn các dòng/giống thuộc hai nhóm có hai giống đối chứng chịu hạn là CH5 và LC93-1. Kết quả này bước đầu cho thấy các dòng/giống có khả năng chịu hạn tương tự như hai giống đối chứng thông qua biểu hiện ở cấp độ phân tử DNA. Thông tin các chỉ thị SSR đa hình giữa các dòng/giống rất có giá trị trong chọn giống lúa chịu hạn nhờ chỉ thị phân tử. 23 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu là 25 giống lúa ưu tú (NSC69 – NSC93) được cung cấp bởi công ty Giống cây trồng Trung Ương (Bảng 2.1) Bảng 2.1. Danh sách 25 giống lúa nghiên cứu STT Tên mẫu Kí hiệu mẫu STT Tên mẫu Kí hiệu mẫu 1 NSC69 S69 14 NSC82 S82 2 NSC70 S70 15 NSC83 S83 3 NSC71 S71 16 NSC84 S84 4 NSC72 S72 17 NSC85 S85 5 NSC73 S73 18 NSC86 S86 6 NSC74 S74 19 NSC87 S87 7 NSC75 S75 20 NSC88 S88 8 NSC76 S76 21 NSC89 S89 9 NSC77 S77 22 NSC90 S90 10 NSC78 S78 23 NSC91 S91 11 NSC79 S79 24 NSC92 S92 12 NSC80 S80 25 NSC93 S93 13 NSC81 S81 Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 30 cặp mồi SSR được sử dụng để phân tích thuộc các locus RM được chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng Invitrogen cung cấp dựa vào các thông tin về trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12 NST khác nhau. 24 Bảng 2.2. Thông tin về các cặp mồi trong nghiên cứu Nhiệt độ STT Tên mồi Trình tự mồi NST gắn mồi (Tm) 1 AP5659 2 RM5926 3 ARO1 4 RM21 5 RM190 6 RM208 7 RM224 8 RM247 9 RM250 10 RM585 11 RM212 12 RM3726 F: CTCCTTCAGCTGCTCCTC R: TGATGACTTCCAAACGGTAG F: AATTACTGTAGGTCCATCCA R: AGATAGTATAGCGTAGCAGC F: CATCTATCCTCCTCGGGCACA R: GGCGGCGTCATATTCCACA F: ACAGTATTCCGTAGGCACGG R: GCTCCATGAGGGTGGTAGAG F: CTTTGTCTATCTCAAGACAC R: TTGCAGATGTTCTTCCTGATG F: TCTGCAAGCCTTGTCTGATG TAAGTCGATCATTGTGTGGACC F: ATCGATCGATCTTCACGAGG R: TGCTATAAAAGGCATTCGGG F: TAGTGCCGATCGATGTAACG R: CATATGGTTTTGACAAAGCG F: GGTTCAAACCAAGCTGATCA R: GATGAAGGCCTTCCACGCAG F: CAGTCTTGCTCCGTTTGTTG R: CTGTGACTGACTTGGTCATAGG F: CCACTTTCAGCTACTACCAG R: CACCCATTTGTCTCTCATTATG F: CACACACATCGCTCGGTC R: GATGTGGAGGTCGATGGC 25 Size (bp) 6 55 330 11 55 8 55 11 55 6 55 2 55 11 55 12 55 130 2 55 154 6 55 1 55 244 12 50 193 100180 173 132157 124 166173 120152 171233 13 RM6308 14 RM13 15 RM19429 16 RM6997 17 RM8213 18 RM28561 19 Z4794 20 RM3134 21 RM216 22 RM527 23 RM1223 24 RM7102 25 RM6320 26 RM 3726 F: TCGACCTGGCTCTCCTCTAG R: TATCAACCTGCTCCTCCTGG F: TCCAACATGGCAAGAGAGAG R: GGTGGCATTCGATTCCAG F: TATGTGGTTGGCTTGCCTAGTGG R: TGCCCATATGGTCTGGATGTGC F: CAACGCGGCAGTAAATTTGC R: GGCCTTGTCAGTCTACATGC F: AGCCCAGTGATACAAAGATG R: GCGAGGAGATACCAAGAAAG F: TTCAAGACTGGCCCAATATTACTGC R: TGACTGAAGCCTTCTTCACTTGC F: CACGCCACCCTTCAATGGAGACT R: TGAATGTGAGAGGTTGACTGTGG F: GCAGGCACAAAAGCAAAGAG R: AGGTGAAGGTGCATTGTGTG F: GCATGGCCGATGGTAAAG R: TGTATAAAACCACACGGCCA F: GGCTCGATCTAGAAAATCCG R: TTGCACAGGTTGCGATAGAG F: TTCGTTTTCCTTGGTTAGTG R: TTCGTTTTCCTTGGTTAGTG F: TAGGAGTGTTTAGAGTGCCA R: TCGGTTTGCTTATACATCAG F: GAGCTGGACCTCCTCGACAC R: CATGCATCACCGAATGAGTC F: CACACACATCGCTCGGTC R: GATGTGGAGGTCGATGGC 26 3 55 104 5 55 141 6 55 4 50 154 4 55 177 12 55 259 6 55 139 3 55 178 10 55 146 6 55 11 55 175 12 55 168 5 55 164 12 50 193 180220 215221 27 RM 6506 F: GTCCTTCAGGTGATTCGCC R: GTCGCTCGAAGCCAATTAAG 28 PTA 248 F: AGACGCGGAAGGGTGGTTCCCGGA R: AGACGCGGTAATCGAAAGATGAAA 29 MP1-MP2 F: ATCGATCGATCTTCACGAGG R: TCGTATAAAAGGCATTCGGG 30 RM463 F: AGGTGAAGGTGCATTGTGTG R: TGTTCTCCTCAGTCACTGCG 8 55 11 55 8 55 12 55 219 5001000 205231 192 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số Mẫu lá của từng dòng được thu thập riêng rẽ và tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB của Obara và Kako (1998) có cải tiến. Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 600C. 1. Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn. 2. Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800l CTAB buffer và 60l SDS 10%. 3. Ủ mẫu ở 650C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút. 4. Bổ sung hỗn hợp CHCl3-IsoA (24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với dịch mẫu. Lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống mới. 5. Tiếp tục chiết lần 2 bằng hỗn hợp CHCl3-IsoA (24:1). Thu được dịch chiết chứa DNA. 6. Tủa DNA bằng isopropanol đã làm lạnh. Để ở -200C trong 1 giờ. 7. Ly tâm thu tủa 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. 27 8. Rửa tủa bằng etanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE. 9. Độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% . 2.2.2. Phản ứng PCR Tổng thể tích của phản ứng PCR là 15µl bao gồm: 1,5µl Đệm PCR 10X; 1,2µl MgCl2 25mM; 0,3µl dNTPs 10mM; 0,2µl Taq DNA polymerase 5 U/µl; 1µl mồi xuôi 10µM; 1µl mồi ngược 10µM; 1µl DNA (30 ng/µl); 3,8µl nước cất hai lần khử ion. 2.2.3. Chu trình PCR Bảng 2.3. Chu trình chạy PCR – SSR Các bƣớc I II III Nhiệt độ Thời gian (0C) 94 5 phút 94 1 phút Tm 45 giây 72 1 phút 72 7 phút Số chu kỳ 1 35 1 Giữ mẫu ở 40C 2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 6,0% và được phát hiện dưới tia cực tím bằng phương pháp nhuộm ethidium bromide. 28 Bảng 2.4. Thành phần gel polyacrylamide Nước cất khử ion 55,5ml TBE 10X 3,5ml Dung dịch acrylamide 40% 10,5ml Dung dịch APS 10% 700µl Dung dịch TEMED 58,4µl Tổng thể tích gel 70ml Trộn đều hỗn hợp các dung dịch trên và dùng xilanh bơm vào giữa hai tấm kính. + Sau 30 phút gel được polyme hoá hoàn toàn. Lắp ráp máy điện di, tiến hành điện di sản phẩm PCR cùng với thang marker 20bp ở điều kiện 150V. Thời gian điện di khoảng 3 – 4 giờ. Lấy gel ra khỏi kính, nhuộm EtBr nồng độ 0,5% trong 15 phút, rửa lại bằng nước sạch. Soi và chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh gel DigiDoc-It. 2.2.5. Phân tích và xử lý số liệu Kết quả được thống kê dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện các băng DNA (các allele). Số liệu được xử lý, phân tích bằng chương trình Exel version 5.0 và phần mềm NTSYSpc 2.1 (Rohlf FJ, 2000). - Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công thức sau: PIC =1 - Pi2 (trong đó Pi là tần số xuất hiện của allele thứ i). - Tỷ lệ dị hợp (H) của mỗi mẫu được tính theo công thức: H %  Trong đó: X M Y X: là tổng số mồi có xuất hiện 2 allele/1 locus SSR 29 M: là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu. Y: là tổng số mồi SSR không xuất hiện băng DNA. - Tỷ lệ khuyết số liệu (M) được tính bằng công thức: M %  Trong đó: Z M Z: là tổng số mồi không xuất hiện băng DNA. M: là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu. 30 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số Tách chiết axit nucleic là công việc đầu tiên đóng vai trò quan trọng trong công nghệ DNA. Nhờ tiến bộ và sự đổi mới công nghệ mà tách chiết axit nucleic ngày nay đã trở nên đơn giản. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp tách chiết DNA tổng số của mẫu thực vật. Tuy nhiên, đối với từng đối tượng nhất định cần có phương pháp riêng. Do vậy, việc lựa chọn và cải tiến phương pháp cho phù hợp với từng đối tượng là điều rất cần thiết và quan trọng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp CTAB của Obara và Kako (1998) để tiến hành tách chiết DNA tổng số của 25 mẫu lá lúa nghiên cứu. Kết quả tách chiết DNA tổng số của 25 mẫu lúa được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Hình 3.1: Ảnh điện di DNA tổng số của 25 mẫu giống lúa nghiên cứu Qua kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy các băng DNA thu được của các mẫu lúa khá gọn và đồng đều chứng tỏ chất lượng DNA của các mẫu là khá tốt, không bị lẫn tạp chất. Mặt khác không thấy xuất hiện vệt sáng ARN phía dưới, điều đó chứng tỏ ARN cũng đã được loại bỏ khỏi dịch chiết DNA. Kết quả điện di cũng cho thấy DNA có nồng độ tương đối cao, chất lượng tốt đủ tiêu chuẩn thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. 31 3.2. Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử SSR trong phân tích đa dạng di truyền Để nghiên cứu mức độ đa hình di truyền của 25 dòng lúa, chúng tôi tiến hành sử dụng sản phẩm DNA tách chiết được trên làm khuôn cho phản ứng PCR lần lượt với 25 mồi nghiên cứu. Sản phẩm PCR của từng mồi được điện di trên gel acrylamide (điện di đứng). 3.2.1 . Hệ số PIC, số allele và tổng số băng DNA thể hiện trên từng cặp mồi Theo Smith (1997), hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được coi là thước đo tính đa dạng di truyền của các allele ở từng locus SSR. Weir (1996), cho rằng, giá trị PIC có thể được hiểu như là sự đa dạng di truyền của locus gen nghiên cứu. Giá trị PIC của 30 locus nghiên cứu thay đổi từ 0,08 (ở 2 cặp mồi xuất hiện 2 allele là RM6308 và RM261) đến 0,73 (ở cặp mồi xuất hiện 4 allele là RM21). Hệ số PIC trung bình của 30 cặp mồi nghiên cứu là 0,49. Qua kết quả thu được (Bảng 3.1) chúng tôi thấy với 30 cặp mồi SSR, tổng số allele thống kê được trên 30 cặp mồi SSR là 87 loại allele, trung bình 2,90 allele/cặp mồi. - Số mồi thể hiện 5 allele: 2 mồi (RM8213, MP1-2). - Số mồi thể hiện 4 allele: 4 mồi (RM21, RM224, RM585, RM3726). - Số mồi thể hiện 3 allele: 13 mồi (AP5659, RM5926, RM13, RM208, RM247, RM250, RM6997, RM7102, RM3726, RM19429, RM28561, RM1223, RM6320). - Số mồi thể hiện 2 allele: 11 mồi (ARO1, RM190, RM212, RM6308, RM3134, RM6506, RM463, RM527, RM261, PTA248, Z4794). 32 Bảng 3.1. Số allele thể hiện và hệ số PIC của 30 cặp mồi SSR TT Tên cặp Số allele mồi thể hiện PIC TT Tên cặp mồi Số allele thể hiện PIC 1 AP5659 3 0,47 16 RM8213 5 0,64 2 RM5926 3 0,55 17 RM3134 2 0,34 3 ARO1 2 0,40 18 RM3726 3 0,46 4 RM13 3 0,46 19 RM6506 2 0,27 5 RM21 4 0,73 20 RM19429 3 0,49 6 RM190 2 0,44 21 RM28561 3 0,54 7 RM208 3 0,51 22 Z4794 2 0,44 8 RM212 2 0,48 23 RM463 2 0,42 9 RM224 4 0,64 24 RM527 2 0,49 10 RM247 3 0,63 25 RM1223 3 0,49 11 RM250 3 0,39 26 RM7102 3 0,47 12 RM585 4 0,69 27 RM261 2 0,08 13 RM3726 4 0,69 28 PTA248 2 0,50 14 RM6308 2 0,08 29 RM6320 3 0,55 15 RM6997 3 0,61 30 MP1-2 5 0,68 87 14,63 2,90 0,49 Tổng Trung bình 3.2.2. Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) và tỷ lệ dị hợp tử (H%) của 25 giống lúa nghiên cứu Tỷ lệ dị hợp tử (H%) và tỷ lệ số liệu khuyết (M%) của 25 giống lúa nghiên cứu dựa trên kết quả phân tích với 30 cặp mồi SSR được trình bày (Bảng 2.2) cho thấy: Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của giống NSC80 cao nhất là 33 10% (khuyết 3 mồi trong tổng số 30 cặp mồi nghiên cứu); tiếp đến là giống NSC79 (khuyết 2 mồi trong tổng số 30 cặp mồi nghiên cứu) với tỷ lệ 6,67%; các giống NSC70, NSC75, NSC76, NSC77, NSC78, NSC82, NSC83, NSC85, NSC86 và NSC90 (khuyết số liệu ở 1 mồi trong tổng số 30 cặp mồi nghiên cứu với tỷ lệ 3,33%). Các giống còn lại không bị khuyết số liệu. Tỷ lệ khuyết số liệu trung bình của 25 giống lúa nghiên cứu khá thấp là 2,00; không có giống nào có tỷ lệ khuyết số liệu lớn hơn 15%. Như vậy, cả 25 giống lúa nghiên cứu đều có ý nghĩa phân tích thống kê để đánh giá đa dạng di truyền. Tỷ lệ dị hợp tử (H) cao nhất ở 2 giống lúa NSC89 và NSC69 là 10,0%; tiếp đến là giống lúa NSC70 và NSC77 có tỷ lệ dị hợp tử là 6,90%; giống lúa NSC87 có tỷ lệ dị hợp tử là 6,67%; giống lúa NSC80 có tỷ lệ dị hợp tử là 3,70%; 7 giống NSC76, NSC78, NSC82, NSC83, NSC85, NSC86 và NSC90 có tỷ lệ dị hợp tử là 3,45%; giống NSC74, NSC81 và NSC88 có tỷ lệ dị hợp tử là 3,33%. Các giống còn lại có tỷ lệ dị hợp bằng 0% (đồng hợp ở cả 25 locus nghiên cứu). Tỷ lệ dị hợp tử trung bình là 3,13%. 34 Bảng 3.2. Tỷ lệ di hợp tử (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của các dòng lúa nghiên cứu Số mồi TT khuyết số liệu 1 NSC69 0 2 NSC70 1 3 NSC71 0 4 NSC72 0 5 NSC73 0 6 NSC74 0 7 NSC75 1 8 NSC76 1 9 NSC77 1 10 NSC78 1 11 NSC79 2 12 NSC80 3 13 NSC81 0 14 NSC82 1 15 NSC83 1 16 NSC84 0 17 NSC85 1 18 NSC86 1 19 NSC87 0 20 NSC88 0 21 NSC89 0 22 NSC90 1 23 NSC91 0 24 NSC92 0 25 NSC93 0 Trung bình Tên dòng Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) 0,00 3,33 0,00 0,00 0,00 0,00 3,33 3,33 3,33 3,33 6,67 10,00 0,00 3,33 3,33 0,00 3,33 3,33 0,00 0,00 0,00 3,33 0,00 0,00 0,00 2,00 35 Số mồi xuất hiện dị hợp tử 3 2 0 0 0 1 0 1 2 1 0 2 1 1 1 0 1 1 2 1 3 1 0 0 0 Tỷ lệ dị hợp tử (H%) 10,00 6,90 0,00 0,00 0,00 3,33 0,00 3,45 6,90 3,45 0,00 3,70 3,33 3,45 3,45 0,00 3,45 3,45 6,67 3,33 10,00 3,45 0,00 0,00 0,00 3,13 3.2.3 Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của 25 giống lúa nghiên cứu * Kết quả phân tích với mồi PTA248 Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi PTA248 thu được 2 loại băng. Trên tổng số 25 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất hiện các băng DNA từ khoảng 500bp đến 750bp. Mồi PTA248 có 3 mẫu giống xuất hiện băng dị hợp tử là NSC82, NSC87 và NSC88. Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 25 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi PTA248 (M: marker1kb) * Kết quả phân tích với mồi RM212 Kết quả điện di sản phẩm PCR với RM212 thu được 2 loại băng. Trên tổng số 25 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất hiện các băng DNA từ khoảng 118bp đến 140bp. Mẫu giống NSC81 và NSC90 có xuất hiện băng dị hợp mẫu giống còn lại không có băng dị hợp tử và không bị khuyết số liệu. 36 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm SSR – PCR của 25 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM212 (M: marker 20bp) * Kết quả phân tích với mồi RM7102 Kết quả điện di sản phẩm PCR với RM7102 thu được 3 loại băng. Trên tổng số 25 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất hiện các băng DNA từ khoảng 170bp đến 200bp. Mồi RM7102 có 3 mẫu giống xuất hiện băng dị hợp là NSC77, NSC78 và NSC86. Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm SSR – PCR của 25 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM7102 (M: marker 20bp) 37 * Kết quả phân tích với mồi RM19429 Kết quả điện di sản phẩm PCR với RM19429 thu được 3 loại băng. Trên tổng số 25 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất hiện các băng DNA từ khoảng 180bp đến 220bp. Mồi RM19429 không có băng dị hợp và không mẫu giống nào bị khuyết số liệu. Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm SSR – PCR của 25 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM19429 (M: marker 20bp) Số liệu thu được từ tiêu bản điện di sản phẩm PCR của 30 cặp mồi SSR với 25 giống lúa nghiên cứu được thống kê và phân tích bằng phần mềm NTSYpc 2.1, từ đó thiết lập được bảng hệ số tương đồng di truyền và sơ đồ hình cây (hình 3.6) về mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu. Qua bảng hệ số tương đồng và sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu cho thấy: Hệ số tương đồng di truyền của 25 giống lúa nghiên cứu dao động trong khoảng từ 0,09 giữa 4 cặp giống (NSC71 và NSC75); (NSC 71 và NSC78); (NSC71 và NSC79); (NSC72 và NSC79) đến 0,83 (NSC69 và NSC70). Dựa vào sơ đồ phát sinh chủng loại (hình 3.6), ở 38 mức tương đồng di truyền 0,48 (48%), 25 giống lúa nghiên cứu được chia thành 4 nhóm cách biệt di truyền. 69 70 72 71 81 84 82 83 85 88 86 90 69MW 93 92 87 89 91 73 74 75 78 79 77 80 76 0.19 0.24 0.30 0.36 0.42 0.48 0.54 0.59 0.65 0.71 0.77 0.83 Coefficient Hình 3.6. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa 25 giống lúa nghiên cứu 39 Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa 25 mẫu giống lúa nghiên cứu 40 Nhóm I: Gồm 4 giống lúa là NSC69, NSC70, NSC71 và NSC72. Nhóm này có hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng từ 0,50 (giữa NSC69 và NSC71) đến 0,83 (giữa NSC69 và NSC70). Nhóm II: Gồm 4 giống lúa là NSC81, NSC82, NSC83 và NSC84 có hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng từ 0,43 (giữa NSC83 và NSC84) đến 0,62 (giữa NSC81 và NSC84). Nhóm III: Gồm 9 giống lúa (NSC85, NSC86, NSC87, NSC88, NSC89, NSC90, NSC91, NSC92 và NSC93) có hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng từ 0,45 (giữa NSC87 và NSC90) đến 0,75 (giữa NSC89 và NSC91). Nhóm IV: Gồm có 8 giống lúa (NSC73, NSC74, NSC75, NSC76, NSC77, NSC78, NSC79 và NSC80) có hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng từ 0,42 (giữa NSC73 và NSC76) đến 0,78 (giữa NSC78 và NSC79). 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Tập đoàn giống lúa nghiên cứu đa dạng về thành phần allele. Kết quả phân tích 30 cặp mồi SSR với 25 giống lúa thu được tổng số 87 loại allele, trung bình 2,90 allele/cặp mồi. Hệ số PIC dao động từ 0,08 đến 0,73 (trung bình 0,49). Tỷ lệ dị hợp của các mẫu nghiên cứu dao động từ 0% đến 10,0% (trung bình là 3,13%). Hệ số tương đồng di truyền của 25 giống lúa nghiên cứu dao động trong khoảng từ 0,09 giữa 4 cặp giống (NSC71 và NSC75); (NSC71 và NSC78); (NSC71 và NSC79); (NSC72 và NSC79) đến 0,83 (giữa NSC69 và NSC70). Dựa vào sơ đồ phát sinh chủng loại, ở mức tương đồng di truyền 0,48 (48%), 25 giống lúa nghiên cứu được chia thành 4 nhóm cách biệt di truyền. 2. Kiến nghị Cần tiếp tục nghiên cứu xác định các allele đặc trưng, allele hiếm để nhận dạng chính xác các nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu chọn, lai tạo giống và định hướng phát triển giống lúa năng suất và chất lượng cao. 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Bùi Mạnh Cường (2007), Công nghệ sinh học trong chọn giống ngô, NXB Nông nghiệp. 2. Vũ Thị Thu Hiền, Phạm Văn Cường (2012), “Phân tích đa dạng di truyền mẫu giống lúa canh tác nước trời bằng chỉ thị SSR”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 10 (1), tr. 15-24. 3. Trần Danh Sửu, Đỗ Đức Tuyến, Lưu Ngọc Trình, Nguyễn Thị Ngọc Huệ (2004), Nghiên cứu đa dạng di truyền các giống lúa do nông dân đặt tên (Oryza sativa) trên cơ sở phân tích đẳng men, bảo tồn nội vi tài nguyên cây trồng vì sự phát triển bền vững, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr. 54-60. 4. Nguyễn Đức Thành (2004), “Nghiên cứu đa dạng di truyền một số dòng lúa chọn làm cặp lai trong tạo giống năng suất cao”, Tạp chí công nghệ sinh học 2 (1), tr. 101-108. 5. Khuất Hữu Trung, Nguyễn Thị Phương Đoài (2010), “ Nghiên cứu đa dạng di truyền và nhận dạng một số giống trong tập đoàn lúa Tám đặc sản của Việt Nam bằng chỉ thị phân tử SSR (microsatellite) ”, Tạp chí Nông nghiệp và PTNT (149), tr. 3-8. Tài liệu internet 6. www.gramene.org 7. http://fsiu.mard.gov.vn/data/trongtrot.htm Tài liệu tiếng Anh 8. Chang, T.T. 1976. The rice culture. Philosophical Transactions of the Royal Society. London, B, 275:143-157. 43 9. Chang, T.T. 1985. Crop history and genetic conservation: Rice - A case study. Iowa State Journal of Research, Vol 59 (4): 425-455. 10. Chatterjee, D. 1948. A modified key and enumeration of the species of Oryza Linn. Indian J. Agr. Sci. 18: 185-192. 11. Chevalier, A. 1932. Nouvelle contribution à l’ étude systématique des Oryza. Rev. Bot. Appl. Agr. Trop. 12: 1014-1032. 12. De Candolle. 1883. Origines des plantes cultivées. Bibliothèque scientifique internationale. Paris. 13. Giarrocco LE, Marassib MA and Salernoa GL. (2007), Assessment of the genetic diversity in Argentine Rice Cultivars with SSR Markers. Crop Sci 47, 853-858.13. 14. Harsh B., Ravindra K. and Sanjay V. (2013), Analysis of diversity in rice (Oryza sativa L.) using random amplified polymorphic DNA (RAPD) and simple sequence repeats (SSR) markers, Vol. 12(35), pp. 5404-5412. 15. Kalyan CB and Rambabu N. (2006), SSR marker based DNA fingerprinting and diversity study in rice (Oryza sativa L.). ẠJB 5 (9), 684-688.16. 16. Litt M, Luty JA. (1989), A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplìication of a dinucleotied repeat within the cardiac muscle actin gene. Amr J Hum Genet 44, 397-401. 17. Malik AR., Muhammad SM., Zabta KS and Kazuko YS. (2010), Genetic analysis of Basmati and non-Basmati Pakistani rice (Oryza sativa L.) cultivars using microsatellite markers. Pak. J. Bot. 42, 25512564. 18. Morinaga, T. 1972. Japanese rice and its introduction from abroad. In Morinaga, T., Kihara, H., Tshukuba, J and Ueno, M. eds. History of 44 Biology in Japan of dawn of its civilization, Yokendo, Tokyo (trong Matsuo, 1997). 19. Nayar, N. M. 1973. Origin and cytogenetics of rice. Advances in Genetics, vol 17, Academic Press Inc., New York and London. 20. Nakagahra, M. 1976. The differentiation of cultivated rice based on geographical distribution of marker genes. Current Advances in Breeding, 17: 35-44 (trong Matsuo, 1997). 21. Pilger, R. 1915. Neue und weniger bekannte Graminee aus Papuasien. Bot. Jaarb. 52: 167-176 (trong Nayar, 1973). 22. Shahid MS, Shahzad AN and Muhamad A. (2013), Genetic diversity in basmati and non-basmati rice varieties based on microsatellite markers.Pak. J. Bot., 45(S1), pp. 423-431. 23. Sharma S. D.1973. Evolution in genus Oryza. In Advancing Frontiers in Cytogenetics. Hindustan Publishing Corp., New Delhi, pp. 5-10. 24. Sharma, S. D. and Shastry, S.V.S. 1971. Phylogenetic studies in genus Oryza I. Primitive characters. Riso, 20: 127-136. 25. Ting, Y .1949. Origin of rice cultivation in China. Coll. Agr. Sun. Yat. Sen. Univ., Agron. Bull., Ser. III No. 7: 18 (in Chinese). 26. Victoria CL., Darshan SB., Toshinori A., Edilberto DR. (2007), “Assessment of Genetic Diversity of Philippine Rice Cultivars Carring Good Quality trait using SSR marker”, Breeding Science (57), pp. 263270. 27. Watt, G. 1892. Rice. In Dictionary of Economic Products of India, Superintendent, Gov. Printing, Calcutta, 5: 498-653. 45 [...]... nguồn gen lúa nếp, lúa nương của Việt Nam (Khuất Hữu Trung và cs., 2010) Năm 2012, Vũ Thị Thu Hiền và Phạm Văn Cường đã phân tích đa dạng di truyền của 64 dòng /giống lúa đang canh tác trong điều kiện nhờ nước trời 22 thông qua sự có mặt và mức độ đa hình của các chỉ thị phân tử SSR Bằng việc sử dụng 34 chỉ thị phân tử SSR, có 8 chỉ thị không cho xuất hiện vạch ở tất cả các dòng /giống và 2 chỉ thị xuất... chỉ đặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau 1.4 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền lúa trên thế giới và ở Việt Nam 1.4.1 Trên thế giới Tác giả Victoria và cộng sự (2007) tiến hành nghiên cứu đa dạng trên 24 giống lúa ở Philippin có chất lượng tốt bằng 164 chỉ thị SSR Trong số 164 chỉ thị SSR có 151 chỉ thị cho đa. .. nhiều chỉ thị DNA dựa trên PCR đang được áp dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng phổ biến nhất là chỉ thị SSR Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat): Trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền, chỉ thị SSR là một trong những chỉ thị được dùng phổ biến nhất bởi kỹ thuật đơn giản và cho độ chính xác cao SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự DNA đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ gồm... đồng, 40 giống lúa được chia thành 3 nhóm khác biệt Kết quả này được sử dụng hữu ích cho việc theo dõi, xác định kiểu gen và bảo vệ giống lúa Harsh Bansal (2013), sử dụng chỉ thị phân tử đánh giá đa dạng di truyền của 20 giống lúa (được thu thập từ phòng di truyền học, Viện nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ) bằng chỉ thị RAPD và chỉ thị SSR Sử dụng 20 mồi RAPD thu được 116 băng trong đó có 114 băng đa hình... Trong đó, có 89 chỉ thị cho 147 allele hiếm Hệ số đa dạng di truyền PIC từ 0,18 – 0,91 đạt trung bình 0,68 /chỉ thị Theo kết quả phân tích UPGMA, ở độ tương đồng 40%, tổng số 24 giống lúa được chia thành ba nhóm: Nhóm 1 gồm 8 giống Japonica, nhóm 2 và 3 là các giống lúa Indica Nghiên cứu này cho ta thấy việc sử dụng chỉ thị SSR là rất hiệu quả trong phân nhóm các loài phụ của lúa, những giống lúa có chất... nhiều công trình sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền và DNA fingerprinting để nhận dạng giống lúa được công bố (Kalyan và ctv, 2006) Đã có khoảng 2740 chỉ thị SSR cho toàn bộ gen lúa và như vậy trung bình cứ 157kp của phân tử DNA có một chỉ thị SSR SSR là maker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định trong quá trình thực nghiệm Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu... Đoài đã sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn nguồn gen lúa 21 Tám đặc sản bản địa của Việt Nam Kết quả nghiên cứu đã cho thấy tập đoàn lúa Tám nghiên cứu khá đa dạng: phân tích 36 cặp mồi SSR trên 26 giống lúa Tám thu được tổng số 938 băng DNA thuộc 88 loại allele khác nhau (trung bình 2,44 allele/cặp mồi) Hệ số PIC dao động từ 0 đến 0,65 (trung bình 0,27) Các giống lúa Tám nghiên... phân tử đánh giá đa dạng di truyền của 40 giống lúa thơm và không thơm bằng chỉ thị SSR, 40 giống lúa này được đánh giá bởi 24 mồi Kết quả cho thấy có tổng cộng 66 allele và hệ số allele dao động từ 2 – 4, trung bình là 2,75 allele/marker, hệ số PIC dao động từ 0,4250 (RM252) đến 0,9750 (RM315) Hệ số PIC trung bình của 24 cặp mồi nghiên cứu trên 40 giống lúa là 0,6472 Kết quả phân tích đa dạng di truyền. .. biểu hiện ở cấp độ phân tử DNA Thông tin các chỉ thị SSR đa hình giữa các dòng /giống rất có giá trị trong chọn giống lúa chịu hạn nhờ chỉ thị phân tử 23 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu là 25 giống lúa ưu tú (NSC69 – NSC93) được cung cấp bởi công ty Giống cây trồng Trung Ương (Bảng 2.1) Bảng 2.1 Danh sách 25 giống lúa nghiên cứu STT... lúa Japonica) Nhóm II bao gồm 19 giống lúa không thơm Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy rằng các marker SSR có thể được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền và chỉ ra sự khác biệt giữa giống lúa Basmati thơm và giống lúa Basmati không thơm Hơn nữa, việc xác định giống lúa Basmati truyền thống dựa vào marker SSR có thể giúp ích cho việc duy trì và bảo tồn các giống lúa có chất lượng cao vì lợi ích ... hành nghiên cứu đề tài: Phân tích đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa ưu tú (NSC69 – NSC93) thị phân tử SSR Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đa dạng di truyền dòng /giống lúa nghiên cứu, xác định... 2001) Hiện có nhiều thị DNA dựa PCR áp dụng nghiên cứu đa dạng di truyền phổ biến thị SSR Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat): Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, thị SSR thị dùng phổ biến kỹ... thấy marker SSR sử dụng để phân tích đa dạng di truyền khác biệt giống lúa Basmati thơm giống lúa Basmati không thơm Hơn nữa, việc xác định giống lúa Basmati truyền thống dựa vào marker SSR giúp