Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 53 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
53
Dung lượng
1,05 MB
Nội dung
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
-------------------------
NGUYỄN THANH HOA
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN
TẬP ĐOÀN GIỐNG LÚA ƢU TÚ (NSC69 - NSC93)
BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: Di truyền học
Hà Nội - 2015
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Khuất Hữu Trung đã dành nhiều
thời gian,tâm huyết chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn
thành khóa luận.
Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành đến ThS. Kiều Thị Dung đã dành rất
nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn kĩ thuật, cung cấp thông tin và tài liệu
bổ ích giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin trân trọng gửi lời cám ơn đến các cán bộ Bộ môn kĩ thuật di
truyền – Viện Di truyền nông nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cám ơn các thầy giáo, cô giáo trường Đại học sư
phạm Hà Nội 2 đã tận tình giảng dạy và truyền đạt những kinh nghiệm quý
báu cho tôi trong suốt 4 năm học qua.
Lời cuối, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia
đình đã luôn ở bên tôi, chăm sóc, động viên tôi và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Hà Nôi, ngày 7 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Nguyễn Thanh Hoa
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan khóa luận này hoàn toàn được thực hiện bằng sự tìm
hiểu nghiên cứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn của TS. Khuất
Hữu Trung – Viện Di truyền nông nghiệp Việt Nam. Các nội dung nghiên cứu
và kết quả được trình bày trong luận văn này là trung thực, không sao chép
bất cứ tài liệu, công trình nghiên cứu của người khác. Tôi xin chịu trách
nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội đồng và nhà trường.
Hà Nội, ngày 7 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Nguyễn Thanh Hoa
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ........................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................. 3
NỘI DUNG ....................................................................................................... 4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ............................... 4
1.1. Nguồn gốc, phân loại và giá trị kinh tế của cây lúa.............................. 4
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại cây lúa............................................................. 4
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lúa ở Việt Nam ............................................. 11
1.2. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới và trong nƣớc ..................... 11
1.2.1. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới ........................................... 11
1.2.2. Tình hình sản xuất lúa gạo ở nước ta ............................................... 13
1.3. Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền ......................... 16
1.4. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền lúa trên thế giới và ở Việt
Nam.............................................................................................................. 19
1.4.1. Trên thế giới .................................................................................... 19
1.4.2. Ở Việt Nam ...................................................................................... 21
CHƢƠNG 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................ 24
2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................... 27
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số ................................................................... 27
2.2.2. Phản ứng PCR ................................................................................. 28
2.2.3. Chu trình PCR ................................................................................. 28
2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR ....................................................... 28
2.2.5. Phân tích và xử lý số liệu ................................................................ 29
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 31
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số .......................................................... 31
3.2. Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử SSR trong phân tích đa dạng di
truyền ........................................................................................................... 32
3.2.1 . Hệ số PIC, số allele và tổng số băng DNA thể hiện trên từng cặp
mồi ............................................................................................................ 32
3.2.2. Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) và tỷ lệ dị hợp tử (H%) của 25 giống lúa
nghiên cứu ................................................................................................. 33
3.2.3 Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của 25 giống
lúa nghiên cứu ........................................................................................... 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. 43
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH
Danh mục bảng
Bảng 1.1. Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa .......... 4
Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lượng lúa ở nước ta qua các năm ........... 13
Bảng 1.3. Xuất khẩu gạo của Việt Nam sang châu Phi, Tây Á, Nam Á năm
2014. Đơn vị: USD........................................................................................... 14
Bảng 1.4. Giá gạo xuất khẩu của Việt Nam so với Thái Lan (USD/tấn) ………16
Bảng 2.1. Danh sách 25 giống lúa nghiên cứu .................................................. 24
Bảng 2.2. Thông tin về các cặp mồi trong nghiên cứu………………………... 25
Bảng 2.3. Chu trình chạy PCR – SSR............................................................... 28
Bảng 2.4. Thành phần gel polyacrylamide ........................................................ 29
Bảng 3.1. Số allele thể hiện và hệ số PIC của 30 cặp mồi SSR ......................... 33
Bảng 3.2. Tỷ lệ di hợp tử (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của các dòng lúa
nghiên cứu ........................................................................................ 35
Bảng 3.3. Hệ số tương đồng di truyền giữa 25 mẫu giống lúa nghiên cứu ........ 40
Danh mục hình
Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số của 25 mẫu giống lúa nghiên cứu ............. 31
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 25 mẫu giống lúa nghiên cứu
với đoạn mồi PTA248 (M: marker1kb) ............................................................ 36
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm SSR – PCR của 25 mẫu giống lúa nghiên
cứu với đoạn mồi RM212 (M: marker 20bp) .................................................... 37
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm SSR – PCR của 25 mẫu giống lúa nghiên
cứu với đoạn mồi RM7102 (M: marker 20bp) .................................................. 37
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm SSR – PCR của 25 mẫu giống lúa nghiên
cứu với đoạn mồi RM19429 (M: marker 20bp) ................................................ 38
Hình 3.6. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa 25 giống lúa nghiên
cứu ........................................................................................................ 39
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ARN:
Acid ribonucleic
CTAB:
Cetyl trimetyl amonium bromit
DNA:
Acid deoxyribonucleic
dNTP:
Dideoxyribo nucleozit triphosphat
EtBr:
Ethidium Bromide
IRRI:
International Research Rice Institute
PCR:
Polymerase chain reaction
PIC:
Polymorphic Information Content
QTL:
Quantitative trait loci
RAPD:
Random amplyfied polymorphic DNA
SDS:
Sodium dodecyl sunphate
SSR:
Simple sequence repeats
TE:
Tris EDTA
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Lúa gạo là cây lương thực lâu đời nhất được trồng ở nhiều nơi trên thế
giới. Diện tích gieo trồng của lúa gạo đứng thứ hai sau lúa mì, tổng sản lượng
lúa đứng thứ ba sau lúa mì và ngô. Lúa gạo là nguồn lương thực quan trọng
cho khoảng 2/3 dân số trên thế giới, vì thế lúa trở thành cây lương thực chính
và quan trọng được con người tiêu thụ và ưa chuộng nhiều nhất. Hiện nay,
diện tích trồng lúa chiếm trên 1/10 diện tích đất trồng trên thế giới và có 15
nước trên thế giới trồng lúa với diện tích lớn hơn 1 triệu ha, trong đó có tới 13
nước ở Châu Á. Riêng Trung Quốc và Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tích
trồng lúa và 56% sản lượng lúa toàn cầu. Bangladesh, Indonexia, Thái Lan
mỗi nước đều có diện tích trồng lúa lớn hơn tổng diện tích trồng lúa của tất cả
các nước Mĩ La tinh.
Ở nước ta, lúa là loại cây trồng quan trọng nhất, vừa là nguồn lương
thực chủ yếu, vừa là nông sản có kim ngạch xuất khẩu lớn nhất hiện nay.
Trong những năm gần đây, nước ta đã có những bước tiến vượt bậc về sản
xuất lúa gạo, mang lại nhiều lợi ích cho người sản xuất và cho xuất khẩu nhờ
vào việc sử dụng các giống lúa có năng suất cao cùng với việc thâm canh tăng
vụ. Năng suất và sản lượng lúa của nước ta không ngừng tăng lên, theo Tổng
cục thống kê: năm 1990 năng suất lúa đạt 31,8 tạ/ha với tổng sản lượng 19,2
triệu tấn; năm 2000: 42,4 tạ/ha, tổng sản lượng 32,5 triệu tấn. Sản lượng lúa cả
năm 2013 ước tính đạt 44,076 triệu tấn, tăng 1,677 triệu tấn so với năm 2012,
diện tích gieo trồng năm 2013 ước tính đạt 7 899,4 nghìn ha [7]. Tuy nhiên, do
thị hiếu tiêu dùng của con người đòi hỏi ngày càng cao về chất lượng của lúa
gạo. Sự phát triển các giống lúa có năng suất, chất lượng, kháng được sâu
bệnh và điều kiên bất lợi là một trong những mục tiêu được chú trọng trong
1
các chương trình phát triển ngày nay. Chính vì vậy, việc thu thập và phân tích
nguồn gen của tập đoàn các dòng/giống lúa ưu tú để nhằm khai thác nguồn
gen ưu thế của các dòng lúa ưu tú giúp nâng cao năng suất và chất lượng đáp
ứng kịp với nhu cầu sản xuất và tiêu dùng. Xuất phát từ những lí do trên,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân tích đa dạng di truyền tập đoàn
giống lúa ưu tú (NSC69 – NSC93) bằng chỉ thị phân tử SSR”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các dòng/giống lúa nghiên cứu, xác
định các allele đặc trưng, allele hiếm để nhận dạng chính xác các nguồn gen
phục vụ nghiên cứu chọn, lai tạo giống và định hướng phát triển giống lúa
năng suất và chất lượng cao. Sản phẩm của đề tài là cơ sở để tiến hành các
nghiên cứu về di truyền, chức năng gen, kết hợp với các chỉ tiêu về sinh lý,
sinh hóa, trao đổi chất, nhằm bảo tồn và chọn tạo các giống có năng suất cao,
chất lượng tốt, có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi
trường để sẵn sàng ứng phó với biến đổi khí hậu, góp phần nâng cao thu nhập
cho người nông dân.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tách chiết và tinh sạch DNA các mẫu thu thập.
- Chạy phản ứng PCR – SSR với mồi SSR trên các nhiễm sắc thể khác
nhau.
- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR.
- Xử lý kết quả thu được.
2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Đánh giá đa dạng di truyền của các nguồn gen lúa năng suất cao tạo cơ
sở cho việc chọn lọc các nguồn gen lúa chất lượng ưu tú phục vụ cho nghiên
cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn
gen lúa năng suất cao ở mức phân tử.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Phát hiện sai khác di truyền của các giống lúa năng suất cao có ý nghĩa
quan trọng trong việc xác định các allele hiếm, allele đặc trưng để nhận dạng
chính xác các nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu phục tráng và lai tạo giống
lúa năng suất cao.
3
NỘI DUNG
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Nguồn gốc, phân loại và giá trị kinh tế của cây lúa
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại cây lúa
Phân loại cây lúa
Trên Trái Đất này chỉ có người dân châu Á và châu Phi biết thuần
dưỡng lúa dại thành lúa trồng hiện nay, đó là lúa châu Á (Oryza sativa) và lúa
châu Phi (Oryza glaberrima) có hai nguồn gốc, phát triển cũng như phân phối
riêng biệt. Tùy theo khí hậu, cây lúa châu Á được chia ra thành 3 nhóm khác
nhau: lúa Indica ở vùng nhiệt đới, lúa Japonica (hay Sinica) ở vùng ôn đới và
Javanica (còn gọi Japonica nhiệt đới) ở Indonesia là trung gian giữa 2 thứ lúa
kia. Những đặc tính hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa được
nêu trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Đặc trƣng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm
giống lúa
Đặc
INDICA
tính
Thân
- Thân cao
Chồi
- Nở bụi mạnh
Lá
JAVANICA
- Thân cao trung
bình
- Nở bụi thấp
- Lá rộng, xanh - Lá rộng, cứng,
nhạt
xanh nhạt
4
JAPONICA
- Thân thấp
- Nở bụi trung bình
- Lá hẹp, xanh đậm
- Hạt thon dài, dẹp
- Hạt hầu như
không có đuôi
Hạt
- Trấu ít lông và
lông ngắn
- Hạt dễ rụng
Sinh học
- Hạt tròn, ngắn
- Hạt to, dầy
- Hạt không có đuôi
hoặc có đuôi dài
- Trấu có lông dài
- Ít rụng hạt
- Hạt không đuôi tới có
đuôi dài
- Trấu có lông dài và
dầy
- Ít rụng hạt
-Tính quang cảm - Tính quang cảm rất - Tính quang cảm rất
rất thay đổi
yếu
thay đổi
Nguồn: Chang, 1985 [9]
Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae (họ Hòa Thảo), phụ họ Pryzoideae, tộc
Oryzae, dòng Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima. Loài Oryza
sativa là lúa trồng ở châu Á và Oryza glaberrima lúa trồng ở châu Phi. Bên
cạnh đó còn có hơn 20 loài lúa dại sống rải rác trên thế giới như ở Đông Nam
Á, Nam Á, châu Úc, New Guinea, châu Phi, Trung và Nam Mỹ. Sự xếp loại
cho cây lúa trải qua một thời gian hơn 200 năm, với rất nhiều tranh luận giữa
các nhà nghiên cứu vì không có hệ thống xếp loại thống nhất. Do vậy, nhiều
loài lúa dại được xếp cùng tên hoặc lẫn lộn nhau, tùy theo các nhà nghiên cứu,
ngoại trừ hai loài lúa trồng (sativa và glaberrima) và 7 loài lúa dại
(australiensis,
eichingeri,
latifolia,
minuta,
schlechteri,
ridleyi
và
brachyantha) (Nayar, 1973). Chẳng hạn, loài spontanea và perennis được
xem như rất gần với lúa trồng sativa, nên có tên thay đổi rất thường: loài
oryza dưới dạng spontanea, hàng niên, xem như một loài độc lập O. fatua hay
O. sativa var. fatua hoặc O. rufipogon (Sampath, 1962). Loài đa niên O.
perennis được xem như O. rufipogon Griff và loài hàng niên như O. nivara
Sharma et Shastry.
Vào năm 1753, ông Lineaeus - người đầu tiên đã mô tả và xếp loài lúa
sativa trong dòng Oryza. Pilger (1915) tìm được và mô tả loài thứ hai,
5
schlechteri từ mẫu thu thập được bởi Schlechter vào năm 1907 ở miền bắc
Tân Guinea. Bà Prodoehl (1922) đã viết bản thảo chi tiết cho giống lúa này và
17 loài được mô tả khá chi tiết. Sau đó, dòng Oryza được đặc biệt quan tâm
đến với rất nhiều chi tiết bởi một số nhà nghiên cứu như: Chatterjee (1948),
Sharma và Shastry (1965, 1971), Sharma (1973) và Nayar (1973). Trong đó,
ông Morinaga (1943, 1954) là người đầu tiên đã sử dụng kĩ thuật phân tích
genome để định danh các loài lúa dại. Công trình nghiên cứu dựa trên cơ sở
khoa học này (sự tiếp hợp của các nhiễm sắc thể giống nhau) đã giúp phân
tích các loài lúa chính xác hơn.
Nguồn gốc cây lúa
Trên thế giới có hai loại lúa trồng: lúa châu Á và lúa châu Phi. Cây lúa
châu Á hiện chiếm ưu thế trong khâu sản xuất, tiêu thụ và thị trường thế giới
vì năng suất cao gấp 2 – 3 lần lúa châu Phi. Nguồn gốc và phân phối của cây
lúa châu Á khó có thể xác định rõ ràng vì cây lúa được con người thuần
dưỡng và canh tác từ thời tiền sử.
Nguồn gốc của cây lúa trồng là đề tài tranh luận sôi nổi từ lâu, xuất
phát từ hai nước: Trung Quốc và Ấn Độ. Mãi đến thập niên 1950, các nghiên
cứu mới có cơ sở vững chắc hơn khi kĩ thuật di truyền tế bào được áp dụng.
Địa điểm nguồn gốc xuất phát cây lúa trồng đầu tiên phải có đủ 4 tiêu chuẩn
sau:
(i)
Tổ tiên trực tiếp của cây lúa hay lúa dại phải hiện diện hoặc đã xuất
hiện ở nơi đó.
(ii)
Di chỉ khảo cổ xác nhận cây lúa đã được trồng ở nơi đó.
(iii)
Sự hiện diện loài nguyên thủy của cây lúa trồng.
(iv)
Biến đổi di truyền giữa lúa trồng và lúa dại phải khác biệt ở nơi đó.
6
Có nhiều giả thuyết về nguồn gốc của cây lúa trồng hiện nay, nhưng
một cách tổng thể, 4 giả thuyết sau đây được các nhà khảo cứu đề cập đến
nhiều nhất: nguồn gốc Trung Quốc, Ấn Độ, Đông Nam Á và đa trung tâm.
a. Giả thuyết nguồn gốc Trung Quốc
Vào năm 1882, de Candolle đã dựa vào tài liệu của Bretschneider và
Stanislav Julien đề cập về một nghi lễ tôn giáo đặt ra bởi hoàng đế Thần Nông
(2800 – 2700 trước Công Nguyên – CN) và cho rằng cây lúa trồng xuất hiện ở
Trung Quốc sớm hơn Ấn Độ. Trong nghi lễ này, hoàng đế và các quan cao
cấp đã gieo 5 loại hạt: lúa, khoai ngọt, lúa mì và hai loại hạt kê. Do đó, ông de
Candolle và nhiều người khác cho rằng các loại hạt giống trên xuất xứ từ
Trung Quốc.
Ông Ting (1949) đề nghị rằng cây lúa xuất phát từ Trung Quốc, vì loại
thảo mộc này đã được nói đến lần đầu tiên trong văn học dưới thời Thần
Nông (3000 trước CN) và trong thời đại hoàng đế Nghiêu, Thuấn (2600 –
2200 trước CN). Ting cho biết hạt lúa và lá lúa được tìm thấy trong cuộc khai
quật Yan-shao 2600 trước CN và cũng tìm thấy bộ xương có khắc đặc tính
cây lúa. Ông cũng báo cáo đã tìm được mày lúa và hạt lúa ở địa điểm khai
quật cách Uckan 150km trong vùng thung lũng sông Hoàng Hà. Ông cho rằng
hạt lúa có liên hệ với “O. sativa f. spontanea ssp. Keng Ting”. Hạt lúa có
chiều dài 6,97mm và chiều rộng 3,47mm với mày có lông, hạt có đuôi. Các di
vật khác cũng được báo cáo ở thiên niên kỷ thứ III và IV trước CN. Mẫu lúa
trồng cổ nhất thuộc loại Indica được tìm thấy ở cuộc khai quật tại Ho-mu-tu,
phía đông Trung Quốc vào niên đại 5008 117 trước CN hay cách nay
khoảng 7.000 năm.
b. Giả thuyết nguồn gốc Ấn Độ
Ông Watt (1892) viết rất nhiều sách về lúa, đã tìm thấy vài loài lúa dại
ở India như rufipogon (đa niên) và Porterssia coarctata. Lúa gạo cũng được
7
sử dụng trong nhiều nghi lễ ở xứ này. Vậy nên, ông kết luận rằng cây lúa
trồng có thể xuất phát từ bán đảo Ấn Độ và lan rộng đến các nơi khác.
Ramiah và Ghose (1961) ủng hộ lý thuyết của Watt. Cây lúa đến Trung Quốc
vào khoảng 3000 trước CN từ Nam Á và Đông Nam Á.
Ở Ấn Độ, di vật lâu đời của lúa được tìm thấy ở vỏ trấu trộn với đất sét
(vật dụng kiến trúc) tại Lothal (Quận Ahmedabad, Gujarat) có niên đại 2300
trước CN. Mười một mẫu lúa trên 2.000 năm đã được tìm thấy ở nhiều nơi và
được báo cáo ở Ấn Độ.
c. Giả thuyết nguồn gốc vùng núi Đông Nam Á
Trong vùng Đông Nam Á gồm cả Việt Nam, còn rất ít công cuộc khai
quật trên diện tích rộng lớn để nghiên cứu so với các hoạt động khảo cổ qui
mô tại hai quốc gia lớn là Trung Quốc và Ấn Độ. Cho nên, các giả thuyết và
công cuộc khảo cổ học của vùng này chưa có nhiều tiếng vang để tạo sức
thuyết phục trước các nhà khảo cổ học khác trên thế giới. Ngoài ra, trong
thiên niên kỷ từ VI đến X các vùng đồng bằng trũng thấp ở ven biển Thái
Bình Dương và Ấn Độ Dương bị biển tiến xâm nhập có lúc lên đến 5m trên
mực nước biển hiện nay nên làm ngập lụt, cuốn trôi nhiều di vật trong thời
gian 4.000 năm đó.
Trong thế kỷ XX, nhiều nhà nghiên cứu đưa ra giả thuyết về nguồn gốc
cây lúa trồng ở vùng Đông Nam Á, bên cạnh giả thuyết về Trung Quốc và Ấn
Độ.
Ông Moringa (1972) nêu giả thuyết rằng cây lúa có thể bắt nguồn từ
vùng núi non và thung lũng Đông Nam Á hơn là từ Ấn Độ, vì nhiều nền văn
hóa cổ xưa xuất phát từ vùng núi non này. Sau khi lai giống giữa những giống
lúa ở chân núi Hymalaya như Nepal, Bhutan và Shikkimu với các giống lúa ở
6 vùng sinh thái như: japonica ở vùng ôn đới; aus (hè – thu), boro (đông –
xuân), aman (mùa) ở vịnh Bengal; tjereh và bulu (javanica) ở Indonesia, ông
8
suy đoán rằng lúa trồng xuất phát từ miền đông nam chân núi Hymalaya và
phát tán đến 6 vùng sinh thái trên. Lúa aus, boro, aman và tjereh thuộc nhóm
lúa Indica.
Ông Chang (1976), sau khi quan sát 34.000 giống lúa thế giới ở ngân
hàng gen của IRRI, nhận thấy rằng có biến đổi rộng lớn trong các đặc tính và
sinh thái của các giống lúa thu thập ở vùng núi non Đông Nam Á, gồm có:
Nepal, Shikkim, Ấn Độ, Bangladesh, bắc Myanmar, bắc Thái Lan, bắc Lào và
tây nam Trung Quốc.
Ông Nakagahra (1976) căn cứ trên nghiên cứu về sự phân bố của 12
loại lúa isozymes từ các vùng khác nhau ở châu Á, nhận thấy có biến đổi lớn
của các giống lúa từ Ấn Độ đến Lào và cho rằng nguồn gốc cây lúa trồng ở
vùng núi non Đông Nam Á như Myanmar, Thái Lan và Vân Nam của Trung
Quốc.
d. Giả thuyết đa trung tâm
Thông thường công tác nghiên cứu về địa danh và thời gian của nguồn
gốc cây lúa căn cứ trên các di chỉ khảo cổ, lịch sử, ngôn ngữ học và chứng cứ
thực vật học. Tuy nhiên, nếu chỉ căn cứ vào một vài sự kiện mà kết luận thì
không thể chính xác và khoa học, do các nguyên nhân sau đây:
(i)
Căn cứ vào nghi lễ gieo lúa xa xưa ở Trung Quốc để kết luận về
nguồn gốc của cây lúa bắt nguồn từ nước này thì không được chuẩn
xác, vì các hạt giống này có thể xuất xứ từ các nơi khác hơn Trung
Quốc. Ví dụ: cây lúa mì được biết xuất phát từ Trung Đông.
(ii)
Di tích khảo cổ được sử dụng nhiều nhất trong quá khứ cho các
nghiên cứu về nguồn gốc thảo mộc. Tuy nhiên, các vùng có khí hậu
ấm áp và ẩm ướt như Đông Nam Á với khí hậu gió mùa rất khó giữ
được các mẫu di vật khảo cổ lâu dài, so với các vùng có khí hậu ôn
đới hoặc lạnh và khô hơn như châu thổ sông Hoàng Hà, Trung
9
Quốc. Nếu chỉ căn cứ vào niên đại của các di vật khảo cổ tìm được,
khả năng ước đoán về nguồn gốc có thể sai lầm lớn. Chẳng hạn,
trong năm 2003, Đại Hàn khám phá nhiều hạt gạo cháy ở tỉnh
Chungbuk có niên đại phóng xạ khoảng 15.000 năm (IRC, 2003),
nhưng nước này không thể là trung tâm nguồn gốc của cây lúa trồng
châu Á.
(iii)
Ngoài ra, các tranh luận nêu trên thường căn cứ trên số lượng mẫu
lúa nghiên cứu còn rất giới hạn.
(iv)
Sự khác biệt tên lúa dại của loài O. sativa có thể gây ra các suy đoán
nhầm lẫn.
Các mẫu lúa dại thật sự không còn nữa vì do sự lai giống thiên
(v)
nhiên giữa các loại lúa trồng và các loại lúa dại hàng niên.
(vi)
Không áp dụng các biện pháp tổng hợp trong công việc nghiên cứu.
Do đó, ông Chang (1985), chuyên gia di truyền lúa của IRRI, xem xét
lại tất cả tin liệu và các dữ kiện từ khoa học, khảo cổ, sinh học tiến hóa, hệ
thống sinh học và lịch sử nông nghiệp để đưa ra kết luận rằng: lúa trồng ở
châu Á có thể bắt nguồn từ nhiều địa điểm một cách độc lập và đồng bộ vì
những nơi này hiện có nhiều loài lúa dại và lúa trồng cùng sống trong một
môi trường. Những địa điểm này khởi đầu từ đồng bằng sông Ganges đến
miền bắc Myanmar, miền đông bắc Thái Lan, bắc Lào, bắc Việt Nam, miền
nam và tây nam Trung Quốc và những vùng lân cận khác.
Tại Việt Nam, lúa dại rất phong phú và hiện diện rải rác khắp lãnh thổ
từ miền Bắc đến miền Trung và miền Nam. Lúa dại đa niên O. rufipogon và
lúa dại hàng niên O. Nivara là những loài nguyên thủy, tổ tiên của các giống
lúa trồng ngày nay Indica và Japonica, đã hiện diện lâu đời ở nước ta. Đó là
một trong những yếu tố quan trọng xác nhận cây lúa có nguồn gốc ở Việt
Nam.
10
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lúa ở Việt Nam
Lúa là cây lương thực quan trọng thứ 2 trên thế giới sau cây ngô (Bùi
Mạnh Cường, 2007), được gieo trồng ở 112 nước, cung cấp lương thực cho
hơn 65% dân số thế giới. Ở nước ta, lúa gạo được sử dụng trong hầu hết các
bữa ăn của người dân.
Trong 30 năm trở lại đây sản xuất lúa gạo đã có bước tăng trưởng mạnh
(70%). Năm 2011, nước ta đã xuất khẩu 7,35 triệu tấn gạo mang về 3,5 tỉ
USD cho nền kinh tế quốc dân và đứng thứ 2 thế giới (sau Thái Lan). Cây lúa
đã góp phần giúp giải quyết tình trạng thiếu đói và hiện nay là bảo đảm an
ninh lương thực trong nước.
Ngoài ra, những phụ phẩm của cây lúa như rơm rạ, trấu, cám…đã được
ứng dụng trong chăn nuôi và trồng trọt, làm phân bón, chất đốt giúp làm giảm
các chi phí trong sản xuất nông nghiệp và bảo vệ môi trường.
1.2. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới và trong nƣớc
1.2.1. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới
Lúa gạo được xem là cây lương thực quan trọng cho khoảng 50% dân
số thế giới, hiện nay khi dân số thế giới tiếp tục tăng đồng nghĩa với việc diện
tích dùng cho trồng lúa ngày càng bị thu hẹp lại. Chính vì vậy vấn đề an ninh
lương thực ngày càng trở nên quan trọng với bất kì quốc gia nào trên thế giới.
Cây lúa được gieo trồng trong khoảng 30 vĩ độ Bắc và 40 vĩ độ Nam
gồm khoảng 150 quốc gia trồng lúa với diện tích gieo trồng khoảng 150 triệu
ha, được trồng ở nhiều châu lục như: châu Á, châu Phi, Nam Mỹ…Cây lúa có
tầm quan trọng to lớn trong nền kinh tế của nhiều quốc gia trên thế giới nên
việc đẩy mạnh sản xuất lúa được thúc đẩy mạnh mẽ cùng với sự phát triển của
khoa học kĩ thuật. Vì vậy, năng suất lúa của thế giới trong thời gian qua đã
tăng lên nhanh chóng: từ 24,5 tạ/ha năm 1976 lên 38,27 tạ/ha năm 1997 và
11
tăng lên 40,04 tạ/ha năm 2005, đến năm 2010 là 43,73 tạ/ha còn về sản lượng
lúa thì liên tục tăng với nhịp độ khá nhanh, sản lượng lúa năm 2004 so với
năm 2002 tăng 28,64 triệu tấn.
Theo dự đoán của các chuyên gia dân số thế giới đến năm 2030 thì dân
số thế giới sẽ đạt 8,47 tỉ người, với tốc độ tăng dân số nhanh như vậy thì vấn
đề an ninh lương thực luôn là một vấn đề nóng và cấp bách hàng đầu.
Châu Á là vùng có số dân cư đông và cũng là vùng có diện tích trồng
lúa cao nhất 134 triệu ha, sản lượng đạt 477,267 triệu tấn, năng suất bình quân
đạt 36 tạ/ha (chiếm 90% lượng gạo thế giới).
Châu Âu tuy có diện tích trồng lúa nước thấp nhất nhưng năng suất
bình quân lại cao hơn các châu lục khác. Ở đầu thập niên 90 sản lượng thóc
đã tăng 78 – 80% có nước tăng gấp đôi, nhờ có việc lai tạo được nhiều giống
lúa mới có năng suất cao và kĩ thuật canh tác hiện đại. Tuy vậy nhưng ở một
số nước vẫn còn tình trạng thiếu lương thực.
Châu Phi được biết đến là một châu lục có khí hậu khắc nghiệt, có
nhiều thiên tai do vậy mà sản lượng lương thực thường bị giảm sút dẫn đến
nạn đói xảy ra thường xuyên, sản lượng lương thực bình quân đầu người của
châu lục này rất thấp.
Với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật thì một số nước có nền nông
nghiệp lạc hậu, thiếu đói triền miên nay đã vươn lên trở thành nước xuất khẩu
gạo lớn trên thế giới. Nhưng việc sản xuất lúa chưa hẳn đã đồng đều giữa các
châu lục và giữa các quốc gia, nhiều nước do nền khoa học chưa phát triển
hay điều kiện tự nhiên không thuận lợi làm cho năng suất và sản lượng lúa
chưa được cao, chưa đáp ứng được nhu cầu trong nước mà phải nhập khẩu
gạo từ các nước khác.
12
1.2.2. Tình hình sản xuất lúa gạo ở nước ta
Trước năm 1975, diện tích trồng lúa cả nước ta dao động trong khoảng
4,42 – 4,92 triệu ha, năng suất có tăng nhưng chậm, chỉ khoảng 700 kg/ha chỉ
trong vòng 20 năm sản lượng lúa cả hai miền trên dưới 10 triệu tấn. Sau năm
1975, diện tích trồng lúa tăng khá nhanh và ổn định nhưng năng suất bình
quân giảm sút khá nghiêm trọng do đất đai mới khai hoang chưa qua cải tạo,
thêm vào đó là thiên tai và sâu bệnh, cơ chế quản lí nông nghiệp theo hướng
không phù hợp. (Bảng 1.2).
Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lƣợng lúa ở nƣớc ta qua các
năm
Năm
Diện tích (triệu ha)
1955
4,42
1960
4,60
1965
4,83
1970
4,72
1975
4,94
1980
5,54
1985
5,70
1990
5,96
1995
6,77
2000
7,67
2005
7,33
2010
7,51
2013
7,89
Nguồn: tổng cục thống kê VN
13
Bước sang năm 1980, năng suất lúa tăng dần do đã khắc phục được
những nguyên nhân trên như: thay đổi cơ chế quản lý nông nghiệp bằng chủ
trương khoán sản phẩm trong sản xuất, cải thiện hệ thống kênh mương…Sau
những nỗ lực khắc phục khó khăn nước ta đã đạt được những thành tựu to
lớn. Từ một nước phải nhập khẩu gạo hàng năm thì nay chúng ta đã tự túc
được lương thực và đang dần dần tái hoà nhập vào thị trường lương thực thế
giới, chiếm lĩnh ngay vị trí quan trọng là nước xuất khẩu gạo đứng thứ 3 rồi
hàng thứ 2 trên thế giới sau Thái Lan.
Từ năm 1997 cho đến nay, hằng năm nước ta xuất khẩu trung bình trên
dưới 4 triệu tấn gạo, đem về một nguồn thu nhập ngoại tệ đáng kể. Hiện nay,
Việt Nam đứng hàng thứ 6 về diện tích gieo trồng và đứng thứ 5 về sản lượng
lúa. Hạt gạo Việt chẳng những đảm bảo được yêu cầu về an ninh lương thực
trong nước mà còn góp phần quan trọng trong thị trường lúa gạo thế giới.
Trong những năm qua, gạo xuất khẩu của nước ta tăng trưởng về số
lượng và chất lượng cũng như mở rộng thị trường. Đến nay, ngoài các thị
trường truyền thống như Iraq, Iran (Trung Đông), thị trường châu Á
(Indonesia, Philippine), Việt Nam đã mở rộng và phát triển thêm một số thị
trường tiềm năng ở các nước châu Phi, Mỹ La tinh, v.v…(Bảng 1.3).
Bảng 1.3. Xuất khẩu gạo của Việt Nam sang châu Phi, Tây Á, Nam
Á năm 2014. Đơn vị: USD
Thị trƣờng
2014
2013
(+/-%)
Châu Phi
425.704.677
775.839.817
-45
Ghana
177.860.875
182.801.079
-3
Bờ Biển Ngà
104.916.670
228.456.297
-54
Mozambique
20.039.314
29.789.300
-33
Nam Phi
17.327.655
14.393.322
+20
14
Algeria
15.810.543
39.933.942
-60
Senegal
15.244.278
17.463.168
-13
Benin
13.210.524
15.612.476
-15
Tanzania
9.558.434
16.107.609
-41
Cameroon
9.198.889
60.860.700
-85
Công-gô
8.766.325
5.967.750
+47
Angola
7.142.763
48.720.312
-85
Gabon
6.696.179
16.609.896
-60
Tây Á
38.847.409
36.007.726
+8
UAE
17.023.462
12.102.878
+41
Ả-rập Xê-út
7.960.938
7.426.895
+7
I-xra-en
4.868.292
5.878.689
-17
Ca-ta
3.455.259
1.481.569
+133
Jordan
3.010.524
2.628.741
+15
Nam Á
949.154
64.260
+1.377
Pakistan
810.935
16.500
+4.815
Sri Lanka
138.219
47.760
+189
Về giá cả của gạo Việt Nam cũng đã dần được nâng lên tương đương
với gạo của Thái Lan, vào cùng một thời điểm và cấp loại gạo. Điều này cho
thấy, chất lượng gạo và quan hệ thị trường của gạo Việt nam đã có sức cạnh
tranh ngang với gạo Thái Lan trên thị trường thế giới (Bảng 1.4).
Tại Việt Nam, 9 tháng đầu năm 2014 so với cùng kỳ năm 2013, giá
chào bán gạo xuất khẩu loại 5% tấm phổ biến ở mức 370 – 465 USD/tấn, tăng
25 – 45 USD/tấn; giá chào bán gạo xuất khẩu loại 25% tấm phổ biến ở mức
360 – 410 USD/tấn, tăng 15 – 35 USD/tấn. Cụ thể: ĐVT: USD/tấn.
15
Bảng 1.4. Giá gạo xuất khẩu của Việt Nam so với Thái Lan
(USD/tấn)
Tháng
Gạo 5% tấm
Gạo 25% tấm
Thái Lan
Việt Nam
Thái Lan
Việt Nam
Tháng 1/2014
420 – 440
415 – 430
380 – 400
385 – 395
Tháng 2/2014
420 – 440
385 – 405
380 – 400
375 – 380
Tháng 3/2014
413 – 430
370 – 400
365 – 390
360 – 375
Tháng 4/2014
390 – 400
380 – 395
355 – 365
360 – 375
Tháng 5/2014
380 – 395
385 – 410
355 – 365
370 – 375
Tháng 6/2014
370 – 400
395 – 410
350 – 360
360 – 370
Tháng 7/2014
375 – 435
405 – 465
350 – 360
365 – 410
Tháng 8/2014
430 – 445
420 – 460
360 – 400
390 – 410
Tháng 9/2014
430 – 435
445 – 450
400 – 405
400 – 410
370 – 445
370 – 465
350 – 400
360 – 410
420 – 575
355 – 420
410 – 560
325 – 395
9 tháng đầu
năm 2014
9 tháng đầu
năm 2013
9T/2014 so
với 9T/2013
Giảm 50 – 130 Tăng 25 – 45 Giảm 60 – 160 Tăng 15 – 35
Nguồn Cục quản lý giá, Bộ tài chính
1.3. Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền
Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR)
Phản ứng chuỗi polymerase do Mullis PK phát minh năm 1985 và ông
đã được trao giải thưởng Nobel về hoá học năm 1993 cho phát minh này. Đây
là phương pháp in vitro để nhân bội nhanh một đoạn DNA nào đó mà chỉ cần
một lượng mẫu ban đầu rất nhỏ. PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme để nhân
16
bội một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotit tương hợp với hai đầu 3'
ở cả hai mạch của đoạn DNA đích (Lê Duy Thành, 2001). Hiện nay có rất
nhiều chỉ thị DNA dựa trên PCR đang được áp dụng trong nghiên cứu đa
dạng di truyền nhưng phổ biến nhất là chỉ thị SSR.
Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat):
Trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền, chỉ thị SSR là một trong
những chỉ thị được dùng phổ biến nhất bởi kỹ thuật đơn giản và cho độ chính
xác cao.
SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự DNA đơn giản lặp
lại nối tiếp và chỉ gồm 1 – 6bp (Litt and Luty, 1998). Tuy nhiên, tuỳ từng loài
mà số lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến
hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục
lần hoặc nhiều hơn. Thông thường có các kiểu lặp lại:
+ Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau.
+Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số
nucleotide khác.
+ Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau.
Thông thường các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của
nhiễm sắc thể như vùng tâm động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan
trọng trong việc điều hoà phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên
nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong quá
trình phân bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan đến sự
xác định giới tính ở cả động vật và thực vật.
Bản chất đa hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ DNA
tổng số của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai
đầu của vùng lặp lại. Sự khác nhau về độ dài ở locus SSR được phát hiện bởi
sự nhân đoạn DNA nhờ phản ứng PCR. Kích thước của sản phẩm PCR được
17
xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel argose hoặc gel
polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp). Chỉ thị SSR
dùng để đánh giá đa dạng di truyền của cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh,
một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở cây lúa, lập bản đồ,
nghiên cứu locus tính trạng số lượng (QTL).
Ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR:
Thuận lợi to lớn của sự phân tích SSR là phương pháp này biểu hiện
được số lượng lớn sự đa hình, có khả năng phân biệt các cá thể khi có sự kết
hợp các locus được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trong các
thí nghiệm dòng chảy gel, xác định cây trồng và phân tích mối quan hệ di
truyền.
SSR được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong nghiên cứu cấu trúc di
truyền của lúa trồng O. sativa, nghiên cứu quá trình tiến hoá, làm rõ độ thuần
của vật liệu lai tạo giống… do đây là chỉ thị đồng trội cho đa hình cao và ổn
định. Hiện nay, hơn 15.000 chỉ thị SSR đã được thiết lập [6], phủ kín trên bản
đồ liên kết di truyền của lúa (Giarrocco và ctv, 2007). Trong những năm gần
đây, nhiều công trình sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền và
DNA fingerprinting để nhận dạng giống lúa được công bố (Kalyan và ctv,
2006).
Đã có khoảng 2740 chỉ thị SSR cho toàn bộ gen lúa và như vậy trung
bình cứ 157kp của phân tử DNA có một chỉ thị SSR.
SSR là maker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định
trong quá trình thực nghiệm. Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả
và độ chính xác của những phép toán di truyền quần thể dựa trên những
marker này so với những marker khác như RAPD. Hơn nữa, việc xác định dị
hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy
18
gel trở nên dễ dàng hơn. SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng
hoá các vật liệu di truyền và dùng trong quá trình thiết lập bản đồ di truyền.
Hạn chế của kỹ thuật SSR là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi loại
primer chỉ đặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích trên một hệ
thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau.
1.4. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền lúa trên thế giới và ở
Việt Nam
1.4.1. Trên thế giới
Tác giả Victoria và cộng sự (2007) tiến hành nghiên cứu đa dạng trên
24 giống lúa ở Philippin có chất lượng tốt bằng 164 chỉ thị SSR. Trong số
164 chỉ thị SSR có 151 chỉ thị cho đa hình với tổng số allele thu được là 890
và trung bình 5,89 allele/locus. Trong đó, có 89 chỉ thị cho 147 allele hiếm.
Hệ số đa dạng di truyền PIC từ 0,18 – 0,91 đạt trung bình 0,68/chỉ thị. Theo
kết quả phân tích UPGMA, ở độ tương đồng 40%, tổng số 24 giống lúa được
chia thành ba nhóm: Nhóm 1 gồm 8 giống Japonica, nhóm 2 và 3 là các
giống lúa Indica. Nghiên cứu này cho ta thấy việc sử dụng chỉ thị SSR là rất
hiệu quả trong phân nhóm các loài phụ của lúa, những giống lúa có chất
lượng tốt thì thường có khoảng cách di truyền cao hơn và vì thế chúng là
nguồn vật liệu cho công tác chọn giống.
Tác giả Malik Ashiq (2010), đã tiến hành đánh giá đa dạng di truyền
giữa các giống lúa truyền thống và giống lúa đã được cải tiến ở Pakistan.
Nghiên cứu thực hiện trên hai giống lúa Basmati thơm và không thơm thuộc
nhóm lúa Indica. Tổng số 41 dòng được đưa vào đánh giá bởi 30 marker SSR
được phân bố trên khắp bộ gen của lúa.
Kết quả phân tích thu được tổng số 104 allele và tất cả đều đa hình, hệ
số allele dao động 2 – 6 allele, trung bình là 3,5 allele/marker, hệ số PIC dao
19
động từ 0,259 – 0,782 (trung bình là 0,571). Sau khi số liệu được phân tích
bằng phần mềm UPGMA, 41 giống lúa đã được chia thành 2 nhóm chính:
Nhóm I gồm có 22 giống (15 giống lúa thơm Basmati và 5 giống không thơm,
hai giống lúa Japonica). Nhóm II bao gồm 19 giống lúa không thơm. Kết quả
nghiên cứu này cũng cho thấy rằng các marker SSR có thể được sử dụng để
phân tích đa dạng di truyền và chỉ ra sự khác biệt giữa giống lúa Basmati
thơm và giống lúa Basmati không thơm. Hơn nữa, việc xác định giống lúa
Basmati truyền thống dựa vào marker SSR có thể giúp ích cho việc duy trì và
bảo tồn các giống lúa có chất lượng cao vì lợi ích của cả người nông dân và
người tiêu dùng.
Theo Shahid Masood Shah (2013), sử dụng marker phân tử đánh giá đa
dạng di truyền của 40 giống lúa thơm và không thơm bằng chỉ thị SSR, 40
giống lúa này được đánh giá bởi 24 mồi. Kết quả cho thấy có tổng cộng 66
allele và hệ số allele dao động từ 2 – 4, trung bình là 2,75 allele/marker, hệ số
PIC dao động từ 0,4250 (RM252) đến 0,9750 (RM315). Hệ số PIC trung bình
của 24 cặp mồi nghiên cứu trên 40 giống lúa là 0,6472. Kết quả phân tích đa
dạng di truyền với hệ số tương đồng, 40 giống lúa được chia thành 3 nhóm
khác biệt. Kết quả này được sử dụng hữu ích cho việc theo dõi, xác định kiểu
gen và bảo vệ giống lúa.
Harsh Bansal (2013), sử dụng chỉ thị phân tử đánh giá đa dạng di
truyền của 20 giống lúa (được thu thập từ phòng di truyền học, Viện nghiên
cứu Nông nghiệp Ấn Độ) bằng chỉ thị RAPD và chỉ thị SSR. Sử dụng 20 mồi
RAPD thu được 116 băng trong đó có 114 băng đa hình. Sản phẩm sau khi
khuếch đại thu được 4 – 7 băng, trung bình 5,8 băng/marker, hệ số PIC dao
động từ 0,33 – 0,88. Sử dụng 20 mồi SSR tạo ra 65 allele, trung bình 3,2
allele/marker, hệ số PIC dao động từ 0,62 – 0,97. Kết quả phân tích hệ số
tương đồng di truyền được chia thành hai nhóm là Nhóm I và nhóm II (được
20
chia thành 2 nhóm phụ: Nhóm phụ I: gồm 17 giống trong khi nhóm phụ II:
Gồm có 2 giống). Dựa vào những kết quả được tạo ra từ nghiên cứu này
được sử dụng để tối ưu hóa để lựa chọn bố mẹ đa dạng và mở rộng cơ sở
giống cây cho các chương trình nhân giống lúa trong tương lai.
1.4.2. Ở Việt Nam
Việt Nam được xem là một trong những trung tâm khởi nguyên của cây
lúa, tài nguyên di truyền lúa của nước ta được đánh giá là phong phú cả về số
lượng và chất lượng. Các công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền và phân
loại một cách hệ thống lúa trồng ở Việt Nam còn hạn chế. Tuy vậy, trong
những năm gần đây các nhà khoa học đã rất quan tâm đến vấn đề đánh giá đa
dạng tài nguyên lúa để phục vụ cho việc lai tạo ra các giống mới có chất
lượng và khả năng chống chịu bệnh.
Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của 101 giống lúa địa phương
bằng 9 locus thuộc 5 enzymes. Kết quả cho thấy, trong số các giống thu từ
huyện Nho Quan, Ninh Bình và huyện Đà Bắc, Hoà Bình thì có 44 giống
(chiếm 43,6%) thuộc lúa Indica và 57 giống (56,4%) thuộc lúa Japonica
(Trần Danh Sửu, 2004).
Năm 2004, Nguyễn Đức Thành đã sử dụng 9 mồi RAPD (OPB8,
OPB9, OPB11, OPB12, OPB13, OPC4, OPC6, OPC19, 0PC20) chạy PCR
với DNA genome của 15 dòng lúa thu được 341 băng đa hình. Trong đó dòng
Japonica thể hiện sự khác nhau rất rõ đối với các dòng Indica còn lại. Do đó
hệ số tương đồng rất thấp ở mức độ 0,03. Các dòng Indica có hệ số có hệ số
tương đồng di truyền là 0,35. Dựa vào các kết quả của thí nghiệm trên có thể
thiết lập được các cặp lai cho ưu thế lai cao phục vụ cho công tác chọn tạo
giống.
Năm 2010, tác giả Khuất Hữu Trung và Nguyễn Thị Phương Đoài đã
sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn nguồn gen lúa
21
Tám đặc sản bản địa của Việt Nam. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy tập đoàn
lúa Tám nghiên cứu khá đa dạng: phân tích 36 cặp mồi SSR trên 26 giống
lúa Tám thu được tổng số 938 băng DNA thuộc 88 loại allele khác nhau
(trung bình 2,44 allele/cặp mồi). Hệ số PIC dao động từ 0 đến 0,65 (trung
bình 0,27). Các giống lúa Tám nghiên cứu có độ thuần di truyền khá cao, tỉ lệ
dị hợp tử trung bình của cả tập đoàn là 0,86. Hệ số tương đồng di truyền của
các giống trong tập đoàn nghiên cứu dao động trong khoảng 0,14 – 1,00. Ở
mức tương đồng di truyền 40%, tập đoàn 26 giống lúa Tám được chia thành 3
nhóm lớn. Trong đó, hai giống Tám Nghĩa Hồng và Tám con có kiểu gen
giống nhau ở cả 36 locus nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu rất có ý nghĩa phục
vụ công tác nghiên cứu lai, chọn tạo giống lúa chất lượng (Khuất Hữu Trung,
Nguyễn Thị Phương Đoài, 2010). Tiếp đó, Khuất Hữu Trung và cộng sự cũng
đã sử dụng 29 cặp mồi SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn 27
nguồn gen lúa nếp, lúa nương bản địa ở Việt Nam.
Kết quả thu được 96 loại allele, hệ số PIC dao động từ 0 đến 0,808.
Trong số 96 allele thu được, xuất hiện 8 allele hiếm (trung bình 0,27 allele
hiếm trên mỗi locus) ở 5 cặp mồi khác nhau: cặp mồi RM241 xác định
được 3 allele hiếm nhân dạng được các giống Ka tiêu, Plẩu tâu đằng dạng 2
và Nếp cẩm đen; cặp mồi RM229 xác định được 2 allele hiếm nhận dạng
được giống Nếp lùn và Kháu căm pị; các cặp mồi RM13, RM172 và
RM318, xác định được 1 allele hiếm trên mỗi locus nhận dạng được các
giống Lia tón, Tan lanh và Nếp cẩm tương ứng. Các kết quả thu được rất
hữu ích trong việc xác định nguồn gen phục vụ cho công tác bảo tồn, khai
thác và sử dụng có hiệu quả các nguồn gen lúa nếp, lúa nương của Việt
Nam (Khuất Hữu Trung và cs., 2010).
Năm 2012, Vũ Thị Thu Hiền và Phạm Văn Cường đã phân tích đa dạng
di truyền của 64 dòng/giống lúa đang canh tác trong điều kiện nhờ nước trời
22
thông qua sự có mặt và mức độ đa hình của các chỉ thị phân tử SSR. Bằng
việc sử dụng 34 chỉ thị phân tử SSR, có 8 chỉ thị không cho xuất hiện vạch ở
tất cả các dòng/giống và 2 chỉ thị xuất hiện vạch đơn hình. Hai mươi tư chỉ thị
còn lại xuất hiện đa hình với tổng số 90 allen chiếm tỷ lệ trung bình 3,75
allen/locus. Kết quả phân tích đa dạng di truyền với hệ số tương đồng là 0,65
đã phân chia nguồn vật liệu thành 7 nhóm chính. Số lượng lớn các dòng/giống
thuộc hai nhóm có hai giống đối chứng chịu hạn là CH5 và LC93-1. Kết quả
này bước đầu cho thấy các dòng/giống có khả năng chịu hạn tương tự như hai
giống đối chứng thông qua biểu hiện ở cấp độ phân tử DNA. Thông tin các
chỉ thị SSR đa hình giữa các dòng/giống rất có giá trị trong chọn giống lúa
chịu hạn nhờ chỉ thị phân tử.
23
CHƢƠNG 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu là 25 giống lúa ưu tú (NSC69 – NSC93) được cung
cấp bởi công ty Giống cây trồng Trung Ương (Bảng 2.1)
Bảng 2.1. Danh sách 25 giống lúa nghiên cứu
STT
Tên mẫu
Kí hiệu mẫu
STT
Tên mẫu
Kí hiệu mẫu
1
NSC69
S69
14
NSC82
S82
2
NSC70
S70
15
NSC83
S83
3
NSC71
S71
16
NSC84
S84
4
NSC72
S72
17
NSC85
S85
5
NSC73
S73
18
NSC86
S86
6
NSC74
S74
19
NSC87
S87
7
NSC75
S75
20
NSC88
S88
8
NSC76
S76
21
NSC89
S89
9
NSC77
S77
22
NSC90
S90
10
NSC78
S78
23
NSC91
S91
11
NSC79
S79
24
NSC92
S92
12
NSC80
S80
25
NSC93
S93
13
NSC81
S81
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 30 cặp mồi SSR được sử
dụng để phân tích thuộc các locus RM được chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do
hãng Invitrogen cung cấp dựa vào các thông tin về trình tự, kích thước, số
allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12 NST khác
nhau.
24
Bảng 2.2. Thông tin về các cặp mồi trong nghiên cứu
Nhiệt độ
STT
Tên mồi
Trình tự mồi
NST
gắn mồi
(Tm)
1
AP5659
2
RM5926
3
ARO1
4
RM21
5
RM190
6
RM208
7
RM224
8
RM247
9
RM250
10
RM585
11
RM212
12
RM3726
F: CTCCTTCAGCTGCTCCTC
R: TGATGACTTCCAAACGGTAG
F: AATTACTGTAGGTCCATCCA
R: AGATAGTATAGCGTAGCAGC
F: CATCTATCCTCCTCGGGCACA
R: GGCGGCGTCATATTCCACA
F: ACAGTATTCCGTAGGCACGG
R: GCTCCATGAGGGTGGTAGAG
F: CTTTGTCTATCTCAAGACAC
R: TTGCAGATGTTCTTCCTGATG
F: TCTGCAAGCCTTGTCTGATG
TAAGTCGATCATTGTGTGGACC
F: ATCGATCGATCTTCACGAGG
R: TGCTATAAAAGGCATTCGGG
F: TAGTGCCGATCGATGTAACG
R: CATATGGTTTTGACAAAGCG
F: GGTTCAAACCAAGCTGATCA
R: GATGAAGGCCTTCCACGCAG
F: CAGTCTTGCTCCGTTTGTTG
R: CTGTGACTGACTTGGTCATAGG
F: CCACTTTCAGCTACTACCAG
R: CACCCATTTGTCTCTCATTATG
F: CACACACATCGCTCGGTC
R: GATGTGGAGGTCGATGGC
25
Size
(bp)
6
55
330
11
55
8
55
11
55
6
55
2
55
11
55
12
55
130
2
55
154
6
55
1
55
244
12
50
193
100180
173
132157
124
166173
120152
171233
13
RM6308
14
RM13
15
RM19429
16
RM6997
17
RM8213
18
RM28561
19
Z4794
20
RM3134
21
RM216
22
RM527
23
RM1223
24
RM7102
25
RM6320
26
RM 3726
F: TCGACCTGGCTCTCCTCTAG
R: TATCAACCTGCTCCTCCTGG
F: TCCAACATGGCAAGAGAGAG
R: GGTGGCATTCGATTCCAG
F: TATGTGGTTGGCTTGCCTAGTGG
R: TGCCCATATGGTCTGGATGTGC
F: CAACGCGGCAGTAAATTTGC
R: GGCCTTGTCAGTCTACATGC
F: AGCCCAGTGATACAAAGATG
R: GCGAGGAGATACCAAGAAAG
F: TTCAAGACTGGCCCAATATTACTGC
R: TGACTGAAGCCTTCTTCACTTGC
F: CACGCCACCCTTCAATGGAGACT
R: TGAATGTGAGAGGTTGACTGTGG
F: GCAGGCACAAAAGCAAAGAG
R: AGGTGAAGGTGCATTGTGTG
F: GCATGGCCGATGGTAAAG
R: TGTATAAAACCACACGGCCA
F: GGCTCGATCTAGAAAATCCG
R: TTGCACAGGTTGCGATAGAG
F: TTCGTTTTCCTTGGTTAGTG
R: TTCGTTTTCCTTGGTTAGTG
F: TAGGAGTGTTTAGAGTGCCA
R: TCGGTTTGCTTATACATCAG
F: GAGCTGGACCTCCTCGACAC
R: CATGCATCACCGAATGAGTC
F: CACACACATCGCTCGGTC
R: GATGTGGAGGTCGATGGC
26
3
55
104
5
55
141
6
55
4
50
154
4
55
177
12
55
259
6
55
139
3
55
178
10
55
146
6
55
11
55
175
12
55
168
5
55
164
12
50
193
180220
215221
27
RM 6506
F: GTCCTTCAGGTGATTCGCC
R: GTCGCTCGAAGCCAATTAAG
28
PTA 248
F: AGACGCGGAAGGGTGGTTCCCGGA
R: AGACGCGGTAATCGAAAGATGAAA
29
MP1-MP2 F: ATCGATCGATCTTCACGAGG
R: TCGTATAAAAGGCATTCGGG
30
RM463
F: AGGTGAAGGTGCATTGTGTG
R: TGTTCTCCTCAGTCACTGCG
8
55
11
55
8
55
12
55
219
5001000
205231
192
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số
Mẫu lá của từng dòng được thu thập riêng rẽ và tách chiết DNA tổng số
theo phương pháp CTAB của Obara và Kako (1998) có cải tiến. Chuẩn bị sẵn
dung dịch đệm chiết CTAB ở 600C.
1. Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến
khi thành dạng bột mịn.
2. Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800l CTAB buffer và 60l SDS
10%.
3. Ủ mẫu ở 650C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút.
4. Bổ sung hỗn hợp CHCl3-IsoA (24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với
dịch mẫu. Lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa. Ly tâm 12000
vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hút dung dịch phía trên
chuyển sang ống mới.
5. Tiếp tục chiết lần 2 bằng hỗn hợp CHCl3-IsoA (24:1). Thu được dịch
chiết chứa DNA.
6. Tủa DNA bằng isopropanol đã làm lạnh. Để ở -200C trong 1 giờ.
7. Ly tâm thu tủa 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C.
27
8. Rửa tủa bằng etanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm
TE.
9. Độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số được kiểm tra bằng cách điện di
trên gel agarose 1% .
2.2.2. Phản ứng PCR
Tổng thể tích của phản ứng PCR là 15µl bao gồm: 1,5µl Đệm PCR
10X; 1,2µl MgCl2 25mM; 0,3µl dNTPs 10mM; 0,2µl Taq DNA polymerase 5
U/µl; 1µl mồi xuôi 10µM; 1µl mồi ngược 10µM; 1µl DNA (30 ng/µl); 3,8µl
nước cất hai lần khử ion.
2.2.3. Chu trình PCR
Bảng 2.3. Chu trình chạy PCR – SSR
Các bƣớc
I
II
III
Nhiệt độ
Thời gian
(0C)
94
5 phút
94
1 phút
Tm
45 giây
72
1 phút
72
7 phút
Số
chu kỳ
1
35
1
Giữ mẫu ở 40C
2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 6,0% và được
phát hiện dưới tia cực tím bằng phương pháp nhuộm ethidium bromide.
28
Bảng 2.4. Thành phần gel polyacrylamide
Nước cất khử ion
55,5ml
TBE 10X
3,5ml
Dung dịch acrylamide 40%
10,5ml
Dung dịch APS 10%
700µl
Dung dịch TEMED
58,4µl
Tổng thể tích gel
70ml
Trộn đều hỗn hợp các dung dịch trên và dùng xilanh bơm vào giữa hai
tấm kính.
+ Sau 30 phút gel được polyme hoá hoàn toàn. Lắp ráp máy điện di,
tiến hành điện di sản phẩm PCR cùng với thang marker 20bp ở điều kiện
150V.
Thời gian điện di khoảng 3 – 4 giờ. Lấy gel ra khỏi kính, nhuộm EtBr
nồng độ 0,5% trong 15 phút, rửa lại bằng nước sạch. Soi và chụp ảnh gel bằng
máy chụp ảnh gel DigiDoc-It.
2.2.5. Phân tích và xử lý số liệu
Kết quả được thống kê dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện các
băng DNA (các allele). Số liệu được xử lý, phân tích bằng chương trình Exel
version 5.0 và phần mềm NTSYSpc 2.1 (Rohlf FJ, 2000).
- Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công
thức sau:
PIC =1 - Pi2 (trong đó Pi là tần số xuất hiện của allele thứ i).
- Tỷ lệ dị hợp (H) của mỗi mẫu được tính theo công thức: H %
Trong đó:
X
M Y
X: là tổng số mồi có xuất hiện 2 allele/1 locus SSR
29
M: là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu.
Y: là tổng số mồi SSR không xuất hiện băng DNA.
- Tỷ lệ khuyết số liệu (M) được tính bằng công thức: M %
Trong đó:
Z
M
Z: là tổng số mồi không xuất hiện băng DNA.
M: là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu.
30
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Tách chiết axit nucleic là công việc đầu tiên đóng vai trò quan trọng
trong công nghệ DNA. Nhờ tiến bộ và sự đổi mới công nghệ mà tách chiết
axit nucleic ngày nay đã trở nên đơn giản. Hiện nay, có rất nhiều phương
pháp tách chiết DNA tổng số của mẫu thực vật. Tuy nhiên, đối với từng đối
tượng nhất định cần có phương pháp riêng. Do vậy, việc lựa chọn và cải tiến
phương pháp cho phù hợp với từng đối tượng là điều rất cần thiết và quan
trọng.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp CTAB của
Obara và Kako (1998) để tiến hành tách chiết DNA tổng số của 25 mẫu lá lúa
nghiên cứu. Kết quả tách chiết DNA tổng số của 25 mẫu lúa được kiểm tra
bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%.
Hình 3.1: Ảnh điện di DNA tổng số của 25 mẫu giống lúa nghiên
cứu
Qua kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy các băng DNA thu
được của các mẫu lúa khá gọn và đồng đều chứng tỏ chất lượng DNA của các
mẫu là khá tốt, không bị lẫn tạp chất. Mặt khác không thấy xuất hiện vệt sáng
ARN phía dưới, điều đó chứng tỏ ARN cũng đã được loại bỏ khỏi dịch chiết
DNA. Kết quả điện di cũng cho thấy DNA có nồng độ tương đối cao, chất
lượng tốt đủ tiêu chuẩn thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
31
3.2. Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử SSR trong phân tích đa dạng
di truyền
Để nghiên cứu mức độ đa hình di truyền của 25 dòng lúa, chúng tôi tiến
hành sử dụng sản phẩm DNA tách chiết được trên làm khuôn cho phản ứng
PCR lần lượt với 25 mồi nghiên cứu. Sản phẩm PCR của từng mồi được điện
di trên gel acrylamide (điện di đứng).
3.2.1 . Hệ số PIC, số allele và tổng số băng DNA thể hiện trên từng cặp
mồi
Theo Smith (1997), hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được
coi là thước đo tính đa dạng di truyền của các allele ở từng locus SSR. Weir
(1996), cho rằng, giá trị PIC có thể được hiểu như là sự đa dạng di truyền của
locus gen nghiên cứu. Giá trị PIC của 30 locus nghiên cứu thay đổi từ 0,08 (ở
2 cặp mồi xuất hiện 2 allele là RM6308 và RM261) đến 0,73 (ở cặp mồi xuất
hiện 4 allele là RM21). Hệ số PIC trung bình của 30 cặp mồi nghiên cứu là
0,49.
Qua kết quả thu được (Bảng 3.1) chúng tôi thấy với 30 cặp mồi SSR,
tổng số allele thống kê được trên 30 cặp mồi SSR là 87 loại allele, trung bình
2,90 allele/cặp mồi.
- Số mồi thể hiện 5 allele: 2 mồi (RM8213, MP1-2).
- Số mồi thể hiện 4 allele: 4
mồi
(RM21,
RM224,
RM585,
RM3726).
- Số mồi thể hiện 3 allele: 13 mồi (AP5659, RM5926, RM13,
RM208, RM247, RM250, RM6997, RM7102, RM3726,
RM19429, RM28561, RM1223, RM6320).
- Số mồi thể hiện 2 allele: 11 mồi (ARO1, RM190, RM212, RM6308,
RM3134, RM6506, RM463, RM527, RM261, PTA248, Z4794).
32
Bảng 3.1. Số allele thể hiện và hệ số PIC của 30 cặp mồi SSR
TT
Tên cặp
Số allele
mồi
thể hiện
PIC
TT Tên cặp mồi
Số allele
thể hiện
PIC
1
AP5659
3
0,47
16 RM8213
5
0,64
2
RM5926
3
0,55
17 RM3134
2
0,34
3
ARO1
2
0,40
18 RM3726
3
0,46
4
RM13
3
0,46
19 RM6506
2
0,27
5
RM21
4
0,73
20 RM19429
3
0,49
6
RM190
2
0,44
21 RM28561
3
0,54
7
RM208
3
0,51
22 Z4794
2
0,44
8
RM212
2
0,48
23 RM463
2
0,42
9
RM224
4
0,64
24 RM527
2
0,49
10
RM247
3
0,63
25 RM1223
3
0,49
11
RM250
3
0,39
26 RM7102
3
0,47
12
RM585
4
0,69
27 RM261
2
0,08
13
RM3726
4
0,69
28 PTA248
2
0,50
14
RM6308
2
0,08
29 RM6320
3
0,55
15
RM6997
3
0,61
30 MP1-2
5
0,68
87
14,63
2,90
0,49
Tổng
Trung bình
3.2.2. Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) và tỷ lệ dị hợp tử (H%) của 25 giống
lúa nghiên cứu
Tỷ lệ dị hợp tử (H%) và tỷ lệ số liệu khuyết (M%) của 25 giống lúa
nghiên cứu dựa trên kết quả phân tích với 30 cặp mồi SSR được trình bày
(Bảng 2.2) cho thấy: Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của giống NSC80 cao nhất là
33
10% (khuyết 3 mồi trong tổng số 30 cặp mồi nghiên cứu); tiếp đến là giống
NSC79 (khuyết 2 mồi trong tổng số 30 cặp mồi nghiên cứu) với tỷ lệ 6,67%;
các giống NSC70, NSC75, NSC76, NSC77, NSC78, NSC82, NSC83,
NSC85, NSC86 và NSC90 (khuyết số liệu ở 1 mồi trong tổng số 30 cặp mồi
nghiên cứu với tỷ lệ 3,33%). Các giống còn lại không bị khuyết số liệu. Tỷ lệ
khuyết số liệu trung bình của 25 giống lúa nghiên cứu khá thấp là 2,00; không
có giống nào có tỷ lệ khuyết số liệu lớn hơn 15%. Như vậy, cả 25 giống lúa
nghiên cứu đều có ý nghĩa phân tích thống kê để đánh giá đa dạng di truyền.
Tỷ lệ dị hợp tử (H) cao nhất ở 2 giống lúa NSC89 và NSC69 là 10,0%;
tiếp đến là giống lúa NSC70 và NSC77 có tỷ lệ dị hợp tử là 6,90%; giống lúa
NSC87 có tỷ lệ dị hợp tử là 6,67%; giống lúa NSC80 có tỷ lệ dị hợp tử là
3,70%; 7 giống NSC76, NSC78, NSC82, NSC83, NSC85, NSC86 và NSC90
có tỷ lệ dị hợp tử là 3,45%; giống NSC74, NSC81 và NSC88 có tỷ lệ dị hợp
tử là 3,33%. Các giống còn lại có tỷ lệ dị hợp bằng 0% (đồng hợp ở cả 25
locus nghiên cứu). Tỷ lệ dị hợp tử trung bình là 3,13%.
34
Bảng 3.2. Tỷ lệ di hợp tử (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của
các dòng lúa nghiên cứu
Số mồi
TT
khuyết số
liệu
1
NSC69
0
2
NSC70
1
3
NSC71
0
4
NSC72
0
5
NSC73
0
6
NSC74
0
7
NSC75
1
8
NSC76
1
9
NSC77
1
10 NSC78
1
11 NSC79
2
12 NSC80
3
13 NSC81
0
14 NSC82
1
15 NSC83
1
16 NSC84
0
17 NSC85
1
18 NSC86
1
19 NSC87
0
20 NSC88
0
21 NSC89
0
22 NSC90
1
23 NSC91
0
24 NSC92
0
25 NSC93
0
Trung bình
Tên
dòng
Tỷ lệ khuyết
số liệu (M%)
0,00
3,33
0,00
0,00
0,00
0,00
3,33
3,33
3,33
3,33
6,67
10,00
0,00
3,33
3,33
0,00
3,33
3,33
0,00
0,00
0,00
3,33
0,00
0,00
0,00
2,00
35
Số mồi xuất
hiện dị hợp
tử
3
2
0
0
0
1
0
1
2
1
0
2
1
1
1
0
1
1
2
1
3
1
0
0
0
Tỷ lệ dị
hợp tử
(H%)
10,00
6,90
0,00
0,00
0,00
3,33
0,00
3,45
6,90
3,45
0,00
3,70
3,33
3,45
3,45
0,00
3,45
3,45
6,67
3,33
10,00
3,45
0,00
0,00
0,00
3,13
3.2.3 Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của 25 giống
lúa nghiên cứu
* Kết quả phân tích với mồi PTA248
Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi PTA248 thu được 2 loại băng.
Trên tổng số 25 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất hiện các băng DNA từ
khoảng 500bp đến 750bp. Mồi PTA248 có 3 mẫu giống xuất hiện băng dị hợp
tử là NSC82, NSC87 và NSC88.
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 25 mẫu giống lúa
nghiên cứu với đoạn mồi PTA248 (M: marker1kb)
* Kết quả phân tích với mồi RM212
Kết quả điện di sản phẩm PCR với RM212 thu được 2 loại băng. Trên
tổng số 25 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất hiện các băng DNA từ
khoảng 118bp đến 140bp. Mẫu giống NSC81 và NSC90 có xuất hiện băng dị
hợp mẫu giống còn lại không có băng dị hợp tử và không bị khuyết số liệu.
36
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm SSR – PCR của 25 mẫu giống
lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM212 (M: marker 20bp)
* Kết quả phân tích với mồi RM7102
Kết quả điện di sản phẩm PCR với RM7102 thu được 3 loại băng. Trên
tổng số 25 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất hiện các băng DNA từ
khoảng 170bp đến 200bp. Mồi RM7102 có 3 mẫu giống xuất hiện băng dị
hợp là NSC77, NSC78 và NSC86.
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm SSR – PCR của 25 mẫu giống
lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM7102 (M: marker 20bp)
37
* Kết quả phân tích với mồi RM19429
Kết quả điện di sản phẩm PCR với RM19429 thu được 3 loại băng.
Trên tổng số 25 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất hiện các băng DNA từ
khoảng 180bp đến 220bp. Mồi RM19429 không có băng dị hợp và không
mẫu giống nào bị khuyết số liệu.
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm SSR – PCR của 25 mẫu giống
lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM19429 (M: marker 20bp)
Số liệu thu được từ tiêu bản điện di sản phẩm PCR của 30 cặp mồi SSR
với 25 giống lúa nghiên cứu được thống kê và phân tích bằng phần mềm
NTSYpc 2.1, từ đó thiết lập được bảng hệ số tương đồng di truyền và sơ đồ
hình cây (hình 3.6) về mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu.
Qua bảng hệ số tương đồng và sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa các
giống lúa nghiên cứu cho thấy: Hệ số tương đồng di truyền của 25 giống lúa
nghiên cứu dao động trong khoảng từ 0,09 giữa 4 cặp giống (NSC71 và
NSC75); (NSC 71 và NSC78); (NSC71 và NSC79); (NSC72 và NSC79) đến
0,83 (NSC69 và NSC70). Dựa vào sơ đồ phát sinh chủng loại (hình 3.6), ở
38
mức tương đồng di truyền 0,48 (48%), 25 giống lúa nghiên cứu được chia
thành 4 nhóm cách biệt di truyền.
69
70
72
71
81
84
82
83
85
88
86
90
69MW
93
92
87
89
91
73
74
75
78
79
77
80
76
0.19
0.24
0.30
0.36
0.42
0.48
0.54
0.59
0.65
0.71
0.77
0.83
Coefficient
Hình 3.6. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa 25 giống
lúa nghiên cứu
39
Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa 25 mẫu giống lúa
nghiên cứu
40
Nhóm I: Gồm 4 giống lúa là NSC69, NSC70, NSC71 và NSC72.
Nhóm này có hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng từ 0,50 (giữa
NSC69 và NSC71) đến 0,83 (giữa NSC69 và NSC70).
Nhóm II: Gồm 4 giống lúa là NSC81, NSC82, NSC83 và NSC84 có hệ
số tương đồng di truyền dao động trong khoảng từ 0,43 (giữa NSC83 và
NSC84) đến 0,62 (giữa NSC81 và NSC84).
Nhóm III: Gồm 9 giống lúa (NSC85, NSC86, NSC87, NSC88,
NSC89, NSC90, NSC91, NSC92 và NSC93) có hệ số tương đồng di truyền
dao động trong khoảng từ 0,45 (giữa NSC87 và NSC90) đến 0,75 (giữa
NSC89 và NSC91).
Nhóm IV: Gồm có 8 giống lúa (NSC73, NSC74, NSC75, NSC76,
NSC77, NSC78, NSC79 và NSC80) có hệ số tương đồng di truyền dao động
trong khoảng từ 0,42 (giữa NSC73 và NSC76) đến 0,78 (giữa NSC78 và
NSC79).
41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Tập đoàn giống lúa nghiên cứu đa dạng về thành phần allele. Kết quả
phân tích 30 cặp mồi SSR với 25 giống lúa thu được tổng số 87 loại allele,
trung bình 2,90 allele/cặp mồi. Hệ số PIC dao động từ 0,08 đến 0,73 (trung
bình 0,49). Tỷ lệ dị hợp của các mẫu nghiên cứu dao động từ 0% đến 10,0%
(trung bình là 3,13%). Hệ số tương đồng di truyền của 25 giống lúa nghiên
cứu dao động trong khoảng từ 0,09 giữa 4 cặp giống (NSC71 và NSC75);
(NSC71 và NSC78); (NSC71 và NSC79); (NSC72 và NSC79) đến 0,83 (giữa
NSC69 và NSC70). Dựa vào sơ đồ phát sinh chủng loại, ở mức tương đồng di
truyền 0,48 (48%), 25 giống lúa nghiên cứu được chia thành 4 nhóm cách biệt
di truyền.
2. Kiến nghị
Cần tiếp tục nghiên cứu xác định các allele đặc trưng, allele hiếm để
nhận dạng chính xác các nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu chọn, lai tạo
giống và định hướng phát triển giống lúa năng suất và chất lượng cao.
42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bùi Mạnh Cường (2007), Công nghệ sinh học trong chọn giống ngô,
NXB Nông nghiệp.
2. Vũ Thị Thu Hiền, Phạm Văn Cường (2012), “Phân tích đa dạng di
truyền mẫu giống lúa canh tác nước trời bằng chỉ thị SSR”, Tạp chí
Khoa học và Phát triển 10 (1), tr. 15-24.
3. Trần Danh Sửu, Đỗ Đức Tuyến, Lưu Ngọc Trình, Nguyễn Thị Ngọc
Huệ (2004), Nghiên cứu đa dạng di truyền các giống lúa do nông dân
đặt tên (Oryza sativa) trên cơ sở phân tích đẳng men, bảo tồn nội vi tài
nguyên cây trồng vì sự phát triển bền vững, NXB Nông nghiệp Hà Nội,
tr. 54-60.
4. Nguyễn Đức Thành (2004), “Nghiên cứu đa dạng di truyền một số
dòng lúa chọn làm cặp lai trong tạo giống năng suất cao”, Tạp chí công
nghệ sinh học 2 (1), tr. 101-108.
5. Khuất Hữu Trung, Nguyễn Thị Phương Đoài (2010), “ Nghiên cứu đa
dạng di truyền và nhận dạng một số giống trong tập đoàn lúa Tám đặc
sản của Việt Nam bằng chỉ thị phân tử SSR (microsatellite) ”, Tạp chí
Nông nghiệp và PTNT (149), tr. 3-8.
Tài liệu internet
6. www.gramene.org
7. http://fsiu.mard.gov.vn/data/trongtrot.htm
Tài liệu tiếng Anh
8. Chang, T.T. 1976. The rice culture. Philosophical Transactions of the
Royal Society. London, B, 275:143-157.
43
9. Chang, T.T. 1985. Crop history and genetic conservation: Rice - A case
study. Iowa State Journal of Research, Vol 59 (4): 425-455.
10. Chatterjee, D. 1948. A modified key and enumeration of the species of
Oryza Linn. Indian J. Agr. Sci. 18: 185-192.
11. Chevalier, A. 1932. Nouvelle contribution à l’ étude systématique des
Oryza. Rev. Bot. Appl. Agr. Trop. 12: 1014-1032.
12. De Candolle. 1883. Origines des plantes cultivées. Bibliothèque
scientifique internationale. Paris.
13. Giarrocco LE, Marassib MA and Salernoa GL. (2007), Assessment of
the genetic diversity in Argentine Rice Cultivars with SSR Markers.
Crop Sci 47, 853-858.13.
14. Harsh B., Ravindra K. and Sanjay V. (2013), Analysis of diversity in
rice (Oryza sativa L.) using random amplified polymorphic DNA
(RAPD) and simple sequence repeats (SSR) markers, Vol. 12(35), pp.
5404-5412.
15. Kalyan CB and Rambabu N. (2006), SSR marker based DNA
fingerprinting and diversity study in rice (Oryza sativa L.). ẠJB 5 (9),
684-688.16.
16. Litt M, Luty JA. (1989), A hypervariable microsatellite revealed by in
vitro amplìication of a dinucleotied repeat within the cardiac muscle
actin gene. Amr J Hum Genet 44, 397-401.
17. Malik AR., Muhammad SM., Zabta KS and Kazuko YS. (2010),
Genetic analysis of Basmati and non-Basmati Pakistani rice (Oryza
sativa L.) cultivars using microsatellite markers. Pak. J. Bot. 42, 25512564.
18. Morinaga, T. 1972. Japanese rice and its introduction from abroad. In
Morinaga, T., Kihara, H., Tshukuba, J and Ueno, M. eds. History of
44
Biology in Japan of dawn of its civilization, Yokendo, Tokyo (trong
Matsuo, 1997).
19. Nayar, N. M. 1973. Origin and cytogenetics of rice. Advances in
Genetics, vol 17, Academic Press Inc., New York and London.
20. Nakagahra, M. 1976. The differentiation of cultivated rice based on
geographical distribution of marker genes. Current Advances in
Breeding, 17: 35-44 (trong Matsuo, 1997).
21. Pilger, R. 1915. Neue und weniger bekannte Graminee aus Papuasien.
Bot. Jaarb. 52: 167-176 (trong Nayar, 1973).
22. Shahid MS, Shahzad AN and Muhamad A. (2013), Genetic diversity
in basmati and non-basmati rice varieties based on microsatellite
markers.Pak. J. Bot., 45(S1), pp. 423-431.
23. Sharma S. D.1973. Evolution in genus Oryza. In Advancing Frontiers
in Cytogenetics. Hindustan Publishing Corp., New Delhi, pp. 5-10.
24. Sharma, S. D. and Shastry, S.V.S. 1971. Phylogenetic studies in genus
Oryza I. Primitive characters. Riso, 20: 127-136.
25. Ting, Y .1949. Origin of rice cultivation in China. Coll. Agr. Sun. Yat.
Sen. Univ., Agron. Bull., Ser. III No. 7: 18 (in Chinese).
26. Victoria CL., Darshan SB., Toshinori A., Edilberto DR. (2007),
“Assessment of Genetic Diversity of Philippine Rice Cultivars Carring
Good Quality trait using SSR marker”, Breeding Science (57), pp. 263270.
27. Watt, G. 1892. Rice. In Dictionary of Economic Products of India,
Superintendent, Gov. Printing, Calcutta, 5: 498-653.
45
[...]... nguồn gen lúa nếp, lúa nương của Việt Nam (Khuất Hữu Trung và cs., 2010) Năm 2012, Vũ Thị Thu Hiền và Phạm Văn Cường đã phân tích đa dạng di truyền của 64 dòng /giống lúa đang canh tác trong điều kiện nhờ nước trời 22 thông qua sự có mặt và mức độ đa hình của các chỉ thị phân tử SSR Bằng việc sử dụng 34 chỉ thị phân tử SSR, có 8 chỉ thị không cho xuất hiện vạch ở tất cả các dòng /giống và 2 chỉ thị xuất... chỉ đặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau 1.4 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền lúa trên thế giới và ở Việt Nam 1.4.1 Trên thế giới Tác giả Victoria và cộng sự (2007) tiến hành nghiên cứu đa dạng trên 24 giống lúa ở Philippin có chất lượng tốt bằng 164 chỉ thị SSR Trong số 164 chỉ thị SSR có 151 chỉ thị cho đa. .. nhiều chỉ thị DNA dựa trên PCR đang được áp dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng phổ biến nhất là chỉ thị SSR Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat): Trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền, chỉ thị SSR là một trong những chỉ thị được dùng phổ biến nhất bởi kỹ thuật đơn giản và cho độ chính xác cao SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự DNA đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ gồm... đồng, 40 giống lúa được chia thành 3 nhóm khác biệt Kết quả này được sử dụng hữu ích cho việc theo dõi, xác định kiểu gen và bảo vệ giống lúa Harsh Bansal (2013), sử dụng chỉ thị phân tử đánh giá đa dạng di truyền của 20 giống lúa (được thu thập từ phòng di truyền học, Viện nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ) bằng chỉ thị RAPD và chỉ thị SSR Sử dụng 20 mồi RAPD thu được 116 băng trong đó có 114 băng đa hình... Trong đó, có 89 chỉ thị cho 147 allele hiếm Hệ số đa dạng di truyền PIC từ 0,18 – 0,91 đạt trung bình 0,68 /chỉ thị Theo kết quả phân tích UPGMA, ở độ tương đồng 40%, tổng số 24 giống lúa được chia thành ba nhóm: Nhóm 1 gồm 8 giống Japonica, nhóm 2 và 3 là các giống lúa Indica Nghiên cứu này cho ta thấy việc sử dụng chỉ thị SSR là rất hiệu quả trong phân nhóm các loài phụ của lúa, những giống lúa có chất... nhiều công trình sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền và DNA fingerprinting để nhận dạng giống lúa được công bố (Kalyan và ctv, 2006) Đã có khoảng 2740 chỉ thị SSR cho toàn bộ gen lúa và như vậy trung bình cứ 157kp của phân tử DNA có một chỉ thị SSR SSR là maker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định trong quá trình thực nghiệm Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu... Đoài đã sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn nguồn gen lúa 21 Tám đặc sản bản địa của Việt Nam Kết quả nghiên cứu đã cho thấy tập đoàn lúa Tám nghiên cứu khá đa dạng: phân tích 36 cặp mồi SSR trên 26 giống lúa Tám thu được tổng số 938 băng DNA thuộc 88 loại allele khác nhau (trung bình 2,44 allele/cặp mồi) Hệ số PIC dao động từ 0 đến 0,65 (trung bình 0,27) Các giống lúa Tám nghiên... phân tử đánh giá đa dạng di truyền của 40 giống lúa thơm và không thơm bằng chỉ thị SSR, 40 giống lúa này được đánh giá bởi 24 mồi Kết quả cho thấy có tổng cộng 66 allele và hệ số allele dao động từ 2 – 4, trung bình là 2,75 allele/marker, hệ số PIC dao động từ 0,4250 (RM252) đến 0,9750 (RM315) Hệ số PIC trung bình của 24 cặp mồi nghiên cứu trên 40 giống lúa là 0,6472 Kết quả phân tích đa dạng di truyền. .. biểu hiện ở cấp độ phân tử DNA Thông tin các chỉ thị SSR đa hình giữa các dòng /giống rất có giá trị trong chọn giống lúa chịu hạn nhờ chỉ thị phân tử 23 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu là 25 giống lúa ưu tú (NSC69 – NSC93) được cung cấp bởi công ty Giống cây trồng Trung Ương (Bảng 2.1) Bảng 2.1 Danh sách 25 giống lúa nghiên cứu STT... lúa Japonica) Nhóm II bao gồm 19 giống lúa không thơm Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy rằng các marker SSR có thể được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền và chỉ ra sự khác biệt giữa giống lúa Basmati thơm và giống lúa Basmati không thơm Hơn nữa, việc xác định giống lúa Basmati truyền thống dựa vào marker SSR có thể giúp ích cho việc duy trì và bảo tồn các giống lúa có chất lượng cao vì lợi ích ... hành nghiên cứu đề tài: Phân tích đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa ưu tú (NSC69 – NSC93) thị phân tử SSR Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đa dạng di truyền dòng /giống lúa nghiên cứu, xác định... 2001) Hiện có nhiều thị DNA dựa PCR áp dụng nghiên cứu đa dạng di truyền phổ biến thị SSR Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat): Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, thị SSR thị dùng phổ biến kỹ... thấy marker SSR sử dụng để phân tích đa dạng di truyền khác biệt giống lúa Basmati thơm giống lúa Basmati không thơm Hơn nữa, việc xác định giống lúa Basmati truyền thống dựa vào marker SSR giúp