Chẩn đoán vi khuẩn tả ở người đến xét nghiệm tại bệnh viện quân y 103 năm 2013 bằng kỹ thuật PCR

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRƯƠNG THỊ LAN HƯƠNG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN TẢ Ở NGƯỜI ĐẾN XÉT NGHIỆM TẠI BỆNH VIỆN QUÂN Y 103 NĂM 2013 BẰNG KỸ THUẬT PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRƯƠNG THỊ LAN HƯƠNG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN TẢ Ở NGƯỜI ĐẾN XÉT NGHIỆM TẠI BỆNH VIỆN QUÂN Y 103 NĂM 2013 BẰNG KỸ THUẬT PCR Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS KIỀU CHÍ THÀNH PGS.TS PHẠM VĂN TY Hà Nội – 2014 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Kiều Chí Thành PGS.TS Phạm Văn Ty người trực tiếp hướng dẫn khoa học tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình tơi nghiên cứu, hồn thành đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn anh chị cán khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn – Bệnh viên Quân y 103 nhiệt tình giúp đỡ, bảo chia sẻ với tơi thời gian thực tập Nhân dịp này, xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh học, thầy giáo, cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học động viên, dẫn, đóng góp ý kiến tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ suốt q trình tơi thực đề tài Hà Nội tháng 12-2014 Học viên: Trương Thị Lan Hương Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 1.Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1 Tình hình bệnh tả 1.1.1 Tình hình bệnh tả giới 1.2 Vi khuẩn tả 1.2.1 Đặc điểm hình thái 1.2.2 Phân loại 1.2.3 Kháng nguyên cấu trúc lớp vỏ vi khuẩn 10 1.2.4 Độc tố vi khuẩn tả 10 1.2.5 Khả gây bệnh 12 1.2.6 Diễn biến bệnh 17 1.2.7 Chẩn đoán 17 1.2.7.1 Thời kỳ ủ bệnh 17 1.2.7.2 Thời kỳ khởi phát 17 1.2.7.3 Thời kỳ toàn phát 18 1.2.8 Một số phương pháp chẩn đoán tả 18 1.3 Tổng quan kĩ thuật PCR 19 1.3.1 Nguyên tắc kỹ thuật PCR 19 1.3.2 Các giai đoạn chu kì phản ứng PCR 19 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 21 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương 1.3.4 Ứng dụng kĩ thuật PCR y học 23 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 26 2.2 Vật liệu nghiên cứu 26 2.2.1 Chủng giống vi sinh vật 26 2.2.2 Mồi PCR 26 2.3 Hóa chất thiêt bị 27 2.3.1 Hóa chất 27 2.3.2 Thiết bị 28 2.3.3 Môi trường nuôi cấy dung dịch đệm 28 2.4 Phương pháp nghiên cứu 28 2.4.1 Phương pháp mô tả 28 2.4.1.1 Cỡ mẫu cách chọn mẫu 29 2.4.1.2 Các kỹ thuật lấy mẫu vận chuyển bệnh phẩm 29 2.4.2 Phương pháp cấy truyền giữ giống vi sinh vật 30 2.4.3 Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen appA phyC 31 2.4.4 Tách chiết ADN khuôn mẫu KIT QIAGEN 31 2.4.5 Phương pháp m-PCR dùng để xác định nhanh serogroup O1, O139 hai biotype V cholerae serogroup O1 32 2.4.5.1 Phản ứng m-PCR1 32 2.4.5.1 Phản ứng m-PCR2 33 2.4.6 Điện di sản phẩm PCR 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35 3.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 35 3.1.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới tính, lứa tuổi 35 3.2 Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen mã hóa cholera toxin ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA rstR 38 3.2.1 Phân tích trình tự gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA rstR 38 3.1.2 Thiết kế mồi nhân gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA rstR từ V Cholerae 46 3.3 Khuếch đại gen ctxA, rfb từ V Cholerae phản ứng m-PCR1 47 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương 3.4 Khuếch đại gen tcpA, rstR từ V Cholerae m-PCR2 50 3.5 So sánh phương pháp chẩn đoán tả kĩ PCR với kĩ thuật chẩn đoán tả kĩ thuật nuôi cấy kết hợp sử dụng kháng huyết 63 KẾT LUẬN 54 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Phân lập V cholerae týp cổ điển týp El Tor Bảng 2.1 Các đoạn mồi dùng kỹ thuật m-PCR phát gen đặc hiệu V cholerae 27 Bảng 2 Hỗn hợp phản ứng cho m-PCR1 đa mồi Master-Mix (promega) 32 Bảng Hỗn hợp phản ứng cho m-PCR2 đa mồi Master-Mix (promega) .33 Bảng 3.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, tuổi 35 Bảng 3.2 Tỷ lệ bệnh nhân theo tuổi 36 Bảng 3.3 Phân bố bệnh nhân dương tính V cholerae theo giới tính 37 Bảng 3.4 Danh sách chủng V Cholerae nghiên cứu để thiết kế mồi .38 Bảng 3.5 Danh sách chủng V cholera O1 sử dụng để thiết kế mồi 40 Bảng 3.6 Danh sách chủng V cholera O139 sử dụng để thiết kế mồi 41 Bảng 3.7 Danh sách chủng V cholera O1 El Tor sử dụng để thiết kế mồi 42 Bảng 3.8 Danh sách chủng V cholera O1 nghiên cứu để thiết kế mồi nhân gen rstR 44 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thông số chu kỳ nhiệt đến phản ứng PCR khuếch đại gen ctxA, rfb 48 Bảng 3.10 Ảnh hưởng thông số chu kỳ nhiệt đến phản ứng PCR khuếch đại gen tcpA, rstR từ V Cholerae m-PCR2 51 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Tình hình bệnh tả Việt Nam từ năm 2002 – 2011 Hình 1.2 Phân bố ca bệnh tả Việt Nam, 2007 – 2011 Hình 1.3 Hình thái ngồi vi khuẩn tả V cholerae Hình 1.4 Biểu đồ khu trú vi khuẩn ruột 13 Hình 1.5 Cơ chế gây bệnh Vibrio bên thể người 14 Hình Các bước thực phản ứng PCR chu kỳ 20 Hình 3.1 Biểu đồ phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới tính 35 Hình 3.2 Biểu đồ đánh giá độ tuổi thu thập mẫu 37 Hình 3.3 Kết so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ 3’) gen mã hóa cholera toxin có nguồn gốc từ V cholerae 39 Hình 3.4 Trình tự gen ctxA mã hóa cholera toxin từ V cholerae sử dụng để thiết kế mồi 39 Hình 3.5 Kết so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ 3’) gen rfbQ có nguồn gốc từ V cholerae O1 40 Hình 3.6 Trình tự gen rfbQ từ V cholerae O1 sử dụng để thiết kế mồi .41 Hình 3.7 Kết so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ 3’) gen IS1358 từ chủng V cholera O139 41 Hình 3.8 Trình tự gen IS1358 từ V cholerae O139 sử dụng để thiết kế mồi 42 Hình 3.9 Kết so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ 3’) gen tcpA từ chủng V cholera O1 biotype El Tor 43 Hình 3.10 Trình tự gen tcpA từ V cholerae O1 sử dụng để thiết kế mồi 44 Hình 3.11 Kết so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ 3’) gen mã hóa toxin coregulated pilus có nguồn gốc từ V cholera O1 biotype Classical 45 Hình 3.12 Trình tự gen rstR từ V cholerae O1 sử dụng để thiết kế mồi]…………46 Hình 3.13 Kết điện di sản phẩm m-PCR1 nhân gen ctxA, gen rfb O1 rfb O139………….… … 49 Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm m-PCR2 nhân gen tcpA, rstR từ V Cholerae 52 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tên đầy đủ AOX Alcohol Oxidase bp Base pair CS Cộng TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose ( Môi trường chọn lọc nuôi cấy vi khuẩn tả ) V.cholerae Vibriocholerae (Vi khuẩn tả ) Kb Kilo base KDa Kilo Dalton IU International Unit PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium Dodecyl Sulfate VSV Vi sinh vật CT Cholerae Toxin ( Độc tố tả ) N.A.G Non Aglutinable Vibrios NCBI National Center for Biomedical Informatics m- PCR Multiplex Polymerase Chain Reaction Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Vibrio cholerae tác nhân quan trọng gây bệnh dịch tả người, đặc biệt hai serogroup O1, O139 [49], gây chết hàng triệu người năm giới [60] Dịch tiêu chảy cấp có chiều hướng gia tăng địa phương nhiều địa phương Khống chế dịch tả mục tiêu lớn chương trình quốc gia phịng chống bệnh tiêu chảy Việt Nam Với thành tựu kinh nghiệm phòng chống dịch tả nhiều năm qua, ngày bệnh tả khơng cịn nỗi khiếp đảm người dân, tổ chức quyền xã hội Các điều kiện chuẩn mực kiểm sốt mơi trường nước ta cịn lạc hậu Các vấn đề cung cấp nước, vệ sinh thực phẩm, dinh dưỡng an toàn vấn đề xử lý vệ sinh chất thải chưa làm bao nhiêu, nhiều nơi bị buông lỏng quên lãng Bệnh nhân mắc bệnh tả không phát sớm điều trị kịp thời bị nước chất điện giải dẫn đến tử vong [53] Bệnh tả lây truyền nhanh qua đường tiêu hố mơi trường (nước, chất nôn, phân, rác) việc phát sàng lọc mẫu âm tính nhanh có ý nghĩa quan trọng, khơng giúp đỡ bệnh nhân có phác đồ điều trị mà giúp nhà dịch tễ có hướng xử lý khoanh vùng, chủ động phịng chống dịch, không để dịch lây lan rộng cộng đồng Trong phương pháp ni cấy phân lập thực phổ biến để định danh loài vi khuẩn xem tiêu chuẩn vàng Tuy nhiên chi phí cao, tốn nhiều thời gian nhân công đồng thời phân biệt cách xác V cholerae chủng sinh độc tố không sinh độc tố [15] Vấn đề phát nhanh xác V cholerae việc làm cần thiết Cho nên mPCR xem công cụ hữu hiệu để giúp xác định nhanh Vibrio gây bệnh, xác định nhanh serogroup biotype V cholerae [38] Đáp ứng với tình hình thực tiễn kể trên, tiến hành thực đề tài: "Chẩn đoán vi khuẩn tả người đến xét nghiệm bệnh viện Quân y 103 năm 2013 kỹ thuật PCR" Mục đích nghiên cứu Xác định tỷ lệ bệnh nhân dương tính với Vibrio cholerae (V cholerae) giai đoạn từ tháng năm 2013 đến tháng năm 2013 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương hợp Sản phẩm PCR sử dụng cho bước nghiên cứu Chu trình phản ứng m – PCR1 tối ưu để khuếch đại đoạn gen ctxA, rfbO1 rfbO139 sử dụng cặp mồi thiết kế mục 3.2 sau: bước biến tính 94°C phút 30 giây, 30 chu kỳ nhiệt (94°C 30 giây, 52°C 30 giây, 72°C 30 giây) kết thúc với pha hoàn tất 72°C phút Thực nghiệm cho thấy cặp gen mồi cho kết dương tính chủng O1 O139 vi khuẩn tả phân lập từ vụ dịch trước (đối chứng +) cặp gen mồi không khuếch đại hệ gen vi khuẩn gặp đường tiêu hóa vi khuẩn Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp, E coli ATCC 11775 kết hình (đối chứng – Hình 3.13) Nhiều nghiên cứu gần xác định số chủng vi khuẩn tả Vibrio cholerae O1 mơi trường tự nhiên khơng có độc tố, chủng trở thành sinh độc tố nhiễm phage có mang đoạn gen độc tố CTX, biến đổi xảy đường tiêu hóa người hay động vật [6] Như việc khuếch đại vùng gen đặc trưng vi khuẩn tả (một vùng gen mã hóa cho kháng nguyên đặc hiệu O1, vùng gen cho độc tố tả) làm cho quy trình khuếch đại dùng để xác định vi khuẩn tả với nguồn bệnh phẩm từ người bệnh từ nguồn nước môi trường Kết 16 mẫu 162 mẫu bệnh phẩm nghiên cứu dương tính đồng thời gen ctxA gen rfbO1 hoặc/ rfbO139 cho thấy khả diện V cholerae mang gen độc lực mẫu bệnh phẩm Tần số xuất serogroup mang gen độc lực V cholerae mẫu bệnh phẩm thấp Điều cho thấy serogroup V cholerae tồn mẫu bệnh phẩm môi trường chủ yếu non-O1, O139 [32] dịng V cholerae O1 O139 khơng sinh độc tố CT [37] Chúng tiến hành định biotype 16 mẫu cho kết dương tính đồng thời với gen V cholerae O1 phản ứng m-PCR2 3.4 Khuếch đại gen tcpA, rstR từ V Cholerae m-PCR2 Các mẫu dương tính đồng thời gen ctxA rfbO1 ghi nhận để tiếp tục thực phản ứng m-PCR2 nhằm xác định biotype El Tor cổ điển V cholerae O1 Các đoạn mồi thiết kế phân biệt hai biotype dựa vào gen tcpA rstR Nhằm thu sản phẩm PCR chứa đoạn ADN có kích thước xung quanh vùng 451bp Chuyên ngành Vi sinh vật học 50 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương 620bp tiến hành phản ứng PCR với thay đổi nồng độ ADN, chu kì nhiệt, nhiệt độ gắn mồi nồng độ enzyme Phusion HF DNA polimeraza sau: Bảng 3.10 Ảnh hưởng thông số chu kỳ nhiệt đến phản ứng PCR khuếch đại gen tcpA, rstR từ V Cholerae m-PCR2 Phản ứng PCR nhân gen Chu kì nhiệt Nhiệt độ Nồng độ gắn mồi enzyme HF ( C) (u/µl) Nồng độ AND khn (ng/ µl) Kết tcpA rstR 30 57 u/ 50µl 1µl - tcpA rstR 30 57 u/ 50µl 1µl - tcpA rstR 35 57 u/ 50µl 1µl ADN - tcpA rstR 35 57 u/ 50µl 1µl ADN - tcpA rstR 30 55 u/ 50µl 3µl - tcpA rstR 35 55 u/ 50µl 1µl - tcpA rstR 30 52 u/ 50µl 3µl - tcpA rstR 35 52 u/ 50µl 1µl - tcpA rstR 30 50 u/ 50µl 3µl + tcpA rstR 30 50 u/ 50µl 5µl + tcpA rstR 35 50 u/ 50µl 3µl ADN + tcpA rstR 25 50 u/ 50µl 5µl ADN + tcpA rstR 30 47 u/ 50µl 3µl ++ tcpA rstR 35 47 u/ 50µl 5µl ADN ++ tcpA rstR 30 47 u/ 50µl 5µl ADN ++ tcpA rstR 30 47 u/ 50µl 3µl ADN +++ tcpA rstR 20 52 u/ 50µl 5µl ADN + Ghi chú: “ – ’’ Khơng có sản phẩm PCR “ + ’’ Có lượng nhỏ sản phẩm PCR “ ++’’ Có lượng trung bình sản phẩm PCR Chun ngành Vi sinh vật học 51 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương “ +++’’ Có lượng lớn sản phẩm PCR Sau điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi từ 57 C xuống 47 C, nồng độ Phusion HF DNA polimeraza 1u/50µl lên 2u/50µl, 20 chu kì nhiệt lên 30 chu kì, µl ADN khn, sản phẩm PCR nhân gen tcpA rstR thu đặc hiệu Sản phẩm thu phản ứng PCR kiểm tra điện di gel agarose 0,8% ĐC- ĐC+ ĐC+ M 620bp 451bp Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm m-PCR2 nhân gen tcpA, rstR từ V Cholerae M: Thang ADN chuẩn 100bp ĐC-: Đối chứng âm O1: Đối chứng dương chủng O1 Classical mang gen rstR (620bp) O1: Đối chứng dương chủng O1 El Tor mang gen tcpA (451bp) 1-5: mẫu Chúng tiến hành định biotype mẫu cho kết dương tính đồng thời với gen V cholerae O1, có mẫu cho kết dương tính với gen tcpA (Hình 3.14) có kích thước 451bp Thật vậy, trái với nghiên cứu trước cho hầu hết dòng V cholerae O1 cho kết dương tính với ctxA tcpA (Faruque cs, 1998) [26], 37% số mẫu xác định V cholerae O1 không diện gen ctxA tcpA (Alvazes cs, 2007) [7] Ngoài ra, số nghiên cứu chứng Chuyên ngành Vi sinh vật học 52 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương minh số dòng Vibrio cholerae non-O1/ non-O139 có khả mang đồng thời hai gen độc lực ctxA tcpA (Stepphalie cs, 2001) [61] Kết nghiên cứu cho thấy khơng có mẫu cho kết dương tính với V cholerae O1 biotype cổ điển Từ năm 1961, V cholerae O1 biotype El Tor thay V cholerae O1 biotype cổ điển ổ dịch tả [5] Hầu hết gốc phân lập từ Việt Nam Bangladesh El Tor [54] Tuy nhiên, tất nghiên cứu cho thấy V cholerae O1 biotype cổ điển biến mà chúng tồn Nghiên cứu [59] khảo sát 41 dòng V cholerae O1 phân lập châu Á châu Phi từ năm 1991 đến năm 2004 cho thấy tất dòng cho kết dương tính với gen rfbO1, hầu hết mang gen rstR đặc hiệu cho biotype cổ điển (620bp) ngoại trừ dòng Việt Nam mang tcpA El Tor 3.5 So sánh phương pháp chẩn đoán tả kĩ PCR với kĩ thuật chẩn đoán tả kĩ thuật nuôi cấy kết hợp sử dụng kháng huyết Chẩn đốn tả kĩ thuật ni cấy xem ”tiêu chuẩn vàng” kết xác Tuy nhiên với phương pháp thời gian trả lời kết lâu phát V cholerae bệnh nhân sử dụng thuốc kháng sinh Mặt khác, kháng huyết có thời hạn sử dụng ngắn, năm gần khơng có dịch tả nên việc trì ln có kháng huyết gặp nhiều khó khăn Trong đó, việc chẩn đốn tả kĩ thuật PCR cho kết nhanh, có độ nhạy, độ đặc hiệu cao sử dụng bệnh nhân dùng thuốc kháng sinh Chuyên ngành Vi sinh vật học 53 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương KẾT LUẬN Qua q trình thực đề tài, chúng tơi thu số kết sau: Thiết kế mồi xuôi mồi ngược để nhân gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA rstR đặc hiệu chương trình khuếch đại gen phù hợp Tách chiết ADN gen từ V cholerae sử dụng KIT, làm khuôn cho phản ứng nhân gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA rstR phản ứng m - PCR Tối ưu hóa điều kiện phản ứng m – PCR1, để nhân gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA rstR - Đối với gen ctxA, rfbQ, IS1358: biến tính 94°C phút 30 giây, 30 chu kỳ nhiệt (94°C 30 giây, 52°C 30 giây, 72°C 30 giây) kết thúc với pha hoàn tất 72°C phút - Đối với gen tcpA rstR: biến tính 94°C phút 30 giây, 30 chu kỳ nhiệt (94°C 30 giây, 47°C 30 giây, 72°C 30 giây) kết thúc với pha hoàn tất 72°C phút Xác định 16/162 mẫu bệnh phẩm dương tính với gen ctxA rfbO1, rfbO139 Chỉ phát gen tcpA đặc trưng cho V cholerae O1 biotype El Tor 3/16 mẫu bệnh phẩm, không mẫu cho kết dương tính với rstR đặc trưng cho V cholerae O1 biotype cổ điển Chuyên ngành Vi sinh vật học 54 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện phương pháp phát triển kỹ thuật mẫu bệnh khác để có kỹ thuật PCR phát nhiều biến chủng V choleare - Mở rộng phương pháp nghiên cứu sang đối tượng gây bệnh truyền nhiễm khác để xây dựng quy trình tương tự - Nghiên cứu, kết hợp PCR với phương pháp khác để cải tiến hiệu nghiên cứu ứng dụng cho thực tế - Thử nghiệm phát mẫu bệnh nhiễm V choleare với cỡ mẫu lớn đưa kỹ thuật PCR xây dựng áp dụng mẫu bệnh phẩm lâm sàng để đánh giá hiệu chẩn đoán kỹ thuật tạo Chuyên ngành Vi sinh vật học 55 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Trần Linh Thước (2009), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB Giáo dục Nguyễn Vũ Trung Nguyễn Thị Hồng Nhung (2008), Hoàn thiện kỹ thuật tách chiết ADN Shigella EIEC trực tiếp từ phân, Nghiên cứu y học, 55(3): p.104-109 Nguyễn Vũ Trung Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2008), Phát triển hồn thiện qui trình tách chiết AND xác định trực tiếp Escherichia coli gây tiêu chảy PCR, Nghiên cứu y học, 56(4): p 92-97 Phạm Thế Vũ (2008), Nghiên cứu ứng dụng số kỹ thuật chẩn đoán nhanh Vibrio cholerae gây dịch tiêu chảy cấp tỉnh Thái Nguyên năm 2008, Luận văn thạc sĩ Sinh học: 29 – 31 Tài liệu tiếng Anh Agarwal, V., et al., 1995 Rapid detection of Vibriocholerae 0139 in faecal specimens by coagglutination Indian J Med Res 101: p 55-6 Albert, M J (1993) Personal reflections on the discovery of Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal: a tribute to team work and international collaboration J Diarrhoeal Dis Res 11:207-210 Alvarez, J., et al., 2004 Development of a multiplex PCR technique for detection and epidemiological typing of salmonella in human clinical samples J Clin Microbiol 42(4): p 1734-8 Bani, S., et al., (2007) Molecular characterization of ICEVchVie0 and its disappearance in Vibrio cholerae O1 strains isolated in 2003 in Vietnam FEMS Microbiol Lett 266(1): 42-88 Bauer A and L.M Rørvik, (2003) A novel multiplex PCR for the identification of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus, Letters in Applied Microbiology ISSN 0266-8254 Chuyên ngành Vi sinh vật học 56 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương 10 Beltran, P., Delgado, G., Navarro, A., Trujillo, F., Selander, R K & Cravioto, A (1999) Genetic diversity and population structure of Vibrio cholerae J Clin Microbiol 37, 581–590 11 Bhanumathi R, Sabeena F, Isac SR, Radhakutty G & Singh DV, (2002) Characterization of a toxigenic Vibrio cholerae O139 strain belonging to a new ribotype and isolated from a diarrheal patient J Clin Microbiol 40: 4779–4781 12 Bik EM, Bunschoten AE, Gouw RD & Mooi FR, (1995) Genesis of the novel epidemic Vibrio cholerae O139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide synthesis EMBO J 14: 209–216 13 Bik, E M., A E Bunschoten, R D Gouw, and F R Mooi, (1995) Genesis of the novel epidemic Vibrio cholerae O139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide synthesis EMBO J 14:209–216 14 Calia KE, Murtagh M, Ferraro MJ & Calderwood SB, (1994) Comparison of Vibrio cholerae O139 with V cholerae O1 classical and El Tor biotypes Infect Immun 62: 1504–1506 15 Chakraborty S, Garg P, Ramamurthy T et al (2001) Comparison of antibiogram, virulence genes, ribotypes and DNA fingerprints of Vibrio cholerae of matching serogroups isolated from hospitalised diarrhoea cases and from the environment during 1997–1998 in Calcutta, India J Med Microbiol 50: 879–888 16 Chakraborty S, Mukhopadhyay AK, Bhadra RK et al, (2000) Virulence genes in environmental strains of Vibrio cholerae Appl Environ Microbiol 66: 4022–4028 17 Chow, K H., Ng, T K., Yuen, K Y & Yam, W C (2001) Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholerae by PCR J Clin Microbiol 39, 2594–2597 18 Chow, K.H., et al., 2001 Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholerae by PCR J Clin Microbiol 39(7): p 2594-7 19 Comstock, L E., J A Johnson, J M Michalski, J G Morris, Jr., and J B Kaper, (1996) Cloning and sequencing of a region encoding a surface polysaccharide of Vibrio cholerae O139 and characterisation of the insertion site in the chromosome of Vibrio cholerae O1 Mol Microbiol 19:815–826 Chuyên ngành Vi sinh vật học 57 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương 20 DePaola, A (1981) Vibrio cholerae in marine foods and environmen-tal waters: a literature review J Food Sci, 66-70 21 Devarati Dutta, Goutam Chowdhury, Gururaja P Pazhani, Sucharita Guin, Sanjucta Dutta, et al (2013) Vibrio cholerae Non-O1, Non-O139 Serogroups and Cholera-like Diarrhea, Kolkata, India www.cdc.gov/eid, Vol 19, No 3, March 2013 22 Dong Tu Nguyen, Tuan Cuong Ngo, Huy Hoang Tran, Thanh Huong Le, Hoai Thu Nguyen, (2012), Characterization of Vibrio cholerae O139 of an Aquatic Isolate in Northern Vietnam Open Microbiol J, 6: 14-21 23 Dutta B, Ghosh R, Sharma NC, Pazhani GP, Taneja N, Raychowdhuri A, et al (2006) Spread of cholera with newer clones of Vibrio cholerae O1 El Tor, serotype Inaba, in India J Clin Microbiol; 44 : 3391-3 24 Faruque SM, Roy SK, Alim ARMA, Siddique AK, Albert MJ (1995) Molecular epidemiology of toxigenic Vibrio cholera in Bangladesh studied by numerical analysis of rRNA gene restriction patterns J Clin Microbiol; 33 : 2833-8 25 Faruque SM, Sack DA, Sack RB, Colwell RR, Takeda Y & Nair GB (2000).Emergence and evolution of Vibrio cholerae O139 Proc Natl Acad Sci USA 100: 1304–1309 26 Faruque, S M., Tam, V C., Chowdhury, N., Diraphat, P., Dziejman, M., Heidelberg, J F., Clemens, J D., Mekalanos, J J & Nair, G B (2007) Genomic analysis of the Mozambique strain of Vibrio cholera O1 reveals the origin of El Tor strains carrying classical CTX prophage Proc Natl Acad Sci USA 104, 5151– 5156 27 Fields, P.I., et al., 1992 Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae O1 strains from the Latin American cholera epidemic J Clin Microbiol 30(8): p 2118-21 28 Garg P, Nandy RK, Chaudhry P, Chaudhry NR, De K, Ramamurthy T, et al (2003) Emergence of V cholerae O1 biotype EI Tor serotype Inaba from prevailing O1 ogawa serotype strains in India J Clin Microbiol; 4249-53 Chuyên ngành Vi sinh vật học 58 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương 29 Goel, A K., Jain, M., Kumar, P., Sarguna, P., Bai, M., Ghosh, N & Gopalan, N (2011) Molecular characterization reveals involvement of altered El Tor biotype Vibrio cholerae O1 strains in cholera outbreak at Hyderabad, India J Microbiol 49, 280–284 30 Hemant Kumar Khuntia, Bibhuti Bhusan Pal and Guru Prasada Chhotray, (2008) Quadruplex PCR for Simultaneous Detection of Serotype, Biotype, Toxigenic Potential, and Central Regulating Factor of Vibrio cholera J Clin Microbiol vol 46 no 2399-2401 31 Hoshino, K., Yamasaki, S., Mukhopadhyay, A K., Chakraborty, S., Basu, A., Bhattacharya, S K., Nair, G B., Shimada, T & Takeda, Y (1998) Development and evaluation of a multiplex PCR assay for rapid detection of toxigenic Vibrio c cholerae O1 and O139 FEMS Immunol Med Microbiol 20, 201–207 32 Jacob John T, Mary V Jesudason (1972) The First Epidemic of Vibrio cholerae O139 J Clin Microbiol; Vol 33, No 7, 49-53 33 Jiang SC, Matte M, Matte G, Huq A & Colwell RR (2012) Genetic diversity of clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism fingerprinting Appl Environ Microbiol 66: 148– 153 34 Joao P.S Cabral (2010) International Journal of Environmental Research and Public Health, 1660-4601 35 Joao P.S Cabral (2010) Water Microbiology Bacterial Pathogens and Water Int J Environ Res Public Health 7: 3657-3703 36 Johnson, J A., C A Salles, P Panigrahi, M J Albert, R J Johnson, and J G Morris, Jr, (1994) Vibrio cholerae O139 synonym Bengal is closely related to Vibrio cholerae El Tor but has important differences Infect Immun 62: 2108– 2110 37 Karaolis, D K., R Lan, and P R Reeves, (1994) Molecular evolution of the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae and its relationship to other pandemic and epidemic V cholerae isolates J Bacteriol 176:6199–6206 Chuyên ngành Vi sinh vật học 59 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương 38 Knirel, Y A., L Paredes, P E Jansson, A Weintraub, G Widmalm, and M J Albert, (1995) Structure of the capsular polysaccharide of Vibrio cholera O139 synonym Bengal containing D-galactose 4,6-cyclophosphate Eur J Biochem 232:391–396 39 Kumar, P., Peter, W A & Thomas, S (2010b) Rapid detection of virulenceassociated genes in environmental strains of Vibrio cholera by multiplex PCR Curr Microbiol 60, 199–202 40 Kwang, J., E.T Littledike, and J.E Keen, 1996 Use of the polymerase chain reaction for Salmonella detection Lett Appl Microbiol 22(1): p 46-51 41 Lee JH, Han KH, Choi SYet al, (2006) Multilocus sequence typing (MLST) analysis of Vibrio cholerae O1 El Tor isolates from Mozambique that harbour the classical CTX prophage J Med Microbiol 55: 165–170 42 Lesmana M, Subekti DS, Tjaniadi P, Simanjuntak CH, Punjabi NH, Campbell JR, et al (2002) Spectrum of Vibrio species associated with acute diarrhea in North Jakarta, Indonesia Diagn Microbiol Infect Dis 43:91–7 43 Makino S, Kurazono T, Okuyama Y, Shimada T, Okada Y & Sasakawa C, (1995) Diversity of DNA sequences among Vibrio cholerae O139 Bengal detected by PCR-based DNA fingerprinting FEMS Microbiol Lett 126: 43–48 44 Mandomando, I., Espasa, M., Valle` s, X., Sacarlal, J., Sigau´ que, B., Ruiz, J & Alonso, P (2007) Antimicrobial resistance of Vibrio cholerae O1 serotype Ogawa isolated in Manhic¸a District Hospital, southern Mozambique J Antimicrob Chemother 60, 662–664 45 Mehrabadi JF, Morsali P, Nejad HR, Imani Fooladi AA, (2012) Detection of toxigenic Vibrio cholerae with new multiplex PCR J Infect Public Health 5(3):263-7 46 Morita, M., Ohnishi, M., Arakawa, E., Bhuiyan, N A., Nusrin, S., Alam, M., Siddique, A K., Qadri, F., Izumiya, H & other authors (2008) Development and validation of a mismatch amplification mutation PCR assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor Microbiol Immunol 52, 314–317 Chuyên ngành Vi sinh vật học 60 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương 47 Morita, M., Ohnishi, M., Arakawa, E., Yamamoto, S., Nair, G B., Matsushita, S., Yokoyama, K., Kai, A., Seto, K & other authors (2010) Emergence and genetic diversity of El Tor Vibrio cholerae O1 that possess classical biotype ctxB among travel-associated cases of cholera in Japan J Med Microbiol 59, 708–712 48 Morris JG Jr, (1994) Non-O1 Vibrio cholerae strains not associated with epidemic disease Vibrio Cholerae and Cholera: Molecular to Global Perspectives (Wachsmuth PAB & Olsvik Ø, eds), ASM Press, Washington, DC pp 103–115 49 Nair GB, Faruque SM, Bhuiyan NA, Kamruzzaman M, Siddique AK, Sack DA, (2002) New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh J Clin Microbiol 40(9):3296-9 50 Nair, G B., Qadri, F., Holmgren, J., Svennerholm, A M., Safa, A., Bhuiyan, N A., Ahmad, Q S., Faruque, S M., Faruque, A S G & other authors (2006) Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh J Clin Microbiol 44, 4211–4213 51 Nandi B, Nandy RK, Vicente AC & Ghose AC, (2000) Molecular characterization of a new variant of toxin-coregulated pilus protein (TcpA) in a toxigenic non-O1/Non-O139 strain of Vibrio cholerae Infect Immun 68: 948–952 52 Neelam Taneja, Garima Sangar, Goutam Chowdhury, (2012) Meenakshi Singh & Meera Sharma Molecular epidemiology of Vibrio cholerae causing outbreaks & sporadic cholera in northern IndiaIndian J Med Res 136, pp 656-663 53 Nguyen BM, Higa N, Kakinohana S, Iwanaga M (2002) Characterization of Vibrio cholerae O1 isolated in Vietnam Japanese Journal of Tropical Medicine and Hygiene: 103 – 107 54 Nguyen, B M., Lee, J H., Cuong, N T., Choi, S Y., Hien, N T., Anh, D D., Lee, H R., Ansaruzzaman, M., Endtz, H P & other authors (2009) Cholera outbreaks caused by an altered Vibrio cholerae O1 El Tor biotype strain producing classical cholera toxin B in Vietnam in 2007 to 2008 J Clin Microbiol 47, 1568–1571 55 Nicholas A.Daniels, MD, MPH, Alireza Shafaie, MD (2000) A Review of Pathogenic Vibrio Infections for Clinicians Infect Med 17(10):665-685 Chuyên ngành Vi sinh vật học 61 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương 56 Pachara Senachai, Chariya Chomvarin, Wises Namwat, Warawan Wongboot, Suwin Wongwajana and Waraluk Tangkanakul, (2013) Application of tetraplex PCR for detection of Vibrio cholerae, V parahaemolyticus, V vulnificus and V minicus in cockle, Southeast Asian J Trop Med Public Health, Vol 44 No 57 Popovic T, Bopp C, Olsvik O, Wachsmuth K (1993) Epidemiologic application of a standardized ribotype scheme for Vibrio cholerae 01 J Clin Microbiol; 31 : 2474-82 58 Rivera in, Chun J, Sack Rb and Colwell Rr, (2001) Genotypes associated with virulence in environmental isolates of Vibrio cholerae Appl Environ Microbiol 67 (6) 2421–2429 59 Safa A, Bhuiyan NA, Alam M, Sack DA & Nair GB, (2005) Genomic relatedness of the new Matlab variants of Vibrio cholerae O1 to the classical and El Tor biotypes as determined by pulsed-field gel electrophoresis J Clin Microbiol 43: 1401–1404 60 Sharma C, Nair GB, Mukhopadhyay AK, Bhattacharya SK, Ghosh RK, Ghosh A (1997) Molecular characterization of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor strains isolated between 1992 and 1995 in Calcutta, India: evidence for the emergence of a new clone of the El Tor biotype J Infect Dis; 175 : 1134-41 61 Stephanie AC, Robert JO, Louise T, Seth S (2001) PCR-Based Diagnosis of Helicobacter pylori Infection and Real-Time Determination of Clarithromycin Resistance Directly from Human Gastric Biopsy Samples Journal of clinical microbiology, p 1217–1220 62 Taneja N, Biswal M, Tarai B, Sharma M (2005) Emergence of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor serotype Inaba in North India Jap J Infect Dis 58 : 238-40 63 Tran, H D., Alam, M., Trung, N V., Kinh, N V., Nguyen, H H., Pham, V C., Ansaruzzaman, M., Rashed, S M., Bhuiyan, N A & other authors (2012) Multidrug resistant Vibrio cholerae O1 variant El Tor isolated in northern Vietnam between 2007 and 2010 J Med Microbiol 61, 431–437 Chuyên ngành Vi sinh vật học 62 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Trương Thị Lan Hương 64 Vijayalakshmi N, R S.rao and S.Badrinath (1997) Minimum inhibitory concentration (MIC) of some antibiotics against Vibrio cholerae O139 isolates from Pondicherry Epidemiology and Infection 119(1)25 Các website 65 http://swissmodel.expasy.org 66 http://www.aaes.auburn.edu/comm/pubs/highlightsonline/spring99/phytase.html 67 http://www.ebi.ac.uk 68 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 69 http://www.soyte.hanoi.gov.vn/ /Infectious%20diseases%20in%20Vietnam%2 Chuyên ngành Vi sinh vật học 63 Khóa 2011-2013 ... THỊ LAN HƯƠNG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN TẢ Ở NGƯỜI ĐẾN XÉT NGHIỆM TẠI BỆNH VI? ??N QUÂN Y 103 NĂM 2013 BẰNG KỸ THUẬT PCR Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG... tiến hành thực đề tài: "Chẩn đoán vi khuẩn tả người đến xét nghiệm bệnh vi? ??n Quân y 103 năm 2013 kỹ thuật PCR" Mục đích nghiên cứu Xác định tỷ lệ bệnh nhân dương tính với Vibrio cholerae (V cholerae)... năm 2013 đến tháng năm 2013 Thu thập mẫu nghiên cứu từ bệnh nhân mắc bệnh tiêu ch? ?y cấp nghi ngờ mắc tả khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh vi? ??n Quân y 103 Chẩn đoán xác định V cholerae thực kỹ thuật