Phát hiện vi khuẩn escherichia coli gây bệnh tiêu chảy ở người bằng kỹ thuật phân tử

Mẫu 04/ĐTCS ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ Tên đề tài: Phát vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy ngƣời kỹ thuật phân tử Mã số đề tài: TN.18.14 Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Thanh Hiền Mẫu 04/ĐTCS PHẦN I THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: - Tiếng Việt: Phát vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy người kỹ thuật phân tử - Tiếng Anh: Detection of Escherichia coli which cause diarrheal disease in human by molecular technology Mã số: TN.18.04 Danh sách cán thực đề tài: TT Học vị, họ tên TS Phạm Thanh Hiền TS Trần Thị Thanh Huyền Đơn vị chủ trì thực hiện: Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN Thời gian thực hiện: 5.1 Theo hợp đồng: Từ tháng năm 2018 đến tháng năm 2019 5.2 Gia hạn (nếu có): Gia hạn đến tháng 12 năm 2019 5.3 Thực thực tế: Từ tháng năm 2018 đến tháng 12 năm 2019 Tổng kinh phí đƣợc phê duyệt đề tài: 25 triệu đồng Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có) (Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết nghiên cứu tổ chức thực hiện; nguyên nhân; ý kiến Trường ĐHKHTN) Không có PHẦN II TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Viết theo cấu trúc báo khoa học tổng quan từ 6-15 trang, nội dung gồm phần: Đặt vấn đề Tiêu chảy bệnh gặp lứa tuổi, người lớn bệnh thường nguy hiểm đến tính mạng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, khả lao động sinh hoạt người bệnh Tiêu chảy nguy hiểm trẻ em tuổi, đặc biệt trẻ từ đến tuổi Theo thống kê Tổ chức Y tế giới, tỷ lệ mắc tiêu chảy trung bình trẻ em tuổi lần/ trẻ em/ năm Tuy nhiên, số nước phát triển số cao tới 12 lần/trẻ em/năm Tại Việt Nam, số nghiên cứu cho biết, số lần bị tiêu chảy năm trẻ 2,2 lần [2,19] Đây bệnh đứng thứ hai tỷ lệ tử vong trẻ tuổi sau nhiễm khuẩn đường hô hấp, 80% số ca tử vong trẻ từ - tuổi Nguyên nhân gây tử vong bị tiêu chảy nước điện giải, suy dinh dưỡng Suy dinh dưỡng tiêu chảy tạo thành vòng xoắn bệnh lý: tiêu chảy dẫn đến suy dinh dưỡng trẻ bị suy dinh dưỡng lại có nguy bị tiêu chảy cao [2] Tác nhân gây bệnh vi khuẩn E coli, có nhiều nhóm gây bệnh khác STEC (shiga toxin producing E coli), ETEC (enterotoxigenic E coli), EPEC (enteropathogenic E coli), EIEC (enteroinvasive E coli), EHEC (enterohemorrhagic E Mẫu 04/ĐTCS coli), EaggEC (enteroaggregative E coli) DAEC (diffusely adherent E coli) Vi khuẩn thường mang gen độc lực khác giúp chúng bám vào niêm mạc ruột, giải phóng yếu tố tan máu độc tố ruột Trong số gen độc lực gen eae (E coli attaching and effacing) xem gen phổ biến có mặt hầu hết nhóm EPEC, EHEC Có nhiều phương pháp khác để xác nhận có mặt gen eae PCR, real time PCR microarray… nhiên kết phương pháp thường bị phụ thuộc vào kỹ thuật, thao tác tiến hành sử dụng thiết bị đắt tiền Năm 2000, Notomi cộng phát triển kỹ thuật khuếch đại DNA sở nguyên lý khuếch đại PCR có độ đặc hiệu độ nhạy cao gấp nhiều lần so với PCR, trình khuếch đại DNA diễn điều kiện đẳng nhiệt nên không cần phải sử dụng máy móc đại Hiện nay, LAMP xem phương pháp phổ biến sử dụng chẩn đoán nhanh tác nhân virut, vi khuẩn nấm Với mong muốn tìm phương pháp chẩn đốn nhanh đảm bảo độ xác, tiến hành thiết bị đơn giản dễ dàng áp dụng rộng rãi tuyến y tế sở nhằm góp phần nâng cao hiệu phịng chống, kiểm soát điều trị vi khuẩn E coli gây tiêu chảy người lựa chọn kỹ thuật LAMP để phát gen độc tố eae gây tiêu chảy Gen eae mã hóa cho protein intimin có trọng lượng phân tử 94- 97 kDa yếu tố độc lực cần thiết EPEC cần thiết cho việc tạo tổn thương mô học niêm mạc ruột Gen eae diện tất chủng EPEC, EHEC khơng có dịng vi khuẩn E coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột thông thường [18] Đây xem thị phân tử để phát vi khuẩn E coli gây tiêu chảy người Mục tiêu phạm vi nghiên cứu Mục tiêu: Phát triển kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt gen eae đặc hiệu vi khuẩn E.coli Phạm vi nghiên cứu Nội dung 1: - Phân lập vi khuẩn E.coli gây bệnh từ mẫu phân trẻ bị tiêu chảy Thu thập chủng nghi ngờ nhiễm E.coli từ phòng xét nghiệm bệnh viện Thái Nguyên Nội dung 2: - Phát gen độc tố vi khuẩn E.coli kỹ thuật PCR kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt LAMP - Sử dụng phần mềm thiết kế mồi dựa trình tự gen eae công bố Genbank - Tách chiết ADN: sử dụng phương pháp thường quy kit thương mại - Sử dụng kỹ thuật PCR nhân gen eae đoạn mồi đặc hiệu - Sử dụng kỹ thuật LAMP nhân gen eae mồi đặc hiệu - Xác định độ đặc hiệu phương pháp LAMP So sánh giới hạn phát ADN phương pháp PCR LAMP Tổng quan tài liệu Escherichia coli (E coli) loại vi khuẩn sống đường ruột người động vật Có nhiều typ khác hầu hết số chúng không gây bệnh thành phần khu hệ vi sinh vật đường tiêu hóa Dựa vào tính chất gây bệnh E.coli chia thành EPEC (Enterophathogenic E.coli) - E.coli gây bệnh đường ruột [1]  EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli) - E.coli gây chảy máu đường ruột (gồm hai Mẫu 04/ĐTCS phân nhóm EHEC1 EHEC2)  STEC – (Shiga toxin producing E.coli) – E.coli sinh độc tố shiga  AEEC – (attaching and effacing E.coli) - E coli gây kết dính đường ruột Trong nhóm gây bệnh kể cần kể đến nhóm AEEC nhóm có khả sinh intimin gây tượng kết dính niêm mạc ruột [2,10] mã hóa gen eae lần phát nhóm EPEC EHEC [9] Có 27 dạng intimin khác xác định dựa vào trình tự đầu 3’ gen eae tạo nên đa dạng nhóm vi khuẩn đường ruột gây tiêu chảy Có nhiều công bố sử dụng kỹ thuật khác để phát gen eae ví dụ PCR [13, 2, 4], multiplex PCR [13] Real time PCR [6] hay Microarray [7] nhiên phương pháp không xác định tất chủng mang gen tổng hợp intimin cần sử dụng thiết bị đắt tiền kỹ thuật viên đào tạo Như vậy, phương pháp áp dụng phịng thí nghiệm khơng thể ứng dụng ngồi thực tế Do đó, việc phát triển kỹ thuật mới, xác định tất dạng intimin khác bước dùng thiết bị đơn giản có triển vọng ứng dụng chẩn đoán bệnh tiêu chảy E coli Một cơng cụ chẩn đốn phân tử gọi khuếch đại đẳng nhiệt có tạo thành loop (LAMP) chứng minh rằng: ADN khuếch đại điều kiện đẳng nhiệt mà khơng cần phải có chu trình nhiệt biến đổi PCR Khơng giống PCR, ADN đích sử dụng phương pháp khơng cần phải biến tính để tách chuỗi, lượng sản phẩm phản ứng sau khuếch đại với thời gian ngắn lại lớn phản ứng dương tính phát mắt thường thay phải điện di phương pháp PCR [11] Ưu điểm phương pháp đơn giản, cần bể ổn nhiệt thiết bị gia nhiệt có khả trì nhiệt độ ổn định tiến hành phản ứng Phương pháp LAMP sử dụng ADN polymerase mồi thiết kế đặc hiệu dựa trình tự khác biệt gen đích Mồi có trình tự tương tự bổ sung với trình tự mạch LAMP khởi đầu Cặp mồi ngồi có khả tách chuỗi phân tử ADN với hỗ trợ Bst Bsm polymerase có hoạt tính tách chuỗi cao tạo phân tử ADN mạch đơn Sợi đơn sau tạo thành cấu trúc dạng kẹp tóc tạo điều kiện khởi đầu cho phản ứng khuếch đại LAMP Đây phương pháp dùng phổ biến để chẩn đoán nhanh lĩnh vực sinh y học dựa khả tổng hợp lượng lớn ADN mà không cần máy biến nhiệt thực ADN polymerase đặc biệt hai cặp mồi đặc hiệu Bước trình khuếch đại, bốn mồi sử dụng để tổng hợp khuôn cho phản ứng LAMP từ gen đích, sau hai mồi sử dụng cho chu kỳ Tồn q trình khuếch đại đoạn ADN đích cần thời gian khoảng 40 đến 60 phút Sản phẩm cuối nhận đoạn ADN kép dạng gấp khúc có kích thước gấp nhiều lần kích thước đoạn gen sở Tồn dung dịch sau phản ứng quan sát mắt thường thay đổi thị mà không cần điện di gel agarose ADN polymerase thường sử dụng phản ứng LAMP Bst ADN polymerase Bsm ADN polymerase có hoạt tính tự tách chuỗi cao Do sử dụng 2-3 cặp mồi bắt cặp bổ sung với 6-8 đoạn trình tự gen đích nên phương pháp có độ đặc hiệu độ nhạy Mẫu 04/ĐTCS cao, thu kết tốt nồng độ ADN thấp [11] Oriel cs năm 2010 công bố sử dụng phương pháp LAMP phát gen rim p150 vi khuẩn Theileria parva giới hạn fg [12], Chen năm 2009 cơng bố phát gen rimM vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis giới hạn pg [3] Như thấy phương pháp LAMP có giới hạn phát thấp nhiều so với phương pháp PCR Real-time PCR nên có độ nhạy cao, cho kết xác so với phương pháp sinh học phân tử khác Tuy nhiên, mồi dùng cho phản ứng LAMP lại phức tạp mồi cho phản ứng PCR thông thường Phản ứng LAMP cần phải sử dụng hai cặp mồi, cặp có chiều dài khoảng 40 nucleotit thiết kế đặc biệt, cặp cịn lại có chiều dài khoảng 20 nucleotit [11] Thêm vào đó, tồn q trình từ lúc khuếch đại gen đích phát sản phẩm phản ứng diễn ống thí nghiệm điều kiện đẳng nhiệt Ưu điểm phương pháp hạn chế nhiễm ADN khu vực xung quanh, điều mà phương pháp PCR không đảm bảo phải tiến hành điện di sản phẩm PCR soi máy UV Như vậy, sử dụng phương pháp LAMP khơng cần đến thiết bị phịng thí nghiệm đại dễ dàng thao tác ngồi phịng thí nghiệm Kỹ thuật LAMP có ưu điểm mà kỹ thuật PCR khơng có như:  Khơng địi hỏi máy biến nhiệt đắt tiền PCR tất phản ứng diễn o nhiệt độ cố định, dao động từ 60- 65 C, tùy thuộc vào hàm lương GC mồi  Kết đọc mắt thường sau phản ứng kết thúc mà không cần điện di gel agarose  Thời gian thực phản ứng ngắn, vòng 60 phút với giới hạn phát cao kỹ thuật PCR  Sự khuếch đại đặc hiệu cao có đến 2-3 cặp mồi nhận biết 6-8 vùng riêng biệt ADN khuôn  Trong phương pháp LAMP lượng ADN tổng hợp lớn gấp nhiều lần so với PCR  Phương pháp LAMP thực khuếch đại RNA cách bổ sung thêm enzym phiên mã ngược vào hỗn hợp phản ứng Chính từ ưu điểm đó, chúng tơi phát triển kĩ thuật để phát vi khuẩn E.coli mang gen eae gây bệnh tiêu chảy người nhằm chẩn đốn nhanh xác tác nhân gây bệnh trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm mà không cần nhiều thời gian phương pháp thông thường khác Cách tiếp cận phƣơng pháp nghiên cứu Cách tiếp cận Hiện nay, có nhiều phương pháp khác để phát vi sinh vật gây bệnh, bao gồm phương pháp truyền thống phương pháp phân tử đại Tuy nhiên, chẩn đoán tiêu chảy vi khuẩn E coli phương pháp phân lập môi trường chọn lọc, thử tính chất sinh vật, hóa học giúp phát vi khuẩn E.coli phân biệt vi khuẩn E coli hội sinh cư trú bình thường đường ruột với vi khuẩn E coli mang gen độc lực gây bệnh Mẫu 04/ĐTCS Gen eae phát lần vi khuẩn E.coli thuộc nhóm EPEC chủng O127 Jerse cộng năm 1990 [9] sau vi khuẩn nhóm EHEC chủng EDL933 Yu Kaper năm 1992 Khơng giống trình tự đầu 5’, trình tự đầu 3’ có tính khơng đồng [5] Có 17 dạng intimin khác đơn vị [1, 2, 8] xác định phương pháp PCR RFLP Tuy nhiên sử dụng phương pháp PCR thông thường không phát hết subtype gen eae Phương pháp LAMP phát triển lần Notomi cộng năm 2000, Zablon 2012 ngồi tính đặc hiệu nhạy (có thể phát ADN đích nồng độ pg) cịn có khả phát tất biến thể eae phản ứng [11,14] Trong nghiên cứu này, thiết kế mồi khuếch đại gen eae vùng 5’ gen để phát gen eae 20 dạng gen eae mã hóa intimin khác cho kết nhanh xác so với phương pháp PCR real time PCR Nguyên liệu 25 mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy Khoa Vi sinh, Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên dùng cho nghiên cứu phân lập vi khuẩn E coli Các chủng vi khuẩn YTN1, YTN2, vi khuẩn E coli không gây bệnh, cung cấp Bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên - Hóa chất gồm: SYBR Green I, Betain, Calcein, pepton, cao thịt, agar, phenol, chloroform, iso-amylalcohol, glycerol, ethanol, MgSO 4, MnCl2, NaCl, HCl, NaCH3COO, axit acetic, lactose, sodium chloride, sodium citrate, sodium deoxycholate, Neutral red, nước cất, nước khử ion, Kit API - 20E Mồi nhân gen (5’-3’): Mồi nhân gen eae kỹ thuật PCR kí hiệu SK1/SK2 (Mồi xuôi CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC; Mồi ngược CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG) vi khuẩn E coli Mồi nhân gen eae kỹ thuật LAMP: F3 (CGACGATTTGGTCGTTGAA); B3 (TGTCATCGGTCATGTTGC); FIB (CAAAATGATCTGCTGACCAGGCTTTTTAAGCATTTATACAGTTCTGAAAGC) BIP (ACAGTGCACTACCACTTTTAGGTTTTTCATTTTAGTCAGTTTATTCGTGTGA) Phƣơng pháp nghiên cứu Phân lập vi khuẩn Các mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy thu thập người bệnh bị tiêu chảy cấp, bệnh phẩm lấy trước người bệnh dùng thuốc kháng sinh Dùng que tre vô trùng lấy khoảng 1-2 ml phân cho vào hộp đựng mẫu vô trùng Hộp đựng mẫu phải dán nhãn, ghi đầy đủ thông tin người bệnh, người lấy mẫu thời gian thu mẫu Sau đó, mẫu phân vận chuyển đến phòng xét nghiệm vi sinh để tiến hành bước nghiên cứu Các vi khuẩn phân lập từ mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy môi trường o chọn lọc DCL, ủ ấm 37 C, sau 18 - 24 giờ, quan sát hình thái khuẩn lạc Trên mơi trường DCL khuẩn lạc dạng S, có màu hồng, kích thước 1,5 - cm nghi ngờ vi khuẩn E coli tiếp tục cấy ria sang đĩa môi trường thạch máu để kiểm tra tính chất Những khuẩn lạc điển hình vi khuẩn E coli làm tiêu nhuộm Gram Nếu thấy trực khuẩn Gram (-) dự đốn vi khuẩn E coli tiến hành thực kiểm tra tính Mẫu 04/ĐTCS chất sinh vật hóa học Định danh vi khuẩn cách sử dụng Kit API 20E, hãng Biomerieux sản xuất Bộ kit API 20E kiểm tra nhanh 20 tiêu hóa sinh sau 18 24 Dựa vào biển đổi màu sắc chất, so sánh với phần mềm APIweb để định danh vi khuẩn Tách chiết DNA từ vi khuẩn o Vi khuẩn sau nuôi môi trường LB 28 C 18 giờ, thu sinh khối Chuyển 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendoft ly tâm 5000 vòng/phút phút thu tế bào Tế bào hòa tan 0,5 ml đệm TE (10 mM Tris-HCl, mM EDTA, pH 8), ly tâm thu tế bào [8] Bổ sung 0,5 ml TE, µl RNAse, µl lysozyme, trộn để nhiệt độ phịng 30 phút Thêm 30 µl SDS 10%, µl proteinase K trộn ủ 37oC 60 o phút Bổ sung 180 µl 5M NaCl, ủ 65 C 10 phút, ly tâm thu dịch Chiết DNA hai lần hỗn hợp Phenol: Choloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1), ly tâm thu pha o DNA genome tủa 70% cồn –20 C 30 phút Ly tâm thu tủa làm khơ, sau bổ sung 40 µl TE để hịa tan DNA genome Điện di kiểm tra sản phẩm DNA genome sau tách chiết gel 0,8% agarose Kỹ thuật PCR Để khuếch đại đoạn gen eae kỹ thuật PCR, chúng tơi thiết kế cặp mồi dựa trình tự đoạn gen eae genome vi khuẩn E.coli Thành phần phản ứng PCR (25 µl): 10x Taq polymerase buffer (Fermentas), 1,5 mM MgCl2, 2,5 mM dNTP, 100 µM mồi xi, 100 µM mồi ngược, 0,5 IU Taq polymerase, DNA, dH2O 25 µl Chu trình nhiệt: (1) Biến tính DNA nhiệt độ 94 C phút (2) Khuếch đại gen eae 30 chu kỳ, chu kỳ gồm bước Bước 1: Biến tính sợi khuôn DNA 94 C 30 giây Bước 2: Mồi bắt cặp bổ sung với đoạn gen tương 0 đồng sợi khuôn 45 C 40 giây Bước 3: Tổng hợp kéo dài chuỗi 72 C phút 50 giây.(3) Phản ứng kết thúc 72 C phút 30 giây để tạo sợi DNA hoàn chỉnh ủ mẫu 22 C Kỹ thuật LAMP LAMP phản ứng tự tổng hợp DNA vịng có mặt Bst DNA polymerase điều kiện đẳng nhiệt Phương pháp sử dụng cặp mồi khác sản phẩm khuếch đại đặc hiệu Phản ứng có tốc độ nhanh, diễn khoảng thời gian ngắn từ 30- 60 phút Thành phần đệm LAMP 1X gồm (200 mM Tris HCl pH 8,8, 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 1% Triton 100X, 25 mM MnCl 2) Thành phần phản ứng (25µl): 5M Betatin, 1X buffer LAMP, 25 mM dNTPs, 25 mM MgSO 4, µM B3 F3, 20 µM BIP FIP, U/µl Bst o polymearas, DNA dH2O đến thể tích cuối Chu trình nhiệt sau: 64 C 60 phút, o 80ºC 10 phút kết thúc 22 C Sản phẩm LAMP quan sát điện di gel agarose 2% mắt thường có bổ sung thị kim loại Calcein trước phản ứng Hỗn hợp Calcein Mn kết với Mn 2+ 2+ 2+ thêm vào trước phản ứng Do có mặt ion Mn , Calcein liên không phát quang, dung dịch có màu da cam Khi phản ứng khuếch đại DNA xảy 4- với có mặt DNA đích, sản phẩm phụ ion P 2O7 tạo thành kết hợp với ion Mg 2+ tạo thành muối Mg2P2O7, sau ion Mn 2+ 2+ Mn2P2O7 giải phóng ion Mg Mg 2+ đẩy Mg 2+ khỏi muối để tạo thành muối tự dung dịch kết hợp với Calcein tạo phức hợp Calcein-Mg phát quang [16] Mẫu 04/ĐTCS Mẫu 04/ĐTCS O N P G A D H E15 + - E16 + - E17 + - E18 + - E19 + - E20 + - E21 + - E22 + - E23 + - E24 + - E25 + - (+): phản ứng dương tính, (-): phản ứng âm tính 5.2 Tách DNA genome vi khuẩn DNA 25 mẫu vi khuẩn nghiên cứu tách chiết theo phương pháp mô tả phần phương pháp Kết tách chiết DNA genom kiểm tra điện di gel agarose 0,8% biểu diễn hình cho thấy băng DNA genom thu sáng, rõ, khơng bị đứt gãy hồn tồn Chất lượng DNA đủ tiêu chuẩn để làm khuôn nhân gen mong muốn PCR LAMP Hình Kết điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA M: Thang DNA chuẩn 1kb; E1, E2, E4 5.3 Phát gen eae chủng vi khuẩn E coli kỹ thuật PCR M- 89 M- 101112131415161718 M - 19 20 21 22 23 Hình Kết điện di sản phẩm PCR gen eae 25 chủng vi khuẩn E coli 11 Mẫu 04/ĐTCS M: thang DNA chuẩn, (-) mẫu đối chứng âm, 1-25 tương ứng với 25 mẫu vi khuẩn kí hiệu E1-E25 Sử dụng DNA 25 chủng vi khuẩn làm khuôn cặp mồi SK1/SK2, tiến hành chạy phản ứng PCR theo chu trình nhiệt mơ tả Sản phẩm sau phản ứng kiểm tra cách điện di gel agarose 0,8% Sản phẩm sau điện di (hình 4) cho kết 13 chủng E1, E2, E3, E6, E8, E10, E11, E13, E16, E18, E20, E23 E24 dương tính với gen eae, thể băng DNA sáng, kích thước khoảng 876 bp phù hợp với tính tốn lý thuyết Những chủng cịn lại có kết âm tính với gen eae, khơng thấy xuất băng DNA sản phẩm điện di Như phản ứng PCR, với DNA 25 chủng vi khuẩn E coli nghiên cứu cặp mồi SK1/SK2 phát 13 vi khuẩn E coli dương tính với gen eae, chiếm tỷ lệ 52% Kết tương đồng với nghiên cứu Svenungsson cộng (2000) nghiên cứu tiêu chảy vi khuẩn E coli người trưởng thành cho kết tỉ lệ phát gen eae 56% [14] Gomes cộng (1996), phát chủng EPEC tìm thấy 30% mẫu phân trẻ em bị tiêu chảy [4] Sehand (2010) với tỉ lệ phát gen aea 63,1% mẫu phân tiêu chảy [13] Kết tỉ lệ vi khuẩn E coli mang gen eae cao so với số tác giả cơng bố trước Năm 2003, Nguyễn Vũ Trung cộng dùng kỹ thuật Multiplex PCR phát tỷ lệ vi khuẩn E coli mang gen eae trẻ em tiêu chảy Hà Nội 3% [11] Cũng dùng phương pháp Multiplex PCR, Bii cộng (2005) phát gen eae vi khuẩn E coli gây tiêu chảy với tỷ lệ 7% [1] Hồng Bích ngọc (2017) phát gen eae E coli gây tiêu chảy Hà Nội 4,2 % [5] Konaté cộng (2017) 7,4% [6] Như vậy, thấy khác tỷ lệ mang gen eae vi khuẩn E coli nghiên cứu tác giả Việt Nam giới Sự khác đến từ nhiều nguyên nhân như: đối tượng nghiên cứu nhóm nghiên cứu thuộc vùng dịch tễ khác hay khác nhóm tuổi nghiên cứu Ngoài nghiên cứu chúng tôi, với số lượng 25 mẫu nên không đủ để đại diện cho tỷ lệ mang gen vi khuẩn E coli phân bệnh nhân tiêu chảy Việt Nam 5.4 Phát gen eae chủng E coli kỹ thuật LAMP Phản ứng LAMP thực với cặp mồi thiết kế trình tự gen eae Lựa chọn ngẫu nhiên mẫu dương tính với phản ứng PCR, mẫu âm tính với phản ứng PCR mẫu YTN1, YTN2 chủng vi khuẩn E coli không gây bệnh cung cấp Bộ môn Vi sinh vật - Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên làm đối chứng, với thành phần phản ứng chu kì nhiệt mô tả Sản phẩm phản ứng phân tích gel agarose 2% cho kết Hình 876 bp 228 bp 12 Mẫu 04/ĐTCS Hình Kết khuếch đại gen eae PCR (A) LAMP (B) M: thang DNA chuẩn, (-): đối chứng âm E1, E2, E10, E11, E20 E4: chủng vi khuẩn kiểm tra, YTN1, YTN2: chủng đối chứng không gây bệnh Trên hình 5A chủng E1, E2, E10, E11 E20 cho kết dương tính với phương pháp PCR (876 bp) LAMP (228 bp) hình 5B Trên băng điện di sản phẩm phản ứng LAMP xuất băng dạng bậc thang băng sở có kích thước 228 bp sản phẩm DNA khuếch đại với nhiều kích thước khác Ở giếng mẫu đối chứng âm không bổ sung DNA phản ứng không diễn ra, giếng cuối chủng E4, YTN1 YTN2 cho kết âm tính Hình ảnh băng điện di hồn tồn giống với mơ tả Notomi (2000) [12] Kết hoàn toàn trùng khớp với kết khuếch đại gen eae phản ứng PCR (Hình 1) Như chứng tỏ cặp mồi thiết kế để nhận biết gen eae phản ứng LAMP hoàn toàn đặc hiệu 5.4.1 Giới hạn phát gen eae phản ứng LAMP Kĩ thuật LAMP sử dụng enzym Bst Polymerase mồi thiết kế đặc biệt để nhận từ 2-6 trình tự cách xa gen đích eae, có tốc độ phản ứng độ nhạy cao Để xác định giới hạn phát phản ứng LAMP việc khuếch đại gen eae vi khuẩn E coli, DNA genom pha loãng theo số 10 với nồng độ -1 -2 -3 10 , 10 , 10 , 10 Nồng độ DNA genom ban đầu xác định thông qua đo máy nanodrop 15 ng/l Các thí nghiệm tiến hành với DNA khn ban đầu 15 ng/l sau giảm dần nồng độ theo cấp số 10 từ 15 ng/µl đến 15 fg/µl Tiến hành song song với phương pháp PCR để so sánh độ nhạy phương pháp nồng độ DNA Kết trình bày bảng Bảng Giới hạn phát PCR LAMP Phƣơng pháp PCR LAMP (+): dương tính, (-): âm tính Hình Giới hạn phát A: phản ứng PCR, B: phản ứng LAMP M(A): thang DNA chuẩn 1kb, M(B): thang DNA chuẩn 100bp, (-): đối chứng âm 1- 15 ng/µl, 2- 1,5 ng/µl, - 0,15 ng/µl, - 15 pg/µl, - 1,5 pg/µl, 6- 0,15 pg/µl, - 15 fg/µl 13 Mẫu 04/ĐTCS Kết bảng cho thấy: với nồng độ DNA khuôn tiến hành so sánh độ nhạy phản ứng LAMP PCR khuếch đại gen eae, giới hạn phát phương pháp LAMP cao nhiều so với phương pháp PCR Phương pháp PCR sử dụng -3 cặp mồi SK1/SK2 phát DNA mức độ pha loãng 10 tương ứng với nồng độ DNA 0,15 ng/µl (đường chạy số 3) vạch điện di tương đối mờ Trong đó, -5 sử dụng phương pháp LAMP phát độ pha loãng cao (10 ) tương ứng với 1,5 pg/µl (đường chạy số 5), cao gấp 100 lần so với phương pháp PCR (Hình 6) Như phương pháp LAMP với cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho gen eae, phát thành công gen eae nồng độ thấp 1,5 pg/µl Kết tương đồng với số nghiên cứu công bố tác giả khác sử dụng phương pháp LAMP để phát gen đích Kuboki (2003) nghiên cứu đơn bào trypanosome gây bệnh ngủ người gia súc sử dụng phương pháp LAMP phát thành công T brucei PFR A giới hạn nồng độ pg tổng DNA, giới hạn phát PCR 100 pg [8] Cũng dùng phương pháp LAMP để phát nấm Fusarium Nessie công bố phát gen đích gaoA - gen mã hóa galactose oxidase nồng độ pg [10] Verma (2017) phát Leishmania tropica nồng độ 1pg [17] Năm 2010, tác giả Trần Thị Thanh Huyền dùng phương pháp LAMP để phát thành công vi khuẩn E ictaluri gây bệnh Gan thận mủ cá Tra việt Nam, nồng độ 9,4 fg [15] Engku (2017) phát Vibrio cholerae nồng độ 10fg [3], thấp gần 100 lần so với nghiên cứu Từ nghiên cứu công bố tác giả khác sử dụng kỹ thuật LAMP để phát gen đích cho thấy, phương pháp có độ nhạy cao với giới hạn phát mức thấp, phương pháp cho độ nhạy cao gấp từ 10 – 100 lần so với phương pháp PCR thông thường phát gen đích Do vậy, phương pháp LAMP sử dụng để phát giai đoạn sớm bệnh, góp phần cơng tác phịng chống điều trị bệnh tích cực cho bệnh nhân 5.4.2 Phát gen eae phản ứng LAMP sử dụng thị Calcein: Trong trình tiến hành phản ứng LAMP, ống phản ứng bổ sung µl Calcein, sau chạy phản ứng LAMP theo chu trình trình bày chương Kết phản ứng quan sát ánh sáng thường (Hình 7) soi đèn UV (Hình 8) Hình Phát sản phẩm LAMP thị màu Calcein (-): mẫu đối chứng âm, nồng độ DNA giảm từ 15ng đến 15fg 14 Mẫu 04/ĐTCS (-) (+) Hình Phát sản phẩm LAMP thị Calcein ánh sáng UV (-): phản ứng âm tính - trái, (+): phản ứng dương tính- phải Khi thêm calcein vào ống phản ứng, ánh sáng thường mẫu dương tính dung dịch sau phản ứng phát quang chuyển sang màu xanh cây, mẫu âm tính dung dịch sau phản ứng khơng phát quang có màu vàng cam Dưới ánh sáng UV, mẫu dương tính dung dịch sau phản ứng có màu xanh sáng, mẫu âm tính khơng phát sáng có màu đen Kết thay đổi màu sắc thấy rõ nồng độ nồng độ DNA pha loãng giảm dần tử 15ng đến 1,5 pg Kết hoàn toàn trùng khớp với kết phát sản phẩm LAMP điện di gel agarose 2% (Hình 6) 5.4.3 Phát gen eae phản ứng LAMP sử dụng thị SYBR Green I SYBR Green I có khả bắt cặp với DNA sợi đơi, việc tồn DNA khuếch đại làm cho SYBR Green I chuyển từ màu vàng cam sang màu xanh Do nồng độ DNA sau khuếch đại phương pháp LAMP cao nhiều lần so với phương pháp khuếch đại thông thường khác PCR nên dấu hiệu chuyển màu rõ ràng Do đó, sản phẩm phản ứng LAMP nhận biết mắt thường nhờ thị SYBR Green I, ống phản ứng bổ sung thêm µl SYBR Green I sau phản ứng LAMP kết thúc Kết thay đổi màu sắc sản phẩm phản ứng biểu diễn hình Hình Phát sản phẩm LAMP thị màu SYBR I (-): mẫu đối chứng âm, nồng độ DNA giảm từ 15ng đến 15fg Các ống có nồng độ từ 15ng đến 1,5pg có kết dương tính, phát quang màu xanh, ống cịn lại khơng phát quang màu xanh cho kết âm tính Như vậy, giới hạn phát phản ứng LAMP SYBR Green I hoàn toàn giống với kết điện di gel agarose 2% hay sử dụng thị Calcein Tuy nhiên, SYBR Green I bổ sung sau phản ứng kết thúc nên với hàm lượng DNA lớn khuếch đại sau phản ứng nên việc lây nhiễm điều xảy với phịng thí nghiệm Do đó, để tránh việc lây nhiễm thuận lợi việc ứng dụng ngồi thực tế, có giá trị mặt kinh tế Calcein đáp ứng tiêu trí SYBR Green I Đánh giá kết nghiên cứu đạt đƣợc 15 Mẫu 04/ĐTCS Bằng kỹ thuật vi sinh phân lập 25 mẫu vi khuẩn E.coli nhiên số 25 mẫu có xác định có mặt gen độc tố eae có 13/25 chủng dương tính chiếm tỷ lệ 52% Khi sử dụng đồng thời kỹ thuật PCR LAMP sử dụng cặp mồi đặc hiệu thiết kế đoạn gen eae phát vi khuẩn vi khuẩn E coli Tuy nhiên kỹ thuật LAMP thể ưu việt Phương pháp PCR phát DNA đích nồng độ 0,15 ng/µl Trong phương pháp LAMP với cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho gen eae, phát thành công gen eae nồng độ thấp 1,5 pg/µl cho thấy phương pháp LAMP có giới hạn phát cao 100 lần so với phương pháp PCR ứng dụng phương pháp để xác định tác nhân gây bệnh vi khuẩn E coli cách nhanh chóng hiệu Thêm vào đó, kỹ thuật LAMP có tính ứng dụng cao khơng cần thiết bị phịng thí nghiệm phức tạp Phản ứng diễn nhiệt độ cố định thời gian nhanh sau 30 phút xác định phản ứng dương tính hay âm tính Để phát sản phẩm phản ứng cách đơn giản hạn chế lây nhiễm DNA có sử dụng loại thị màu Calcein phát mắt thường có mặt loại thị kim loại Calcein SYBR Green I cho thấy, Calcein thể ưu việt tạo hệ phản ứng kín, thị bổ sung từ đầu phản ứng giúp hạn chế tối đa việc mở ống phản ứng SYBR Green I bổ sung sau phản ứng dễ làm nhiễm DNA vùng thí nghiệm Cả loại thị màu giúp cho việc xác định phản ứng dương tính dễ dàng mắt thường mà không cần phải điện di agarose hay sử dụng thiết bị phụ trợ khác Kết luận Đã phân lập 25 chủng vi khuẩn E coli từ mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy Đã phát 13/25 mẫu vi khuẩn E coli gây tiêu chảy có mang gen eae kỹ thuật PCR Đã thiết kế thành công ứng dụng thành công phản ứng LAMP khuếch đại gen eae vi khuẩn E.coli hệ thống kín, phản ứng diễn điều kiện đẳng nhiệt o 60-65 C thời gian tối thiểu 30 phút Kỹ thuật LAMP có độ nhạy cao 100 lần so với kỹ thuật PCR Kết phản ứng xác định nhanh mắt thường có bổ sung thị Calcein SYBR Green I Tài liệu tham khảo Bii C.C, Taguchi H, Ouko T.T, Muita W, Wamae N, Kamiya S (2005), “Detection of virulencerelated genes by Multiplex PCR in multidrug-resistant diarrhoeagenic Escherichia coli isolates from Kenya and Japan”, Epidemiol Infect, 133(4), pp.627-633 Bộ Y tế (2009), Tài liệu hướng dẫn xử trí tiêu chảy trẻ em, Ban hành kèm theo định số 4121/QĐ-BYT ngày 28/10/2009, Hà Nội Engku N S., Nurul N A B, Foo PC, Mohd Ali MR, Mohamed M, Yean CY (2018), “An ambient temperature stable and ready-to-use loop-mediated isothermal amplification assay for detection of toxigenic Vibrio cholerae in outbreak settings”, Acta Trop;182:223-2313 16 Mẫu 04/ĐTCS Gomes T A T, Rassi V, Macdonald K L, Ramos S R T S, Trabulsi L R, Vieira M A M, Guth B E C, Candeias J A N, Ivey C, Toledo M R F, Blake P A (1991) “Enteropathogens associated with acute diarrheal disease in urban infants in Sao Paulo, Brazil” J Infect Dis., 164:331–337 Hồng Thị Bích Ngọc (2017), Xác định phân bố số đặc điểm sinh học phân tử nhóm Escherichia coli gây tiêu chảy trẻ em tuổi địa bàn Hà Nội, Luận án tiến sỹ Y học, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Hà Nội Konaté A, Dembélé H, Sanou A, Serme AS, Gassama-Sow Diarrheagenic Escherichia Coli in Children Less Than Years of Age with Diarrhea in Ouagadougou, Burkina Faso” Eur J Microbiol Immunol (Bp) 2017 Sep; 7(3): 220–228 Jams PN, Jams BK (1998), “Diarrheagenic Escherichia coli”, Cnilical Microbioly Review; 11(1), pp.142-210 Kuboki N., Inoue, N., Sakurai, T., Di Cello, F., Grab, D.J., Suzuki, and H S., C., Igarashi, I (2003), “Loop-mediated isothermal amplification for detection of African trypanosomes”, J Clin.Microbiology, 41, pp 5517-5524 Krystal DB, Hemant MC, Roxanna S, Kevin RU (2003), Detection of Edwardsiella infections in Opsanus tau by Polymerase Chain Reaction Biol Bull 205: 235-236 10 Niessen L and Zudi F.V (2010), “Detection of Fusarium graminearum DNA using a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay”, International Journal of Food Microbiology, 140, pp 183–191 11 Nguyễn Vũ Trung, Lê Huy Chính, Lê Văn Phủng, Andrej Weintraub (2003), “Phát triển ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi chẩn đoán E coli gây tiêu chảy từ phân” Tạp chí Nghiên cứu Y học tr 7-14 12 Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T (2000), “Loop-mediated isothermal amplification of DNA”, Axit nucleic Res 28 (12): e63 13 Sehand KA, Layla IFS (2010), “Identification of Different Categories of Diarrheagenic Escherichia coli in Stool Samples by Using Multiplex PCR Technique”, Asian Journal of Medical Sciences; 2(5), pp 237-243 14 Svenungsson B., Lagergren A., Ekwall E., Evengard B., Hedlund K.O., Karnell A., Lofdahl S., Svensson L., Weintraub A (2000), “Enteropathogens in adult patients with diarrhea and healthy control subjects: a 1-year pro-spective study in a Swedish clinic for infectious diseases”, Clin Infect Dis, 30, pp.770-778 15 Trần Thị Thanh Huyền (2010), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP (Loop mediated isothermal amplification) để xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra, Luận án Tiến sĩ Khoa học, Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Hà Nội 16 Tomita N., Mori Y., Kanda H., Notomi T (2008), “Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products”, Nat Protoc, (5), pp 877-882 17 Mẫu 04/ĐTCS Verma S, Singh R, Sharma V, Bumb RA, Negi NS, Ramesh V, Salotra P.(2017), “Development of a rapid loop-mediated isothermal amplification assay for diagnosis and assessment of cure of Leishmania infection”, BMC Infect Dis 2017 Mar 23;17(1):223 17 Xue-han Z, Qing Y, Ya-dong L, Bin L, Renata I, Kong-wang H (2013), “Development of a LAMP assay for rapid detection of different intimin variants of attaching and effacing microbial pathogens”, J Med Microbiol., 62(11), pp1665-72 19 http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/diarrhoeal-disease Tóm tắt kết (tiếng Việt tiếng Anh) 18 Hiện nay, có nhiều phương pháp khác để phát vi sinh vật gây bệnh, bao gồm phương pháp truyền thống phương pháp phân tử đại Tuy nhiên, chẩn đoán tiêu chảy vi khuẩn E coli phương pháp phân lập môi trường chọn lọc, thử tính chất sinh vật, hóa học giúp phát vi khuẩn E.coli phân biệt vi khuẩn E coli hội sinh cư trú bình thường đường ruột với vi khuẩn E coli mang gen độc lực gây bệnh Bài báo đề cập đến phương pháp LAMP (LoopMediated Isothermal Amplification) khuếch đại DNA với độ đặc hiệu độ nhạy cao ứng dụng để phát nhanh vi khuẩn E.coli giới hạn phát 15 fg, cao gấp 100 lần so với phương pháp PCR Các mồi thiết kế để khuếch đại đoạn gen eae gen độc lực vi khuẩn E coli có kích thước khoảng 288 bp DNA genome vi khuẩn với có mặt loại thị kim loại Calcein (C 30H26N2O13) thị kim loại dùng để phát có mặt Magie Trong trường họp này, Calcein ban đầu bị bất hoạt kết hợp với Mangan nên dung dịch có màu vàng cam Khi phản ứng LAMP khuếch đại gen eae diễn ra, lượng lớn DNA tổng hợp giải phóng sản phẩm phụ Magie pyrophotphat Khi đó, Magie đẩy Mangan khỏi nhân Calcein tạo phức hợp Calcein-Magie phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh Do đó, phản ứng dương tính dung dịch chuyển từ màu cam sang màu huỳnh quang quan sát mắt thường sau o phản ứng diễn 60 C sau 30 phút phản ứng ánh sáng UV Tín hiệu thị nhạy cho phép phân biệt trực quan kết mà không cần sử dụng thiết bị đắt tiền Phương pháp phát mở tiềm ứng dụng trong nghiên cứu y học dược phẩm, vệ sinh mơi trường, xét nghiệm điểm chăm sóc nhiều Nowaday, many techniques are use for detecting pathogenic agents, including traditional and model molecular techniques However, pathogenic E coli are not distinguishable from other common strains or from each other by the appearance on culture plates or by the results of the usual biochemical tests In this study, a new method called LAMP ((Loop- Mediated Isothermal Amplification) was applied to amplify DNA with high specificity and sensitivity at 15 fg, 100 times higher than PCR method Primes were designed to detect the eae gene, one of the toxic genes of E coli with the length of 288 bp Calcein (C 30H26N2O13) is a fluorescent metal indicator for Magesium detection In this case Calcein is initially quenched by manganese and it emits a yellowish-green fluorescence In eae LAMP reaction, a large amount of DNA is synthesized, yielding a large pyrophosphate 18 Mẫu 04/ĐTCS ion by-product LAMP-generated pyrophosphate preferentially precipitates manganese, resulting in a calcein–magnesium complex visible as bright green fluorescence So a positive reaction was observed by a colour change from orange to green through the naked eyes after completion at 63°C for at least 30 or under UV light detection As the signal recognition is highly sensitive, this system enables visual discrimination of results without costly specialized equipment This detection method should be helpful in basic research on medicine and pharmacy, environmental hygiene, point-of-care testing and more 19 Mẫu 04/ĐTCS PHẦN III SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI Các cơng trình khoa học cơng bố: TT Sản phẩm Bài báo tạp chí khoa học chuyên ngành quốc gia Trần Thị Thanh Huyền, Đinh Đức Thọ, Phạm Thanh Hiền, Trần Văn Tuấn, Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP (Loop amplification) phát nhanh vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy người Sản phẩm đào tạo: TT Họ tên Đinh Đức Thọ Các sản phẩm khác (phương pháp, quy trình cơng nghệ, phần mềm máy tính, vẽ thiết kế, sơ đồ, đồ, sở liệu, báo cáo phân tích, model, maket, vật liệu, thiết bị, máy móc,…): Khơng Tổng hợp sản phẩm đăng ký hoàn thành đề tài: STT Sản phẩm Bài báo / báo cáo khoa học Đào tạo / hỗ trợ đào tạo Phương pháp, quy trình cơng nghệ, phần mềm máy tính, vẽ thiết kế, sơ đồ, đồ, sở liệu, báo cáo phân tích, Sản phẩm cơng nghệ (model, maket, vật liệu, thiết bị, máy móc) Kết khác minh chứng áp dụng 20 Mẫu 04/ĐTCS PHẦN IV TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ STT Nội dung chi Xây dựng đề cương chi tiết Thu thập viết tổng quan tài liệu Điều tra, khảo sát, thí nghiệm, thu thập số liệu, nghiên cứu Thuê trang thiết bị, mua vật tư, hóa chất Hội thảo khoa học, viết báo cáo tổng kết, nghiệm thu Chi khác Tổng số: PHẦN V KIẾN NGHỊ Nghiên cứu thử nghiệm phương pháp LAMP phát gen độc tố eae vi khuẩn E coli số lượng mẫu lớn gen độc tố khác vi khuẩn E coli PHẦN VI PHỤ LỤC Minh chứng sản phẩm khoa học Minh chứng sản phẩm đào tạo Bản photocopy hợp đồng nghiên cứu khoa học, thuyết minh đề tài Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2018 ĐƠN VỊ CHỦ TRÌ THỰC HIỆN CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI TS Phạm Thế Hải TS Phạm Thanh Hiền TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 21 ... Đây xem thị phân tử để phát vi khuẩn E coli gây tiêu chảy người Mục tiêu phạm vi nghiên cứu Mục tiêu: Phát triển kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt gen eae đặc hiệu vi khuẩn E .coli Phạm vi nghiên cứu... I THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: - Tiếng Vi? ??t: Phát vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy người kỹ thuật phân tử - Tiếng Anh: Detection of Escherichia coli which cause diarrheal disease in... - Phân lập vi khuẩn E .coli gây bệnh từ mẫu phân trẻ bị tiêu chảy Thu thập chủng nghi ngờ nhiễm E .coli từ phòng xét nghiệm bệnh vi? ??n Thái Nguyên Nội dung 2: - Phát gen độc tố vi khuẩn E .coli kỹ