Luận văn thạc sĩ nghiên cứu các đặc tính quang của hạt nano vàng được chức năng hóa để ứng dụng trong phát hiện vi khuẩn gây bệnh bằng phép đo màu​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH QUANG CỦA HẠT NANO VÀNG ĐƢỢC CHỨC NĂNG HÓA ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG PHÁT HIỆN VI KHUẨN GÂY BỆNH BẰNG PHÉP ĐO MÀU Chuyên ngành: Quang học Mã số: 8.44.01.10 Học viên: Vũ Thị Lanh Hƣớng dẫn khoa học: TS Trần Quang Huy THÁI NGUYÊN - 2019 LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu Khoa Vật lý Công nghệ Trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, nhận đƣợc quan tâm giúp đỡ tận tình thầy anh chị Khoa nhƣ Trƣờng Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn với giúp đỡ Đặc biệt, tơi xin chân thành cám ơn TS Trần Quang Huy, ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn thực luận văn Tôi xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu, thầy cô môn Trƣờng Trung học phổ thông Quế Võ số 3, Bắc Ninh tạo điều kiện cho theo học chƣơng trình Tơi xin chân thành cám ơn thầy cô Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng, Viện Nghiên cứu Nano – Trƣờng Đại học Phenikaa tạo điều kiện máy móc, trang thiết bị phịng thí nghiệm để tơi hồn thành luận văn Cuối tơi xin cám ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp ln ủng hộ tơi suốt q trình học tập Thái Nguyên nhƣ làm thí nghiệm Thái Nguyên, ngày tháng 11 năm 2019 Học viên Vũ Thị Lanh I II LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi dƣới giúp đỡ mặt chuyên môn hƣớng dẫn khoa học TS Trần Quang Huy Đề tài nghiên cứu đƣợc hỗ trợ dự án Nghị định thƣ mã số: NĐT.05.ITA/15 Kết khóa luận trung thực không chép từ tài liệu Những nội dung khóa luận có tham khảo sử dụng tài liệu cơng bố nhóm nghiên cứu tạp chí trang web uy tín đƣợc trích dẫn liệt kê danh mục tài liệu tham khảo luận văn Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn Vũ Thị Lanh Xác nhận Xác nhận Trƣởng Khoa chuyên môn cán hƣớng dẫn khoa học TS Trần Quang Huy II MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN………………………………………………………………… I LỜI CAM ĐOAN …………………………………………………………….II MỤC LỤC…………………………………………………………………….III DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT …………………………IV DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ………………………………… VI DANH MỤC BẢNG BIỂU ……………………………………………… VIII MỞ ĐẦU CHƢƠNG CƠ SỞ LÝ THUYẾT 1.1 Tổng quan nano vàng 1.1.1 Tính chất nano vàng 1.1.2 Chế tạo nano vàng 1.2 Chức hóa hạt nano vàng 1.3 Ứng dụng nano vàng y sinh 13 CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 16 2.1 Vật liệu, hóa chất trang thiết bị 16 2.1.1 Vật liệu, sinh phẩm 16 2.1.2 Thiết bị phân tích 16 2.2 Chế tạo nano vàng phƣơng pháp điện hóa 16 2.3 Chức hóa hạt nano vàng với kháng thể 17 2.4 Tạo que thử để phát vi khuẩn tụ cầu vàng phép đo màu 19 2.5.1 Nồng độ nano vàng 21 2.5.2 Nồng độ kháng thể 21 2.5.3 Độ pH 22 2.5.4 Thời gian tạo phức hợp 22 2.5.5 Nhiệt độ tạo phức hợp 22 2.6 Thử nghiệm khả phát vi khuẩn tụ cầu vàng .22 2.7 Khảo sát đặc trƣng nano vàng trƣớc sau chức hóa 23 III 2.7.1 Phƣơng pháp đo phổ hấp thụ UV-vis .23 2.7.2 Hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 24 2.7.3 Hển vi điện tử quét ( SEM ) 25 2.7.4 Phân tích thành phần (EDX) 26 2.8 Kết luận 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Nano vàng chế tạo phƣơng pháp điện hóa .28 3.2 Phức hợp nano vàng – kháng thể đặc tính quang 32 3.2.1 Nồng độ kháng thể gắn với nano vàng đặc tính quang 32 3.2.2 Xác định độ pH dung dịch nano vàng để tạo phức hợp 35 3.2.3.Xác định thời gian tạo phức hợp nano vàng – kháng thể 36 3.2.4.Nhiệt độ tạo phức hợp 37 3.3 Tạo que thử sở phức hợp nano vàng -kháng thể để phát vi khuẩn tụ cầu vàng .37 3.4 Khả phát vi khuẩn tụ cầu vàng sử dụng phức hợp nano vàng – kháng thể tích hợp que thử nhanh 39 3.5 Kết luận 41 KẾT LUẬN CHUNG .42 KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ .49 IV DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT TT 10 PSMAKháng nguyên màng tế bào tuyến tiền liệt 11 S aureusTụ cầu (Staphyloccocus aureus) 12 SEM Hiển vi điện tử quét 13 ssDNADNA sợi đơn (Single strain DNA) 14 15 16 V DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc lập phương tâm mặt tinh thể Au Hình 1.2 Tương tác sóng điện từ với hạt nano vàng tạo tượng cộng hưởng bề mặt (a) đỉnh phổ hấp thụ theo kích thước hạt nano vàng (b) Hình 1.3 Sự thay đổi màu sắc dung dịch nano vàng theo kích thước Hình Ứng dụng nano vàng y sinh Hình 2.1 Mơ hình chế tạo dung dịch nano vàng 13 17 Hình 2.2 Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng Hình 2.3 Máy phun vạch kháng thể lên màng nitrocellulose Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 18 20 Hình 2.4 Nguyên lý tạo que thử sắc ký miễn dịch 21 Hình 2.5 Máy quang phổ UV-vis (Dynamica, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương) Hình 2.6 Học viên làm việc kính hiển vi điện tử truyền qua (JEM 1010, JEOL) 23 25 Hình 2.7 Học viên làm việc kính hiển vi điện tử quét (S-4800, Hitachi) 26 Hình 2.8 Thiết bị phân tích EDX (EMAX-Horiba) gắn SEM Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương 27 Hình 3.1 Nano vàng chế tạo từ vàng phương pháp điện hóa 28 Hình 3.2 Phổ UV-vis (a) ảnh TEM hạt nano vàng (b) chế tạo phương pháp điện hóa 29 Hình 3.3 Ảnh SEM nano vàng chế tạo phương pháp điện hóa 30 VI Hình 3.4 Phổ EDX nano vàng chế tạo phương pháp điện hóa Ảnh góc phải hình ảnh SEM vùng phân tích thành phần Hình 3.5 Phức hợp nano vàng-kháng thể (a) tạo cộng hợp (b) 31 Hình 3.6 Phổ UV-vis nano vàng (a), phức hợp nano vàng – kháng thể tương ứng với nồng độ 0,5 µg/mL(b); µg/mL (c) 1,5 µg/mL (d) 32 Hình 3.7 Sự hình thành vạch màu phụ thuộc nồng độ kháng thể gắn với nano 33 vàng Hình 3.8 Sự hình thành vạch màu phụ thuộc độ pH dung dịch nano vàng Hình 3.9 Sự hình thành vạch màu phụ thuộc thời gian ủ nano vàng – kháng thể Hình 3.10 Sự hình thành vạch màu phụ thuộc nhiệt độ ủ nano vàng – 34 35 36 kháng thể Hình 3.11 Quá trình tạo que thử nhanh để phát tụ cầu vàng Chuẩn bị 37 cộng hợp nano vàng – kháng thể (a); gắn cộng hợp lên que thử có gắn màng nitrocellulose (b); gắn miếng thấm giữ hút mẫu (c); đóng gói thành 38 que thử hồn chỉnh (d) Hình 3.12 Ảnh SEM vi khuẩn tụ cầu vàng (a) vi khuẩn E.coli O157 (b) Hình 3.13 Vạch màu xác nhận khả phát vi khuẩn tụ cầu vàng (S aureus) (cột trái) E coli O157 (cột phải) sử dụng que thử nhanh tích hợp 39 40 phức hợp nano vàng – kháng thể VII DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Một số phƣơng pháp chức hóa ứng dụng nano vàng VIII màng nitrocellulose (b); gắn miếng thấm giữ hút mẫu (c); đóng gói thành que thử hồn chỉnh (d) 3.4 Khả phát vi khuẩn tụ cầu vàng sử dụng phức hợp nano vàng – kháng thể tích hợp que thử nhanh Trong nghiên cứu này, sau chứng minh thành công khả tạo phức hợp nano vàng – kháng thể trì tốt hoạt tính sinh học chúng sau q trình chế tạo, nhóm tiến hành bƣớc để tạo que thử nhanh để phát vi khuẩn tụ cầu (S aureus) nồng độ xác định Mẫu đối chứng đƣợc thử nghiệm với vi khuẩn E coli O157 nồng độ điều kiện thí nghiệm Trƣớc tiên, mẫu đƣợc ly tâm để quan sát mặt hình thái dƣới kính hiển vi điện tử quét Hình 3.12 ảnh SEM vi khuẩn tụ cầu (Hình 3.12a) E coli (Hình 3.12b) mẫu trƣớc kiểm tra que thử mà nhóm nghiên cứu chế tạo đƣợc Bằng mắt thƣờng dễ dàng thấy vi khuẩn tụ cầu hình cầu, kết tụ lại giống nhƣ chum nho đặc trƣng cho vi khuẩn Gram dƣơng Trong E coli vi khuẩn Gram âm có dạng dài thn, lớp vỏ mỏng nên dễ bị xẹp chiếu chùm tia điện tử kính hiển vi điện tử quét lên bề mặt Hình 3.12 Ảnh SEM vi khuẩn tụ cầu vàng (a) vi khuẩn E.coli O157 (b) Sau xác nhận chắn có mặt vi khuẩn mẫu phân tích, mẫu đƣợc pha lỗng tới nồng độ 103 CFU/ml để thử nghiệm Hình 3.13 cho thấy kết 39 phát vi khuẩn tụ cầu (cột trái) với 5/5 mẫu hai vạch màu xuất que thử Trong đó, thử nghiệm với vi khuẩn E coli O157, que xuất vạch vị trí đối chứng Kết cho thấy phức hợp nano vàng – kháng thể có độ nhạy độ đặc hiệu cao Hình ảnh vạch màu rõ nét dễ dàng quan sát mắt thƣờng Nhƣ vậy, mơ hình cho thấy hồn tồn tạo phức hợp nano vàng với loại kháng thể khác để hƣớng tới ứng dụng chẩn đoán tác nhân gây bệnh khác phƣơng pháp đo màu Hình 3.13 Vạch màu xác nhận khả phát vi khuẩn tụ cầu vàng (S aureus) (cột trái) E coli O157 (cột phải) sử dụng que thử nhanh tích hợp phức hợp nano vàng – kháng thể 40 3.5 Kết luận Chƣơng trình bày kết nghiên cứu thảo luận việc chế tạo hạt nano vàng phƣơng pháp điện hóa, đồng thời khảo sát đặc tính quang chúng trƣớc sau chức hóa với kháng thể ứng dụng phát tác nhân gây bệnh Các phép khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến phức hợp nano vàng – kháng thể đƣợc thực nhƣ nồng độ kháng thể, độ pH, thời gian nhiệt độ để hình thành phức hợp nano vàng - kháng thể Những kết nghiên cứu ban đầu cho thấy phức hợp nano vàng – kháng thể có hiệu tốt thử nghiệm que thử để phát vi khuẩn tụ cầu vàng nồng độ 103 cfu/ml Vạch màu phức hợp tạo rõ nét tập trung, kể trƣờng hợp âm tính thử với E coli O157 41 KẾT LUẬN CHUNG Luận văn đạt đƣợc mục tiêu đề với kết sau: Đã điều chế thành công nano vàng phƣơng điện hóa, phép phân tích đặc trƣng lý hóa cho thấy hạt nano vàng chế tạo đƣợc có độ cao, hạt hình cầu, đồng với kích thƣớc 15-18 nm, thích hợp cho ứng dụng y sinh Đã chức hóa thành cơng hạt nano vàng với kháng thể kháng vi khuẩn tụ cầu vàng khảo sát đặc tính quang chúng chức với số nồng độ kháng thể định Kết cho thấy, nồng độ kháng thể µg/mL thích hợp với việc chức với nano vàng với nồng độ 200 µg/mL Đã khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến hình thành phức hợp nano vàng – kháng thể với giá trị pH dung dịch nano vàng 7.5; thời gian ủ 30 phút nhiệt độ phòng; Đã thử nghiệm chế tạo thành cơng que thử đóng gói để phát vi khuẩn tụ cầu vàng Kết cho thấy, que thử có khả cho kết dƣơng tính với vạch màu rõ nét nồng độ vi khuẩn tụ cầu vàng 103cfu/mL, có vạch màu rõ nét mẫu đối chứng vi khuẩn E coli O157 42 KIẾN NGHỊ - Thiết kế chế tạo que thử nhanh để phát vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện sở phức hợp nano vàng – kháng thể kỹ thuật sắc ký miễn dịch (xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện); - Ứng dụng phức hợp nano vàng – kháng thể làm mơ hình để phát triển kít chẩn đốn hay điều trị mầm bệnh sở hiệu ứng quang nhiệt 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Elahi N., Kamali M., and Baghersad M.H (2018) Recent biomedical applications of gold nanoparticles: A review Talanta, 184, 537–556 Ogarev V.A., Rudoi V.M., and Dement’eva O V (2018) Gold Nanoparticles: Synthesis, Optical Properties, and Application Inorg Mater Appl Res, 9(1), 134–140 Tiwari P., Vig K., Dennis V., et al (2011) Functionalized Gold Nanoparticles and Their Biomedical Applications Nanomaterials, 1(1), 31–63 Huy T.Q., Huyền P.T.M., Thủy N.T., et al (2016) Sự phát triển kỹ thuật sắc ký miễn dịch phát vi khuẩn gây bệnh Tạp chí Y học dự phòng, 26(15), 9–20 Long H (2018), Chế tạo nghiên cứu tính chất quang nano vàng, định hướng ứng dụng y sinh Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên Gold Gold Gold properties Gold crystal structure Gold colloids 10 Yeh Y.-C., Nanoparticles: Creran Preparation, B., and Rotello V.M Properties, and Bionanotechnology Nanoscale, 4(6), 1871–1880 (2012) Applications Gold in 11 Aldrich S Gold Nanoparticles: Properties and Applications 12 Shukla R., Bansal V., Chaudhary M., et al (2005) Biocompatibility of gold nanoparticles and their endocytotic fate inside the cellular compartment: A microscopic overview Langmuir, 21(23), 10644–10654 13 Mafuné F., Kohno J.Y., Takeda Y., et al (2002) Full physical preparation of size-selected gold nanoparticles in solution: Laser ablation and laser-induced size control J Phys Chem B, 106(31), 7575–7577 14 Ma H., Yin B., Wang S., et al (2004) Synthesis of Silver and Gold Nanoparticles by a Novel Electrochemical Method ChemPhysChem, 5(1), 68–75 15 Huang C.J., Chiu P.H., Wang Y.H., et al (2006) Electrochemically controlling the size of gold nanoparticles J Electrochem Soc, 153(12), 193–198 16 Fu W., Shenoy D., Li J., et al (2005) Biomedical applications of gold nanoparticles functionalized using hetero-bifunctional poly(ethylene glycol) spacer Mater Res Soc Symp Proc, 845, 223–228 17 Zhang G., Yang Z., Lu W., et al (2009) Influence of anchoring ligands and particle size on the colloidal stability and in vivo biodistribution of polyethylene glycol-coated gold nanoparticles in tumorxenografted mice Biomaterials, 30(10), 1928–1936 18 Lee S.H., Bae K.H., Kim S.H., et al (2008) Amine-functionalized gold nanoparticles as non-cytotoxic and efficient intracellular siRNA delivery carriers Int J Pharm, 364(1), 94–101 19 Rayavarapu R.G., Petersen W., Ungureanu C., et al (2007) Synthesis and bioconjugation of gold nanoparticles as potential molecular probes for light-based imaging techniques Int J Biomed Imaging, 2007, 29817 45 20 Chanda N., Kattumuri V., Shukla R., et al (2010) Bombesin functionalized gold nanoparticles show in vitro and in vivo cancer receptor specificity Proc Natl Acad Sci U S A, 107(19), 8760–8765 21 Sisco P.N., Wilson C.G., Mironova E., et al (2008) The Effect of Gold Nanorods on Cell-Mediated Collagen Remodeling Nano Lett, 8(10), 3409–3412 22 Haidekker M.A., Boettcher L.W., Suter J.D., et al (2006) Influence of gold nanoparticles on collagen fibril morphology quantified using transmission electron microscopy and image analysis BMC Med Imaging, 6, 1–7 23 Pellegrino T., Sperling R.A., Alivisatos A.P., et al (2007) Gel electrophoresis of gold-DNA nanoconjugates J Biomed Biotechnol, 2007, 26796 24 Chen C., Wang W., Ge J., et al (2009) Kinetics and thermodynamics of DNA hybridization on gold nanoparticles Nucleic Acids Res, 37(11), 3756–3765 25 Javier D.J., Nitin N., Levy M., et al (2008) Aptamer-targeted gold nanoparticles as molecular-specific contrast agents for reflectance imaging Bioconjug Chem, 19(6), 1309–1312 26 Dykman L.A and Khlebtsov N.G (2011) Gold nanoparticles in biology and medicine: recent advances and prospects Acta Naturae, 3(2), 34–55 27 Cordeiro M., Carlos F.F., Pedrosa P., et al (2016) Gold nanoparticles for diagnostics: Advances towards points of care Diagnostics, 6(4), 43 28 Verma M.S., Rogowski J.L., Jones L., et al (2015) Colorimetric biosensing of pathogens using gold nanoparticles Biotechnol Adv, 33(6), 666–680 46 29 Thị Thanh Huyền Đ (2018), Nghiên cứu tạo xét nghiệm sắc ký miễn dịch sử dụng hạt nano vàng để phát nhanh vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội 30 Nehl C.L and Hafner J.H (2008) Shape-dependent plasmon resonances of gold nanoparticles J Mater Chem, 18(21), 2415–2419 31 Meneghetti V and Moreno A (2009) Size Evaluation of Gold Nanoparticles by UV−vis Spectroscopy J Phys Chem C, 113(11), 4277– 4285 32 Chen P.Z and Gu F.X (2019), Gold Nanoparticles for Colorimetric Detection of Pathogens, Encyclopedia of Biomedical Engineering (Elsevier Inc) 33 Wu Y., Ali M.R.K., Chen K., et al (2019) Gold nanoparticles in biological optical imaging Nano Today, 24, 120–140 34 Huy T.Q., Hien Thanh N.T., Thuy N.T., et al (2017) Cytotoxicity and antiviral activity of electrochemical – synthesized silver nanoparticles against poliovirus J Virol Methods, 241, 52–57 35 Thuc D.T., Huy T.Q., Hoang L.H., et al (2017) Antibacterial Activity of Electrochemically Synthesized Colloidal Silver Nanoparticles Against Hospital-Acquired Infections J Electron Mater, 46(6) 36 Thuc D.T., Huy T.Q., Hoang L.H., et al (2016) Green synthesis of colloidal silver nanoparticles through electrochemical method and their antibacterial activity Mater Lett, 181, 173–177 37 Yao H and Kimura K (2007) Field Emission Scanning Electron Microscopy for Structural Characterization of 3D Gold Nanoparticle Superlattices Mod Res Educ Top Microsc, 568–575 38 for Lin P.C., Lin S., Wang P.C., et al (2014) Techniques 47 physicochemical characterization of nanomaterials Biotechnol Adv, 32(4), 711–726 39 Murawska M., Wiatr M., Nowakowski P., et al (2013) The structure and morphology of gold nanoparticles produced in cationic gemini surfactant systems Radiat Phys Chem, 93, 160–167 40 Park J., Joo J., Soon G.K., et al (2007) Synthesis of monodisperse spherical nanocrystals Angew Chemie - Int Ed, 46(25), 4630–4660 41 Kumar A., De A., Saxena A., et al (2014) Environmentally benign synthesis of positively charged, ultra-low sized colloidal gold in universal solvent Adv Nat Sci Nanosci Nanotechnol, 5(2), 025017 42 Compostella F., Pitirollo O., Silvestri A., et al (2017) Glyco-gold nanoparticles: Synthesis and applications Beilstein J Org Chem, 13, 1008–1021 43 Zhao W., Brook M.A., and Li Y (2008) Design of gold nanoparticle-based colorimetric biosensing assays ChemBioChem, 9(15), 2363–2371 44 Peng H and Chen I.A (2019) Rapid Colorimetric Detection of Bacterial Species through the Capture of Gold Nanoparticles by Chimeric Phages ACS Nano, 13(2), 1244–1252 45 Masereel B., Dinguizli M., Bouzin C., et al (2011) Antibody immobilization on gold nanoparticles coated layer-by-layer with polyelectrolytes J Nanoparticle Res, 13(4), 1573–1580 48 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ Vũ Quang Kh, Hồng Long, Vũ Thị Lanh, Nguyễn Thị Luyến, Phạm Thế Tân, Trần Quang Huy Ảnh hƣởng điện áp đến hình thành hạt đặc tính quang nano vàng điều chế phƣơng pháp điện hóa Tạp chí Khoa học công nghệ - ĐH Thái Nguyên, 2018; 190(14): 25-30 ISSN: 1859 - 2171 49 ... đề "Nghiên cứu đặc tính quang hạt nano vàng chức hóa để ứng dụng phát vi khuẩn gây bệnh phép đo màu" làm đề tài luận văn Mục tiêu nghiên cứu bao gồm - Chế tạo nano vàng phƣơng pháp điện hóa phân... tích đặc trƣng quang hạt nano vàng trƣớc sau chức hóa với kháng thể điều kiện khác - Thử nghiệm khả phát vi khuẩn gây bệnh phép đo màu sử dụng hạt nano vàng chức hóa Phƣơng pháp nghiên cứu -... đƣợc Các bảng, biểu đồ, hình đặc tính quang học nano vàng trƣớc sau chức hóa với kháng thể Những số liệu thực nghiệm khả phát vi khuẩn gây bệnh phép đo màu sử dụng hạt nano vàng chế tạo chức hóa