(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua

(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NCS Nguyễn Thu Thuỷ NGHIÊN CỨU VAI TRỊ ĐIỀU HỒ CỦA GEN MÃ HOÁ PROTEIN A20 VÀ CƠ CHẾ PHÂN TỬ THAM GIA KIỂM SỐT Q TRÌNH SINH LÝ TẾ BÀO TUA LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NCS Nguyễn Thu Thuỷ NGHIÊN CỨU VAI TRÒ ĐIỀU HỒ CỦA GEN MÃ HỐ PROTEIN A20 VÀ CƠ CHẾ PHÂN TỬ THAM GIA KIỂM SỐT Q TRÌNH SINH LÝ TẾ BÀO TUA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Thị Xuân - Viện nghiên cứu hệ gen TS Hoàng Văn Tổng - Học viện quân y Hà Nội – Năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án cơng trình nghiên cứu tơi chủ yếu Nghiên cứu thực khuôn khổ đề tài Nafosted mã số 108.06-2017.16, “Nghiên cứu vai trị điều hịa gen mã hóa cho protein A20 với bệnh bạch cầu cấp tính chế phân tử tham gia kiểm sốt q trình sinh lý tế bào”, thời gian thực 2017-2019 TS Nguyễn Thị Xuân làm chủ nhiệm đề tài Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành nước quốc tế với đồng ý cho phép đồng tác giả Những kết lại luận án chưa tác giả công bố công trình khác Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2020 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thu Thuỷ LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Xuân, Phòng Hệ gen học miễn dịch, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam người hướng dẫn, bảo tận tình suốt trình tơi thực luận án Đó tảng, hành trang giúp tự tin vững bước đường khoa học sau Tôi xin chân thành cảm ơn TS Hồng Văn Tổng, Phịng An tồn sinh học, Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y, thầy không truyền thụ cho nhiều kiến thức chun mơn mà cịn giúp tơi bồi đắp lịng say mê, nghiêm túc, tính cẩn thận nghiên cứu khoa học Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS TS Nguyễn Huy Hoàng, Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen thầy cô, anh chị Viện ln hướng dẫn tận tình cho tơi môn học phương pháp thực nghiệm trình bày kết Tơi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Thanh Ngân, động viên dành cho nhiều lời khuyên quý báu trong suốt thời gian qua Nhân đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn Phòng Hệ gen học miễn dịch bên cạnh giúp đỡ cổ vũ nhiệt tình để tơi hồn thành tốt thí nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến anh chị phòng Đào tạo nói riêng Học viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam nói chung, ln hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho học tập thực luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến lãnh đạo cấp đồng nghiệp Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y, tạo điều kiện động viên giúp đỡ để tơi hồn thành tốt nhiệm vụ học tập, nghiên cứu Với tất lịng biết ơn, tơi xin dành cho gia đình, người thân, bạn bè tin tưởng, thông cảm, động viên, tạo điều kiện chia sẻ khó khăn suốt thời gian qua, giúp tơi hồn thành tốt luận án Nghiên cứu sinh DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ APC Antigen-presenting cell – tế bào trình diện kháng nguyên bp Base pairs – cặp Nucleotide DISC Death-inducing signaling complex – phức hợp tín hiệu gây chết ELISA Enzym - Linked Immunosorbent Assay FLT3 Fms-related tyrosine kinase ligand GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor IL Interleukin IFN Interferon IκB-α Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in Bcells inhibitor, alpha LPS Lipopolysaccharide MHC Major histocompatipility complex – phức hệ phù hợp tổ chức NF-κB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NK cell Natural killer cell – tế bào giết tự nhiên pDC Plasmacytoid DC – tế bào tua dòng lympho STAT Signal transducer and activator of transcription - yếu tố truyền tín hiệu hoạt hố phiên mã TBT Tế bào tua TgPRF Profilin từ Toxoplasma gondii T gondii Toxoplasma gondii Th1 T helper cell type - tế bào T hỗ trợ loại T-reg T regular - tế bào T điều hoà TLR Toll-like receptor TNFAIP3 Tumor necrosis factor α-induced protein – Protein kích thích yếu tố hoại tử khối u TNF Tumor necrosis factor – yếu tố hoại tử u DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Các kit tách chiết, hoá chất sử dụng nghiên cứu 34 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 36 Bảng 2.3 Pha loãng protein chuẩn theo dải nồng độ chuẩn 45 Bảng 3.1 Ảnh hưởng protein A20 trưởng thành tế bào CD8+DC phơi nhiễm profilin 52 Bảng 3.2 Ảnh hưởng protein A20 trưởng thành tế bào CD11b+DC phơi nhiễm profilin 54 Bảng 3.3 Ảnh hưởng protein A20 trưởng thành tế bào pDC phơi nhiễm profilin 56 Bảng 3.4 Ảnh hưởng protein A20 tiết cytokine tế bào CD8+DC sau phơi nhiễm profilin 59 Bảng 3.5 Ảnh hưởng protein A20 tiết cytokine tế bào CD11b+DC sau phơi nhiễm profilin 61 Bảng 3.6 Ảnh hưởng protein A20 tiết cytokine tế bào pDC sau phơi nhiễm profilin 62 Bảng 3.7 Ảnh hưởng protein A20 tiết cytokine tế bào CD11b+DC sau phơi nhiễm LPS 65 Bảng 3.8 Ảnh hưởng protein A20 di cư nhóm tế bào tua sau phơi nhiễm profilin 67 Bảng 3.9 Ảnh hưởng protein A20 di cư tế bào CD11b+DC sau phơi nhiễm LPS 69 Bảng 3.10 Ảnh hưởng protein A20 apoptosis tế bào CD11b+DC sau phơi nhiễm LPS số cytokine, khảo sát tỉ lệ phần trăm tế bào dương tính với Annexin V, âm tính với 7-AAD 72 Bảng 3.11 Ảnh hưởng protein A20 apoptosis tế bào CD11b+DC sau phơi nhiễm LPS số cytokine, khảo sát tỉ lệ phần trăm tế bào dương tính với Caspase-3 74 Bảng 3.12 Ảnh hưởng protein A20 trưởng thành tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 phơi nhiễm profilin 84 Bảng 3.13 Ảnh hưởng protein A20 tiết cytokine tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 phơi nhiễm profilin 86 Bảng 3.14 Ảnh hưởng protein A20 di cư tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 phơi nhiễm profilin 89 Bảng 3.15 Ảnh hưởng protein A20 tiết cytokine tế bào CD11b+DC thơng qua tín hiệu STAT1 90 Bảng 3.16 Ảnh hưởng protein A20 di cư tế bào CD11b+DC thơng qua tín hiệu STAT1 92 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc gen A20 protein A20 Hình 1.2 Vai trò protein A20 tế bào miễn dịch Hình 1.3 Cơ chế protein A20 ức chế NF-κB đường tín hiệu TNFR1 10 Hình 1.4 Cơ chế protein A20 ức chế NF-κB đường hiệu IL1R/TLR4 11 Hình 1.5 Tế bào tua chuột phân lập từ lách 17 Hình 1.6 Vịng đời tế bào tua 18 Hình 1.7 Tế bào tua chức điều hịa miễn dịch 20 Hình 1.8 Sự biệt hóa đa dạng tế bào tua 23 Hình 1.9 TLR điều hoà hoạt động hệ thống miễn dịch 29 Hình 2.1 Sơ đồ nhóm thí nghiệm thứ - tế bào tua biệt hóa FLT3 phơi nhiễm với profilin 38 Hình 2.2 Sơ đồ nhóm thí nghiệm thứ hai - tế bào tua biệt hóa GM-CSF phơi nhiễm với LPS 39 Hình 2.3 Pha loãng protein chuẩn theo dải nồng độ chuẩn 46 Hình 3.1 Kết biểu protein A20 sau đưa A20-siRNA vào tế bào tua 50 Hình 3.2 Ảnh hưởng protein A20 trưởng thành tế bào CD8+DC phơi nhiễm profilin 53 Hình 3.3 Ảnh hưởng protein A20 trưởng thành CD11bDC phơi nhiễm profilin 55 Hình 3.4 Ảnh hưởng protein A20 trưởng thành tế bào pDC phơi nhiễm profilin 57 Hình 3.5 Ảnh hưởng protein A20 lên tiết cytokine tế bào CD8+DC phơi nhiễm profilin 60 Hình 3.6 Ảnh hưởng protein A20 lên tiết cytokine tế bào CD11bDC phơi nhiễm profilin 61 Hình 3.7 Ảnh hưởng protein A20 lên tiết cytokine tế bào pDC phơi nhiễm profilin 64 Hình 3.8 Ảnh hưởng protein A20 lên tiết cytokine tế bào CD11b+DC phơi nhiễm với LPS 66 Hình 3.9 Ảnh hưởng protein A20 lên di chuyển nhóm tế bào tua biệt hố FLT3 phơi nhiễm profilin 68 Hình 3.10 Ảnh hưởng protein A20 lên di chuyển nhóm tế bào CD11b+DC biệt hoá GM-CSF phơi nhiễm LPS 70 Hình 3.11 Ảnh hưởng protein A20 apoptosis thông qua số lượng tế bào CD11b+DC dương tính với marker Annexin V âm tính với 7-AAD 73 Hình 3.12 Ảnh hưởng protein A20 apoptosis thơng qua tỷ lệ tế bào CD11b+DC dương tính với marker Caspase-3 75 Hình 3.13 Ảnh hưởng protein A20 lên đường tín hiệu IκB-α, STAT1 STAT3 tế bào CD11b+DC phơi nhiễm profilin 77 Hình 3.14 Ảnh hưởng protein A20 lên đường tín hiệu IκB-α, STAT1 STAT3 tế bào pDC phơi nhiễm profilin 79 Hình 3.15 Ảnh hưởng protein A20 lên đường tín hiệu IκB-α, STAT1 STAT3 tế bào CD11b+DC phơi nhiễm LPS 82 Hình 3.16 Ảnh hưởng protein A20 lên biểu marker trưởng thành tế bào pDC thông qua đường tín hiệu IκB-α STAT1 84 Hình 3.17 Ảnh hưởng protein A20 lên tiết cytokine tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 87 Hình 3.18 Ảnh hưởng protein A20 lên di chuyển tế bào pDC thơng qua tín hiệu IκB-α STAT1 89 Hình 3.19 Ảnh hưởng protein A20 tiết cytokine tế bào CD11b+DC thông qua đường tín hiệu STAT1 91 121 92 L Yin, Z Fang, N J Shen, Y H Qiu, A J Li, and Y J Zhang, Downregulation of A20 increases the cytotoxicity of IFN-gamma in hepatocellular carcinoma cells, Drug Des Devel Ther, 2017, 11, 2841-2850 93 D D Bannerman and S E Goldblum, Mechanisms of bacterial lipopolysaccharide-induced endothelial apoptosis, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2003, 284 (6), L899-914 94 J Xaus, M Comalada, A F Valledor, J Lloberas, F Lopez-Soriano, J M Argiles, C Bogdan, and A Celada, LPS induces apoptosis in macrophages mostly through the autocrine production of TNF-alpha, Blood, 2000, 95 (12), 3823-3831 95 N T Xuan, E Shumilina, E Gulbins, S Gu, F Gotz, and F Lang, Triggering of dendritic cell apoptosis by xanthohumol, Mol Nutr Food Res, 2010, 54 Suppl 2, S214-224 96 K McArthur and B T Kile, Apoptotic Caspases: Multiple or Mistaken Identities?, Trends Cell Biol, 2018, 28 (6), 475-493 97 N T Xuan, P T Trang, N Van Phong, N L Toan, D M Trung, N D Bac, V L Nguyen, N H Hoang, and N Van Hai, Klotho sensitive regulation of dendritic cell functions by vitamin E, Biol Res, 2016, 49 (1), 45, PMID: 27881156 98 H J de Heer, H Hammad, T Soullie, D Hijdra, N Vos, M A Willart, H C Hoogsteden, and B N Lambrecht, Essential role of lung plasmacytoid dendritic cells in preventing asthmatic reactions to harmless inhaled antigen, J Exp Med, 2004, 200 (1), 89-98 99 Y Wang, D R McGivern, L Cheng, G Li, S M Lemon, J Niu, L Su, and N J Reszka-Blanco, Ribavirin Contributes to Hepatitis C Virus Suppression by Augmenting pDC Activation and Type IFN Production, PLoS One, 2015, 10 (8), e0135232 100 D N Hart, Dendritic cells: unique leukocyte populations which control the primary immune response, Blood, 1997, 90 (9), 3245-3287 101 M Kool, G van Loo, W Waelput, S De Prijck, F Muskens, M Sze, J van Praet, F Branco-Madeira, S Janssens, B Reizis, D Elewaut, R Beyaert, H Hammad, and B N Lambrecht, The ubiquitin-editing protein A20 prevents 122 dendritic cell activation, recognition of apoptotic cells, and systemic autoimmunity, Immunity, 2011, 35 (1), 82-96 102 R M Salazar Gonzalez, H Shehata, M J O'Connell, Y Yang, M E Moreno-Fernandez, C A Chougnet, and J Aliberti, Toxoplasma gondiiderived profilin triggers human toll-like receptor 5-dependent cytokine production, J Innate Immun, 2014, (5), 685-694 103 A G Schneider, D S Abi Abdallah, B A Butcher, and E Y Denkers, Toxoplasma gondii triggers phosphorylation and nuclear translocation of dendritic cell STAT1 while simultaneously blocking IFNgamma-induced STAT1 transcriptional activity, PLoS One, 2013, (3), e60215 104 N Matzner, I M Zemtsova, T X Nguyen, M Duszenko, E Shumilina, and F Lang, Ion channels modulating mouse dendritic cell functions, J Immunol, 2008, 181 (10), 6803-6809 105 J Simpson, K Miles, M Trub, R MacMahon, and M Gray, Plasmacytoid Dendritic Cells Respond Directly to Apoptotic Cells by Secreting Immune Regulatory IL-10 or IFN-alpha, Front Immunol, 2016, 7, 590, PMID: 28018356 106 Z Q Wang, A S Bapat, R J Rayanade, A S Dagtas, and M K Hoffmann, Interleukin-10 induces macrophage apoptosis and expression of CD16 (FcgammaRIII) whose engagement blocks the cell death programme and facilitates differentiation, Immunology, 2001, 102 (3), 331-337 107 G Migliorati, I Nicoletti, M C Pagliacci, L D'Adamio, and C Riccardi, Interleukin-2 induces apoptosis in mouse thymocytes, Cell Immunol, 1993, 146 (1), 52-61 108 K Matsuoka, J Koreth, H T Kim, G Bascug, S McDonough, Y Kawano, K Murase, C Cutler, V T Ho, E P Alyea, P Armand, B R Blazar, J H Antin, R J Soiffer, and J Ritz, Low-dose interleukin-2 therapy restores regulatory T cell homeostasis in patients with chronic graft-versus-host disease, Sci Transl Med, 2013, (179), 179ra143 109 A D Guerrero, M B Dong, Y Zhao, A Lau-Kilby, and K V Tarbell, Interleukin-2-mediated inhibition of dendritic cell development correlates 123 with decreased CD135 expression and increased monocyte/macrophage precursors, Immunology, 2014, 143 (4), 640-650 110 A Cerezo, A C Martinez, A Gonzalez, J Gomez, and A Rebollo, IL-2 deprivation triggers apoptosis which is mediated by c-Jun N-terminal kinase activation and prevented by Bcl-2, Cell Death Differ, 1999, (1), 87-94 111 S Zhao, J Feng, Q Wang, L Tian, Y Zhang, and H Li, hnRNP K plays a protective role in TNF-alpha-induced apoptosis in podocytes, Biosci Rep, 2018, 38 (3), PMID: 29724888 112 Y Chen, Z Zou, Z Wu, Z Zhao, X Luo, C Xie, and Y Liang, TNF-alphainduced programmed cell death in the pathogenesis of acquired aplastic anemia, Expert Rev Hematol, 2015, (4), 515-526 113 L Zheng, W Wang, J Ni, X Mao, D Song, T Liu, J Wei, and H Zhou, Role of autophagy in tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis of osteoblast cells, J Investig Med, 2017, 65 (6), 1014-1020 114 G Kak, M Raza, and B K Tiwari, Interferon-gamma (IFN-gamma): Exploring its implications in infectious diseases, Biomol Concepts, 2018, (1), 64-79 115 J Li, Y Zhang, L Chen, X Lu, Z Li, Y Xue, and Y Q Guan, Cervical Cancer HeLa Cell Autocrine Apoptosis Induced by Coimmobilized IFNgamma plus TNF-alpha Biomaterials, ACS Appl Mater Interfaces, 2018, 10 (10), 8451-8464 116 H L Xia, C J Li, X F Hou, H Zhang, Z H Wu, and J Wang, Interferongamma affects leukemia cell apoptosis through regulating Fas/FasL signaling pathway, Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2017, 21 (9), 2244-2248 117 V Calo, M Migliavacca, V Bazan, M Macaluso, M Buscemi, N Gebbia, and A Russo, STAT proteins: from normal control of cellular events to tumorigenesis, J Cell Physiol, 2003, 197 (2), 157-168 118 C L Manthey, S W Wang, S D Kinney, and Z Yao, SB202190, a selective inhibitor of p38 mitogen-activated protein kinase, is a powerful regulator of LPS-induced mRNAs in monocytes, J Leukoc Biol, 1998, 64 (3), 409-417 124 119 J C Fischer, V Otten, M Kober, C Drees, M Rosenbaum, M Schmickl, S Heidegger, R Beyaert, G van Loo, X C Li, C Peschel, M SchmidtSupprian, T Haas, S Spoerl, and H Poeck, A20 Restrains Thymic Regulatory T Cell Development, J Immunol, 2017, 199 (7), 2356-2365 120 A Polykratis, A Martens, R O Eren, Y Shirasaki, M Yamagishi, Y Yamaguchi, S Uemura, M Miura, B Holzmann, G Kollias, M Armaka, G van Loo, and M Pasparakis, A20 prevents inflammasome-dependent arthritis by inhibiting macrophage necroptosis through its ZnF7 ubiquitin-binding domain, Nat Cell Biol, 2019, 21 (6), 731-742 121 J H Yen, W Kong, and D Ganea, IFN-beta inhibits dendritic cell migration through STAT-1-mediated transcriptional suppression of CCR7 and matrix metalloproteinase 9, J Immunol, 2010, 184 (7), 3478-3486 122 R Forster, A C Davalos-Misslitz, and A Rot, CCR7 and its ligands: balancing immunity and tolerance, Nat Rev Immunol, 2008, (5), 362-371 123 H Jaeschke and B L Woolbright, Role of heme oxygenase in TNF/TNF receptor-mediated apoptosis after hepatic ischemia/reperfusion in rats Shock 39: 380-388, 2013, Shock, 2013, 40 (1), 75-76 125 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết nuôi cấy tế bào tua Phụ lục 1.1 Khả sống sót biệt hóa tế bào tua sau ni cấy Các tế bào tua có nguồn gốc từ tế bào tủy xương chuột BALB/c, chuột cung cấp công ty Taconic Farms (Hudson, Mỹ), nuôi điều kiện sạch, khơng nhiễm khuẩn, sử dụng hóc-mơn sinh trưởng GM-CSF vịng ngày Sau ni cấy, TBT nhuộm kháng thể FITC-Annexin V PE-CD11c vịng Hình 4.1 phần trăm số tế bào dương tính với marker CD11c Annexin V xác định kỹ thuật Flow cytometry Hình 4.1 Hình dot blot tế bào tua nhuộm kháng thể FITCAnnexin V PE-CD11c Hình 4.1 cho thấy 92% số tế bào tập trung vùng Q4, tức dương tính với marker CD11c gần khơng có tế bào dương tính với marker Annexin V, chứng tỏ đại đa số tế bào tủy xương biệt hóa thành TBT sống sót phát triển Phụ lục 1.2 Hình ảnh tế bào tua sau ni cấy Sử dụng DAPI, FITC anti-mouse NF-κB antibody PE anti-mouse beta actin antibody để quan sát hình dạng cấu trúc tế bào DAPI (4′,6-diamidino-2phenylindole) thuốc nhuộm chuyên biệt cho ADN DAPI hình thành nên phức hợp huỳnh quang cách gắn vào khe nhỏ trình tự ADN giàu A-T Phức hợp hấp thụ ánh sáng cực tím sau phát ánh sáng huỳnh quang màu 126 xanh da trời, cường độ cực đại 461 nm Do chất sử dụng để nhuộm nhân tế bào cho nhân sơ nhân chuẩn DAPI sử dụng để nhuộm ADN nhiều kỹ thuật khác flow cytometry, nhuộm nhiễm sắc thể, hiển thị định lượng ADN lĩnh vực hóa mơ hóa sinh Bên cạnh đó, kháng thể NFκB sử dụng để nhuộm tế bào chất kháng thể beta actin (P.E) để quan sát khung xương tế bào Các tế bào tua sau nhuộm thuốc nhuộm DAPI, kháng thể NF-κB, kháng thể beta actin để quan sát bắt màu nhân, tế bào chất thành tế bào soi kính hiển vi huỳnh quang thu hình ảnh sau: (A) (B) (C) (D) Hình 4.2 Hình ảnh tế bào tua nhuộm màu huỳnh quang (A) nhuộm với DAPI (B) nhuộm với kháng thể FITC NF-κB (C) nhuộm với kháng thể PE beta actin (D) nhuộm đồng thời loại Hình 4.2 hình ảnh thu từ kính hiển vi huỳnh quang sau nhuộm TBT với DAPI (để quan sát nhân tế bào), kháng thể NF-κB (để quan sát 127 mật độ protein tế bào), kháng thể beta actin (để quan sát thành tế bào) Qua quan sát hình dáng TBT kết cho thấy TBT việc ni cấy biệt hố thành công Phụ lục 1.3 Tế bào tua trưởng thành sau phơi nhiễm Lipopolysaccharide Như biết, LPS thụ thể kích hoạt TLR4 tế bào miễn dịch Một số nghiên cứu LPS ảnh hưởng đến khả trưởng thành, di cư hấp thu kháng nguyên TBT Sự gắn kết phối tử thụ thể TLR4 tế bào kích hoạt tín hiệu phân tử hoạt động làm tăng biểu marker bề mặt, tăng tiết số cytokine viêm [74] Khả tiết cytokine gây viêm tế bào liên quan trực tiếp đến hoạt động miễn dịch thể, từ điều hịa q trình trả lời miễn dịch trả lời đối kháng dị ứng, thể tiếp xúc với yếu tố gây bệnh tác nhân khác từ môi trường sống [44, 47] Trong thí nghiệm này, LPS sử dụng yếu tố kích hoạt trưởng thành TBT Để đánh giá mức độ trưởng thành TBT, tiến hành khảo sát marker bề mặt bao gồm CD86, CD40 MHC II nhóm TBT nhóm chứng nhóm phơi nhiễm LPS sau 24 Các TBT sau nuôi cấy biệt hoá GM-CSF, nhuộm kháng thể FITC-CD11c PE-CD86/ MHC II/ CD40 vòng giờ, tiến hành đồng thời nhóm chứng nhóm kích thích trưởng thành LPS để khác biệt Phần trăm số tế bào dương tính với marker CD11c CD86/MHC II/ CD40 sử dụng kỹ thuật Flow cytometry trình bày hình 4.3 Marker CD11c+ CD86+ Nhóm chứng Nhóm phơi nhiễm LPS 128 CD11c+ MHC II+ CD11c+ CD40+ Hình 4.3 Hình dot blot TBT nhuộm kháng thể FITC-CD11c PE-CD86/ MHC II/ CD40 Trong hình ảnh dot blot 4.3, trục tung CD11c, trục hoành CD 86, MHC II CD40 theo thứ tự hình từ xuống Kết cho thấy trước phơi nhiễm LPS TBT chưa trưởng thành biểu marker bề mặt MHC II, CD86 CD40 (mật độ tế bào rải rác vùng Q3, Q4, tập trung vùng Q2) Tuy nhiên nhóm TBT phơi nhiễm với LPS tế bào tập trung chủ yếu vùng Q2, tức dương tính với marker bề mặt nói Như vậy, so với nhóm chứng nhóm phơi nhiễm LPS ln có tỉ lệ phần trăm biểu marker bề mặt cao đáng kể bao gồm CD86, CD40 MHC II Điều cho thấy phơi nhiễm LPS làm kích thích trưởng thành nhóm TBT dương tính với marker CD11c+ 129 Phụ lục 2: Sự tiết TNF-α tế bào tua Trong nghiên cứu này, tế bào tua xử lý trước LPS IL-10 (200 ng/ml) Sau 24 giờ, thu hoạch dịch huyền phù cho thí nghiệm xác định nồng độ TNF-α kỹ thuật ELISA Hình 4.4 Nồng độ TNF-α dịch huyền phù CD11b+DC xác định ELISA Nồng độ TNF-a dịch huyền phù tế bào tua xác định kỹ thuật ELISA (n = 5) *(p < 0.05) khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm đối chứng nhóm tế bào xử lý IL-10 (phân tích kết hàm ANOVA) Kết Hình 4.4 cho thấy nồng độ TNF-α thu nhiều môi trường nuôi cấy tế bào với IL-10 Thông thường, kích hoạt TBT kháng nguyên LPS làm tăng tiết loại cytokine viêm từ ức chế chết apoptosis tế bào Ngược lại, tế bào chết hoại tử, khả giải phóng loại cytokine viêm giảm vật chất di truyền nhân tế bào bị thối hóa [123] Trong thí nghiệm phân tích khả tiết TNF-α dịch huyền phù TBT kỹ thuật ELISA, TBT xử lý trước LPS, sau xử lý tiếp IL10 (200 ng/ml) cuối thu hoạch dịch huyền phù cho thí nghiệm xác định nồng độ TNF-α kỹ thuật ELISA Khi kích thích tế bào CD11b+DC LPS, nồng độ TNF-α dịch huyền phù TBT tăng mạnh từ 1,5 lên 570 (pg/ml), tăng lên thành 874 (pg/ml) nhóm vừa kích thích LPS sau phơi nhiễm với IL-10 (200ng/ml) Thơng thường, kích hoạt TBT kháng nguyên LPS làm tăng tiết loại cytokine viêm cytokine kháng viêm, từ ức chế chết apoptosis tế bào Ngược lại, tế bào chết hoại tử, khả giải phóng loại cytokine viêm 130 giảm vật chất di truyền nhân tế bào bị thối hóa Trong thí nghiệm phân tích khả tiết TNF-α TBT dịch huyền phù tế bào kỹ thuật ELISA, nồng độ TNF-α thu nhiều môi trường nuôi cấy tế bào IL-10 cho thấy phosphoryl hóa STAT1 dẫn tới làm tăng phiên mã gen TNF-α nhân tế bào Chính thế, suy đốn IL-10 làm chết apoptosis TBT liên quan đến tín hiệu apoptosis TNF/TNF receptor/STAT1 131 Phụ lục 3: Ảnh hưởng số cytokine trình apoptosis tế bào CD11b+DC Phụ lục 3.1 Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Annexin V tác động cytokine IL-10, IL-2, TNF-α INF-γ Hình 4.5 Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Annexin V tác động cytokine IL-10, IL-2, TNF-α INF-γ *(p < 0,05) khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm đối chứng nhóm tế bào xử lý IL-10 (phân tích kết hàm ANOVA) Khi phân tích phần trăm số lượng tế bào dương tính với kháng thể Annexin V âm tính với 7-AAD, kết so với nhóm tế bào đối chứng có nhóm tế bào xử lý IL-10 nồng độ 200 ng/ml làm tăng số lượng tế bào dương tính với Annexin V cách rõ ràng (tăng 25%) Trong đó, nhóm TBT xử lý với cytokine cịn lại khơng ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ tế bào chết apoptosis, bao gồm nhóm xử lý IL-10 nồng độ thấp (20 ng/ml), nhóm xử lý TNF-a (10 ng/ml), IFN-g (10 ng/ml), IL-2 (30 ng/ml) với kết thu 21,3%; 20,6%; 19,2% 23,9% Như vậy, IL-10 nồng độ cao (200 ng/ml) làm tăng cường q trình apoptosis, cịn loại cytokine khác TNF-a, IFN-g, IL-2 với nồng độ nghiên cứu (TNF-a (10 ng/ml), IFN-g (10 ng/ml), IL-2 (30 ng/ml) khơng 132 Phụ lục 3.2 Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Caspase-3 tác động cytokine IL-10, IL-2, TNF-α IFN-γ Hình 5.6 Tỷ lệ TBT dương tính với marker Caspase-3 tác động cytokine IL-10, IL-2, TNF-α IFN-γ A Hình biểu đồ biểu hoạt động caspase-3 ảnh hưởng IL-10 (200 ng/ml) IL-2 TBT trưởng thành B Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Caspase-3 tác động cytokine IL-10 (n = 5) ** (p < 0,01) khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm đối chứng nhóm tế bào xử lý IL-10 C Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Caspase-3 tác động cytokine TNFα, IFN-γ IL-2 (n = 5) (phân tích kết hàm ANOVA) Kết rằng, so với nhóm tế bào đối chứng nhóm tế bào xử lý TNF-a (10 ng/ml), IFN-g (10 ng/ml) IL-2 (30 ng/ml) có biểu Caspase-3 không khác biệt rõ ràng Kết thu tỉ lệ tế bào chết apoptosis tăng 20% xử lý với TNF-a IFN-g, tăng 25% xử lý với IL-2 Tuy nhiên, IL-10 nồng độ 20 ng/ml 200 ng/ml làm tăng biểu Caspase-3, IL-10 nồng độ 200 ng/ml làm tăng tỷ lệ tế bào dương tính với Caspase-3 cao rõ rệt (tăng 31%) Điều IL-10 thúc đẩy trình apoptosis TBT, cịn cytokine khác TNF-a, IFN-g, IL-2 khơng làm tăng cường q trình 133 Phụ lục 4: Vai trò điều hòa IL-10 phosphoryl hóa STAT1 STAT3 tế bào tua Phụ lục 4.1 Vai trị điều hồ IL-10 phosphoryl hoá STAT1 Từ kết Hình 5.5 5.6 khẳng định IL-10 ảnh hưởng đến trình apoptosis TBT phụ thuộc vào nồng độ, cytokine khác IL-2, TNF-a IFN-g khơng Vì vậy, tiếp tục phân tích xem IL-10 có kích hoạt phân tử tín hiệu STAT1 hay khơng Trong thí nghiệm này, biểu hoạt động tín hiệu phân tử STAT1 mơ tả Hình 4.7 A B Hình 4.7 Phân tích tín hiệu hoạt động STAT1 tế bào CD11b+DC phơi nhiễm với IL-10 Hình ảnh Western blot biểu p-STAT1 TBT xử lý với IL-10 LPS đồng thời IL-10 LPS không xử lý (nhóm chứng) Kết rằng, hoạt hóa TBT kháng nguyên LPS IL-10 làm tăng phosphoryl hóa STAT1 hoạt động tín hiệu tăng lên tế bào xử lý đồng thời với LPS IL-10 Như vậy, IL-10 làm tăng cường phosphoryl hóa STAT1 Kết tương tự với kết nhóm De Wilde thực tế bào tuỷ xương thu kết protein A20 ức chế tín hiệu STAT1 [34] 134 Phụ lục 4.2 Vai trị điều hồ IL-10 phosphoryl hố STAT3 Khi phân tích hoạt động tín hiệu phân tử STAT3 kỹ thuật Western blot TBT phá vỡ dung dich RIPA thu protein tổng số, sau protein điện di để xác định biểu hoạt động tín hiệu STAT3 A B Hình 4.8 Phân tích tín hiệu hoạt động STAT3 CD11b+DC phơi nhiễm với IL-10 Hình ảnh Western blot biểu p-STAT1, p-STAT3 TBT xử lý với IL-10 LPS đồng thời IL-10 LPS khơng xử lý (nhóm chứng) Kết Hình 4.8 rằng, hoạt động tín hiệu STAT3 khơng thay đổi tế bào xử lý với IL-10, tăng cường xử lý với LPS, tăng xử lý cộng gộp LPS IL-10 Kết tương tự với kết nhóm De Wilde thực tế bào tuỷ xương kết luận protein A20 có vai trị ức chế STAT1 không ảnh hưởng đến STAT3, điều kiện không kích thích sau kích thích IFN-γ IL-6 [34] Một tín hiệu phân tử liên quan đến trình apoptosis biết đến STAT, tín hiệu kích hoạt thơng qua phosphoryl hóa vùng Cterminal Các nghiên cứu trước chuột thiếu hụt gen STAT1 xuất khối u tự phát nhanh so với nhóm đối chứng [31] Khi phân tích hoạt động tín hiệu phân tử STAT1 STAT3 kỹ thuật Western 135 blot Kết rằng, phosphoryl hóa STAT1 tăng lên hoạt hóa TBT kháng nguyên LPS IL-10 hoạt động tín hiệu tăng tế bào xử lý đồng thời với LPS IL-10 Hoạt động tín hiệu STAT3 khơng thay đổi tế bào xử lý IL-10 Nghiên cứu cho thấy tác dụng IL-10 tác nhân kích hoạt STAT1 sau gây apoptosis TBT Do đó, vai trị điều tiết protein A20 mức độ IL-10 ảnh hưởng đến sống tế bào ... Vai trò protein A20 tế bào T 1.1.2.2 Vai trò protein A20 tế bào B 1.1.2.3 Vai trò protein A20 tế bào tua 1.1.4 Vai trò protein A20 chết theo chương trình apoptosis 1.1.5 Cơ. .. gen A20 tế bào tua 50 3.1.2 Vai trò protein A20 điều hòa trưởng thành tế bào tua 51 3.1.3 Vai trò protein A20 tiết cytokine tế bào tua 59 3.1.3.1 Vai trò protein A20 tiết cytokine tế. .. trò protein A20 đối trình apoptosis tế bào tua 70 3.2 Nghiên cứu số tín hiệu phân tử liên quan đến trình sinh lý tế bào tua vai trò điều hòa protein A20 76 3.2.1 Protein A20 điều hịa