Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng schizochytrium mangrovei PQ6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN CẨM HÀ NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƢỚNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE, MỸ PHẨM VÀ DƢỢC PHẨM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS Đặng Diễm Hồng Hà Nội – Năm 2020 i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới GS TS Đặng Diễm Hồng, nguyên Trưởng phịng Cơng nghệ tảo, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - người thầy định hướng, truyền dạy kiến thức khoa học giúp đỡ vượt qua trở ngại khó khăn suốt thời gian thực luận án Tôi trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Cơng nghệ sinh học, phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Ban Lãnh đạo phận đào tạo Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất giúp tơi hồn thành thủ tục cần thiết trình làm nghiên cứu Trong trình viết luận án nhận giúp đỡ, bảo tận tình TS Hồng Thị Lan Anh Ngồi nhận giúp đỡ đồng nghiệp làm việc phịng Cơng nghệ Tảo: TS Hồng Thị Minh Hiền, TS Ngơ Thị Hồi Thu, TS Lưu Thị Tâm, ThS NCS Lê Thị Thơm Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ q báu Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Nguyễn Hoàng Ngân- Học viện Quân Y, giúp đỡ số thử nghiệm động vật thực nghiệm, phân tích độc tính cấp, độc tính bán trường diễn tác dụng dược lý squalene Luận án thực khuôn khổ đề tài Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia - Nafosted, Bộ Khoa học Công nghệ “Nghiên cứu đánh giá khai thác chất squalene làm dược phẩm từ vi tảo biển Việt Nam” (2013-2016) PGS TS Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm, đề tài “Cơ chế điều hòa trao đổi lipid hợp chất từ thực vật biển Việt Nam phịng điều trị bệnh gan nhiễm mỡ khơng rượu” (2014-2016) đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam “Nghiên cứu hồn thiện quy trình ni trồng lượng lớn sinh khối tảo Schizochytrium mangrovei PQ6 tách chiết qualene đủ tiêu chuẩn nguyên liệu làm thực phẩm chức năng” (2014-2016) TS Hồng Thị Minh Hiền làm chủ nhiệm Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả Nguyễn Cẩm Hà ii Lời cam đoan Tôi xin cam Ďoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần Ďã Ďược cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với Ďồng ý cho phép Ďồng tác giả; Phần cịn lại chưa Ďược cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2020 Tác giả Nguyễn Cẩm Hà iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn…………………………………………………………………… i Lời cam Ďoan………………………………………………………………… ii Mục lục………………………………………………………………………… iii Danh mục ký hiệu, từ viết tắt………………………………………… viii Danh mục bảng…………………………………………………… xi Danh mục hình vẽ, Ďồ thị………………………………………………… xii MỞ ĐẦU……………………………………………………………………… Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………… 1.1 Giới thiệu chung squalene………………………………… 1.1.1 Tính chất hóa lý squalene………………………………… 1.1.2 Nguồn gốc cấu trúc squalene…………………………… 1.1.3 Các Ďường sinh tổng hợp squalene Ďộng vật, thực vật vi sinh vật…………………………………………………… 1.1.4 Ứng dụng squalene………………………………………… 11 1.1.5 Các nguồn cung cấp squalene………………………………… 18 1.2 Công nghệ tách chiết tinh squalene…………… …… 21 1.2.1 Công nghệ tách chiết squalene………………………………… 21 1.2.2 Các phương pháp Ďịnh lượng tinh squalene………… 27 1.3 Giới thiệu công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dƣỡng……… 29 1.4 Giới thiệu chi vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium……… 33 1.4.1 Đặc Ďiểm chung chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium… 33 1.4.2 Tình hình ni trồng chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium cho sản xuất squalene…………………………………………… 1.4.2.1 Tình hình nuôi trồng chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium cho sản xuất squalene giới…………………………… 1.4.2.2 37 37 Tình hình nghiên cứu ni trồng Schizochytrium cho sản xuất squalene Việt Nam……………………………………………… 39 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………… 43 2.1 iv Vật liệu………………………………………………………… 43 2.1.1 Mẫu vật………………………………………………………… 43 2.1.2 Các kít sinh phẩm…………………………………………… 44 2.1.3 Động vật thí nghiệm…………………………………………… 45 2.1.4 Các dịng tế bào………………………………………………… 46 2.1.5 Hố chất………………………………………………………… 46 2.1.6 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm………………………………… 46 2.1.7 Môi trường nuôi cấy…………………………………………… 47 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu……………………………………… 48 2.2.1 Nhóm phương pháp xác Ďịnh chủng/lồi; Ďặc Ďiểm sinh học; Ďiều kiện nuôi trồng tối ưu chủng/loài tiềm cho sản xuất squalene cao ……………… 2.2.1.1 48 Phương pháp xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào sinh khối khơ………………………………………………………………… 48 2.2.1.2 Phương pháp chụp ảnh hình thái……………………………… 49 2.2.1.3 Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng số sinh khối tảo……………………………………………………………………… 49 2.2.1.4 Phương pháp nhuộm lipid Nile Red………………………… 49 2.2.1.5 Phương pháp xác định đường khử DNSA…………………… 49 2.2.1.6 Phương pháp xác định sơ hàm lượng squalene……………… 50 2.2.1.7 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu điều kiện ni trồng tối ưu chủng/loài tiềm thuộc chi Schizochytrium cho sản xuất squalene cao ………………………………………………………… 2.2.2 Nhóm phương pháp xác định điều kiện tách chiết tinh squalene từ S mangrovei PQ6……………………………………… 2.2.2.1 S.mangrovei PQ6……………………………………………………………………… 53 Phương pháp xây dựng quy trình tách chiết làm squalene quy mô pilot từ sinh khối tảo S mangrovei PQ6……………………………………………………………………… 2.2.2.3 53 Phương pháp xác định điều kiện tách chiết tinh lượng nhỏsqualenetừsinhkhối 2.2.2.2 50 55 Phương pháp xác định hàm lượng độ tinh squalene 56 2.2.2.4 v Phương pháp xác định cấu trúc squalene 2.2.3 Nhóm phương pháp xác Ďịnh tiêu chất lượng squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6……………………… 2.2.4 57 57 Nhóm phương pháp Ďánh giá tính an tồn tác dụng dược lý squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6 Ďộng vật thực nghiệm (in vivo) mơ hình tế bào (in vitro)………………… 2.2.4.1 58 Nhóm phương pháp đánh giá tính an tồn tác dụng dược lý squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6 mơ hình in vivo……………………………………………………………………… 2.2.4.2 58 Nhóm phương pháp đánh giá bước đầu nghiên cứu chế tác dụng giảm lipid squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6 mơ hình in vitro………………………………………………… 59 2.2.5 Thống kê phân tích số liệu……………………………………… 63 2.2.6 Địa Ďiểm tiến hành thí nghiệm nghiên cứu…………… 63 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN….…………… 65 3.1 Sàng lọc chủng vi tảo biển dị dƣỡng có tiềm sản xuất squalene………………………………………………………… 3.2 Ảnh hƣởng điều kiện nuôi trồng S mangrovei PQ6 lên sinh trƣởng hàm lƣợng squalene………………………… 3.2.1 67 Tối ưu Ďiều kiện nuôi trồng S mangrovei PQ6 cho sản xuất squalene cấp Ďộ bình tam giác………………………………… 3.2.1.1 65 67 Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng hàm lượng squalene cấp độ bình tam giác……………………………………………… 67 3.2.1.2.Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng hàm 3.2.1.3 3.2.1.4 lượng squalene cấp độ bình tam giác …………………………… Ảnh hưởng nồng độ glucose ban đầu lên sinh trưởng 69 hàm lượng squalene cấp độ bình tam giác……………………… 70 Ảnh hưởng nồng độ tebinafine lên sinh trưởng hàm lượng squalene cấp độ bình tam giác …………………………… 3.2.1.5 Ảnh hưởng nồng độ hỗn hợp vitamin lên sinh trưởng hàm lượng squalene cấp độ bình tam giác………….………… 3.2.2 72 73 Tối ưu Ďiều kiện nuôi trồng chủng S mangrovei PQ6 bình lên men 30 lít Ďể thu sinh khối tảo giàu squalene………………… 75 3.2.2.1 vi Ảnh hưởng nồng độ glucose lên sinh trưởng tích lũy squalene chủng S mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ hệ thống bình lên men 30 lít………………………………………… 3.2.2.2 75 Ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh trưởng tích lũy squalene chủng S mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ hệ thống lên men 30 lít………………………………………………………… 3.2.2.3 Ảnh hưởng lên men theo mẻ có bổ sung chất lên sinh trưởng tích lũy squalene chủng S mangrovei PQ6…… 3.2.2.4 81 Xây dựng quy trình tách chiết tinh squalene từ S mangrovei PQ6………………………………………………… 3.3.1 79 Ảnh hưởng tổ hợp vitamin lên sinh trưởng tích lũy squalene chủng S mangrovei PQ6………………………… 3.3 77 86 Tối ưu Ďiều kiện tách chiết tinh lượng nhỏ squalene từ S mangrovei PQ6……………………………………………… 86 3.3.1.1 Tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S mangrovei PQ6……… 86 3.3.1.2 Tách chiết lipid không xà phịng hóa từ lipid tổng số…………… 90 3.3.1.3 Tinh định lượng squalene sắc ký lớp mỏng sắc ký lỏng cao áp………………………………………………………… 3.3.1.4 Tách chiết, tinh làm giàu squalene phương pháp dung môi……………………………………………………………… 3.3.2 94 Ảnh hưởng tác nhân lên hiệu tách chiết squalene từ sinh khối khô S mangrovei PQ6…………………………………… 3.3.2.2 92 Xây dựng quy trình tách chiết tinh squalene quy mô pilot từ S mangrovei PQ6……………………………………… 3.3.2.1 91 95 Tách chiết squalene từ dịch tế bào chủng S mangrovei PQ6 sau q trình ni cấy lên men theo mẻ có bổ sung chất ………… 97 3.3.2.3 Điều kiện tinh chế squalene phương pháp sắc ký cột…… 98 3.3.2.4 Xây dựng quy trình tách chiết làm nguyên liệu squalene từ sinh khối tảo S mangrovei PQ6……………………………… 101 3.3.3 Tách chiết tinh chế lượng lớn squalene từ S.mangrovei PQ6 103 3.3.4 Phân tích tiêu cảm quan, hóa lý, vi sinh vật kim loại squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6……………… 3.4 Tính an tồn tác dụng dƣợc lý squalene tách chiết từ 105 vii S mangrovei PQ6 mơ hình động vật thực nghiệm (in vivo) mơ hình tế bào (in vitro)……………………………… 3.4.1 Độc tính cấp squalene mơ hình Ďộng vật thực nghiệm………………………………………………………… 3.4.2 109 Đánh giá mức độ tổn thương chức gan, thận chuột dùng squalene dài ngày……………………………………………… 3.4.3 108 Ảnh hưởng squalene số tiêu huyết học sinh hóa chuột…………………………………………………… 3.4.2.3 108 Ảnh hưởng squalene lên tình trạng chung thay đổi thể trọng chuột cống trắng dùng dài ngày…………………… 3.4.2.2 107 Độc tính bán trường diễn squalene mơ hình Ďộng vật thực nghiệm…………………………………………………… 3.4.2.1 107 112 Tác dụng dược lý squalene chuột nhắt trắng thí nghiệm………………………………………………………… 114 3.5 Bƣớc đầu nghiên cứu chế tác dụng giảm lipid squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6 mơ hình in vitro…………………………………………………………… 117 3.5.1 Đánh giá Ďộc tính squalene dòng tế bào…………… 117 3.5.2 Tác dụng giảm lipit squalene lên tế bào gan tế bào Ďại thụ thể…………………………………………………………… 3.5.2.1 Tối ưu hóa thời gian nồng độ ủ squalene lên thay đổi hàm lượng lipid tế bào gan HepG2……………………………… 3.5.2.2 119 Cơ chế phân tử tác dụng giảm cholesterol squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6……………………………………… 3.5.4 118 Tác dụng squalene lên thay đổi hàm lượng lipid nội bào tế bào gan HepG2 RAW264.7…………………………… 3.5.3 118 121 Tác dụng giảm triglyceride squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6………………………………………………… 125 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………… 127 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ……………………………… 129 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… 131 PHỤ LỤC viii Q111`DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng Việt ABCA1 ATP-binding cassette protein A1 Protein A1 liên kết với ATP ABCG1 ATP-binding cassette protein G1 Protein G1 liên kết với ATP ALT Alanine aminotransferase Alanine aminotransferase ApoE Apolipoprotein E Apolipoprotein E AST Aspartate aminotransferase Aspartate aminotransferase ATP Adenosine triphosphate Adenosine triphosphate CCT Chuột cống trắng Chuột cống trắng CNT Chuột nhắt trắng Chuột nhắt trắng CYP7A1 Cholesterol 7a- hydroxylase Cholesterol 7a- hydroxylase DHA Docosahexaenoic acid Axít docosahexaenoic DMAPP Dimethylallyl diphosphate Dimethylallyl diphosphate DMEM Dulbecco's medium DNA Deoxyribonucleic acid Axít deoxyribonucleic DO Dissolved oxygen Oxy hịa tan DXP 1- deoxy-D-xylulose-5-phosphate 1- deoxy-D-xylulose-5-phosphate EN Ectoplasmic net Mang lưới ngoại chất ER Endoplasmic reticulum Màng lưới nội chất EPA Eicosapentaenoic acid Acid eicosapentaenoic FAS Fatty acid synthase Fatty acid synthase modified eagle Môi trường DMEM ix ESFA Este steryl fatty acid Acid béo este steryl FBS Fetal bovine serum Huyết phơi bị FPP Farnesyl diphosphate Farnesyl diphosphate GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH GC Gas chromatography Sắc ký khí GPP Geranyl diphosphate Geranyl diphosphate HDL-C high density cholesterol lipoprotein- cholesterol gắn với lipooprotein tỷ trọng cao HMG-CoA 3-hydroxy-3 methylglutaryl-CoA 3-hydroxy-3 methylglutaryl-CoA HMGR - hydroxyl - - methylglutaryl coenzyme A reductase - hydroxyl - - methylglutaryl coenzyme A reductase HPLC High performance chromatography IPP Isopentenyl diphosphate Isopentenyl diphosphate KLCT Khối lượng thể Khối lượng thể KXPH Khơng xà phịng hóa Khơng xà phịng hóa LD50 Lethal dose 50% Liều gây chết 50% số Ďộng vật thực nghiệm LDL-C Low density liporotein-cholesterol Cholesterol gắn với lipoprotein tỷ trọng thấp LDL-R Low density lipoprotein - receptor Thụ thể lipoprotein có tỷ trọng thấp LXR Liver X receptor Thụ thể gan X MĐTB Mật Ďộ tế bào Mật Ďộ tế bào liquid Sắc ký lỏng cao áp ... thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm dược phẩm Vi? ??t Nam Chính vậy, chúng tơi thực Ďề tài ? ?Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 định hƣớng làm nguyên liệu cho thực. .. hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm dược phẩm Các nội dung nghiên cứu luận án - Sàng lọc Ďược chủng/loài vi tảo biển Vi? ??t Nam tiềm cho sản xuất squalene từ số chủng vi. .. với cholesterol mơ hình Ďộng vật thực nghiệm, Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm dược phẩm - Lần Ďầu tiên Vi? ??t Nam Ďã chứng minh Ďược squalene tách chiết từ S mangrovei