Bài viết trình bày phân lập vi tảo Schizochytrium; tốc độ sinh trưởng của hai chủng vi tảo Schizochytrium sp PQ6 và PQ7 trên môi trường M1; kết quả nghiên cứu thành phần axit béo bão hòa và không bão hòa của hai chủng vi tảo Schizochytrium sp. PQ6 và PQ7.
30(2): 50-55 Tạp chí Sinh học 6-2008 PHÂN LậP đợc VI TảO BIểN Dị DƯỡNG SCHIZOCHYTRIUM GIàU DHA VùNG BIểN HUYệN ĐảO PHú QUốC Đặng Diễm Hồng, Hoàng Lan Anh, ngô thị hoài thu Viện Công nghệ sinh học Trong số loại vi tảo biển dị dỡng sản sinh axít béo không bão hoà đa nối ®«i (polyunsaturated fatty acids - PUFAs) ω-3 cao, gåm cã Thraustochytrium aureum, Schizochytrium spp., Crypthecodinium cohnii, Ulkenia spp., Amphidinium carterae Labyrinthula spp vi tảo Schizochytrium cho sản lợng DHA (docosahexaenoic acid, C22: 6n-3) cao nhất, đạt đến 138 mg/l/h [9] Vì vậy, Schizochytrium đợc quan tâm nghiên cứu, sử dụng để sản xuất thơng mại DHA, làm thức ăn bổ sung cho ngời động vật nuôi Theo khoá phân loại Porter (1990), Schizochytrium thc hä Thraustochytriidae (Thraustochytrids), líp Labyrinthulea, ngµnh Heterokontophyta [8] Các tế bào Schizochytrium có dạng hình cầu, có mạng lới ngoại chất xuất phát từ bề mặt tế bào [3, 4, 7] Cho đến nay, vi tảo Schizochytrium đợc sản xuất công nghiệp số nớc giới Một quy trình công nghệ nuôi trồng Schizochytrium đợc công ty Martek Biocience (Mỹ) thiết lập với hiệu xuất 20g sinh khối tảo khô/l sau 48 nuôi cấy hàm lợng PUFAs -3 chiếm 10% sinh khối tế bào Nhật Bản, hiệu xuất lên men chủng Schizochytrium limacinum SR21 đạt 48,1 g trọng lợng khô (TLK)/l 13,3 g DHA/l sau ngày nuôi cấy [11] Sau Labyrinthula [5], Schizochytrium chi vi tảo biển dị dỡng thứ hai thuộc họ Thraustochytriidae đợc phát phân lập Việt Nam, phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học Từ mẫu trôi dạt đợc thu từ vùng biển huyện đảo Phú Quốc, phát hiện, phân lập nuôi cấy ổn định điều kiện phòng thí nghiệm chủng vi tảo Schizochytrium có hàm lợng lipit tổng số chiếm gần 38 - 41% TLK tÕ bµo vµ DHA chiÕm 38 - 45% lipit tỉng số I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Vật liệu - Mẫu vật: đớc (Rhizophora apiculata Blume, thuộc họ Đớc Rhizophoraceae) giai đoạn phân hủy trôi dạt ven bìa rừng ngập mặn thuộc vùng biển huyện đảo Phú Quốc (gồm An Thới, Hàm Ninh, Gành Dầu), tỉnh Kiên Giang vào tháng 7/2006 - Môi trờng phân lập: môi trờng để phân lập vi tảo Schizochytrium đợc ký hiệu GPYc Môi tr−êng cã chøa glucoza (2 g/l), polypepton (1 g/l), cao nÊm men (0,5 g/l), th¹ch (15 g/l), 50% pure salt-ASW (17,5 g/l) - nớc biển nhân tạo có nồng độ tơng đơng 1,5% NaCl (Tropic Marine Aquarientechnik, Wartenberg, Germany) chloramphenicol (50 mg/l) - M«i tr−êng nu«i láng: sau phân lập, Schizochytrium đợc nuôi cấy môi trờng M1, có thành phần nh sau: glucoza (30 g/l), cao nÊm men (10 g/l), ASW (17,5 g/l) b×nh tam giác 250 ml 28oC lắc 200 vòng/phút, tối - Các thiết bị đợc sử dụng nghiªn cøu gåm cã: kÝnh hiĨn vi quang häc Olympus CH02 (Nhật Bản), buồng đếm số lợng tế bào Burker turk (Đức), cân phân tích Precisa XT2200A (Thụy Điển), tủ nuôi cấy nhiệt độ 28oC, máy lắc IKA KS260 basic (Đức), máy soxhlet, máy sắc ký khí lỏng GC - MS - HP - 6890, ghÐp nèi víi Mass Selective Detector Aglient 5973; cét HP - 5MS (0,25 cm × 30 m × 0,25 mm); khÝ mang He; th− viện phổ khối WILEY275.L NIST 98.L Công trình đợc hỗ trợ kinh phí Chơng trình nghiên cứu 50 Phơng pháp - Quy trình phân lập: vi tảo Schizochytrium đợc phân lập theo phơng pháp cđa Yokochi vµ cs (1998) [11] cã sư dơng phÊn thông (pinepollen) Sau thu thập, mẫu đớc đợc rửa nớc biển, cắt ba mảnh với kích thớc 0,5 cm ì 0,5 cm cho vào ống nghiệm có chứa 5ml nớc biển nhân tạo khử trùng bổ xung phấn thông Sau đó, ống nghiệm đợc giữ 28oC tối Sau 24 giê, dïng que cÊy platin thu lÊy phÊn th«ng nỉi bề mặt nớc ria cấy đĩa petri chứa môi trờng GPYc Các đĩa đợc đặt 28oC, tối Sau 3-5 ngày, đĩa đợc quan s¸t d−íi kÝnh hiĨn vi quang häc Olympus CH02 (Nhật Bản) với độ phóng đại 100 lần Quan sát dới kính hiển vi, tế bào Schizochytrium có dạng hình tròn, tập trung thành cụm bao quanh hạt phấn thông Việc cấy chuyển môi trờng GPYc nhiều lần cho phép thu đợc khuẩn lạc Schizochytrium vi khuẩn nấm - Xác định tốc độ sinh trởng phơng pháp đếm số lợng tế bào buồng đếm Burker Turk cân TLK (sấy 105oC, giờ) thời điểm nuôi cấy khác nhau, môi Pine pollen Schizochytrium PQ6 trờng M1 - Phân tích hàm lợng lipit tổng số máy soxhlet theo Nguyễn Văn Mùi [6] - Phân tích thành phần hàm lợng PUFAs phơng pháp sắc ký khí lỏng (tại Viện Hoá học hợp chất tự nhiên) theo Hoàng Lan Anh cs., 2005 [5] II KếT QUả Và THảO LUậN Phân lập vi tảo Schizochytrium Với 17 mẫu đớc có sống thu vùng rừng ngập mặn ven biển huyện đảo Phú Quốc, phát hiện, phân lập nuôi cấy ổn định điều kiện phòng thí nghiệm đợc chủng vi tảo Schizochytrium sp PQ6 PQ7 Hình minh họa hình dạng khuẩn lạc hai chủng vi tảo Schizochytrium (chụp kính hiển vi quang học Olympus CH02 độ phóng đại 1200 lần) Hình cho thấy, tế bào Schizochytrium bám xung quanh hạt phấn thông cho phép nhận diện phân lập Schizochytrium cách dễ dàng chủng Schizochytrium sp PQ6 PQ7 có tế bào dạng hình cầu đợc trình bày hình Pine pollen Schizochytrium PQ7 Hình Hình dạng khuẩn lạc hai chủng vi tảo Schizochytrium sp PQ6 PQ7 sau ngày nuôi cấy môi trờng GPYc PQ6 50àm PQ7 50àm Hình Hình dạng tế bào hai chủng vi tảo Schizochytrium sp PQ6 PQ7 sau ngày nuôi cấy môi trờng M1 51 Tốc độ sinh trởng hai chủng vi tảo Schizochytrium sp PQ6 PQ7 môi trờng M1 Tốc độ sinh trởng hai chủng vi tảo Schizochytrium sp PQ6 PQ7 đợc nuôi cấy môi trờng M1, đợc bảng hình Kết bảng cho thấy, hai chủng PQ6 PQ7 có tốc độ phát triển khác Chủng PQ6 có mật độ tế bào, TLK đạt cao sau ngày nuôi trồng môi trờng M1 35,35 triệu tế bào/ml 11,13 g TLK/l, tơng ứng Còn với chủng PQ7, mật độ TLK đạt cao sau ngày nuôi cấy với giá trị 43,6 triệu tế bào/ml 11,28 g TLK/l, tơng ứng TLK thu đợc hai chủng nêu khác không nhiều, song hàm lợng lipit lại tơng đối khác Sau ngày nuôi cấy, chủng PQ6 có hàm lợng lipit đạt 4,01 g/l, chiếm 38,67% TLK Còn với chủng PQ7, sau ngày nuôi cấy, giá trị đạt 4,31 g/l 40,59% TLK, tơng ứng Bảng Chủng vi tảo PQ6 PQ7 Mật độ tế bào, trọng lợng khô (TLK) hàm lợng lipit hai chủng vi tảo Schizochytrium sp PQ6 PQ7 môi trờng M1 Ngày TLK, Hàm lợng lipit, Hàm lợng lipit (%), Mật độ ì (g/l) g/l g/gTLK nu«i 106 tb/ml 0,24 0,05 14,79 5,52 0,86 15,51 23,60 10,21 2,25 21,99 35,35 11,13 4,01 38,67 26,50 10,72 3,72 33,36 21,34 9,61 2.97 30,91 19,42 8,21 2.31 28,14 10 15,23 6,12 1.69 27,61 0,22 0,05 13,92 4,49 0,68 15,11 10 21,40 31,85 33,65 43,60 21,47 14,92 8,59 9,39 10,63 11,28 9,05 7,72 1,74 2,43 4,31 4,135 2,29 1,69 20,23 27,67 40,59 36,64 25,31 21,88 Ghi chú: (-) không xác định đợc mật độ tế bào sinh khối ban đầu thí nghiệm qu¸ thÊp TLK, g/l 12 PQ6 10 PQ7 Ngày 0 10 Hình Tốc độ sinh trởng hai chủng vi tảo Schizochytrium sp PQ6 PQ7 môi trờng M1 52 Trong thành phần lipit vi tảo Schizochytrium, quan tâm đến hàm lợng PUFA, đặc biệt DHA Do vậy, thành phần axit béo bão hoà không bão hoà (PUFAs) chủng PQ6 (sau ngày nuôi cấy) chủng PQ7 (sau ngày nuôi cấy) đợc phân tích Kết phân tích hàm lợng axit béo hai chủng PQ6 PQ7 đợc bảng 2, hình Bảng Kết phân tích thành phần axit béo bão hoà không bão hoà (PUFAs) hai chủng vi tảo Schizochytrium sp PQ6 vµ PQ7 PQ6 STT Ký hiƯu C14:0 C15:0 C16:1(n-7) C16:0 C17:0 C18:2(n-6) C18:1(n-9) C18:0 C20:4(n-6) 10 11 12 13 Tªn khoa häc Tªn th−êng gäi Tetradecanoic axÝt Myristic Pentadecanoic axÝt 9-Hexadecenoic axÝt Palmitoleic Hexadecenoic axÝt Palmitic Heptadecanoic axÝt Margric 9,12-Octadecadienoic axÝt Linolelaidic Cis 9-Octadecenoic axÝt Oleic Octadecenoic axÝt Stearic 5,8,11,14-Eicosatetraenoic Arachidonic axÝt AA C20:5(n-3) 5,8,11,14,17EPA Eicosapentaenoic axÝt C20:0 Eicosanoic axít Arachidic C22:6(n-3) 4,7,10,13,16,19DHA Docosahexaenoic axít Các loại khác Tổng axít béo bão hoà Tổng axít béo không bão hoà Tổng số axít béo chiếm 90% lipit tổng số Thời gian lu (Rt) Hàm lợng (%) 8,54 9,57 10,37 10,61 11,53 2,5 8,41 0,25 37,71 1,84 12,29 12,46 13,66 0,69 1,27 0,92 13,74 0,75 14,25 15,74 0,28 43,52 1,41 52,46 46,13 PQ7 Thời Hàm gian lợng l−u (%) (Rt) 8,52 3,48 9,55 7,39 10,35 0,58 10,57 36,95 11,51 1,80 12,17 0,33 12,22 2,40 12,46 1,72 14,24 15,74 0,46 38,07 6,82 51,8 41,38 Palmitic DHA EPA Thêi gian l−u, H×nh Phỉ axÝt bÐo cđa chđng vi tảo Schizochytrium sp PQ6 sau ngày nuôi cấy môi trờng M1 53 Palmitic DHA Thời gian lu, phút Hình Phổ axít béo chủng vi tảo Schizochytrium sp PQ7 sau ngày nuôi cấy môi trờng M1 Kết thu đợc thành phần axít béo hai chủng PQ6 PQ7 đợc bảng cho thấy axit docosahexaenoic (DHA) palmitic thành phần tổng số axit béo Hàm lợng DHA hai chủng PQ6 PQ7 đạt cao, chiếm đến 43,52 38,07% tổng số hàm lợng axit béo, tơng ứng Hàm lợng axit palmitic đạt giá trị 37,71% 36,95% tổng số axit béo chủng PQ6 PQ7, tơng ứng Tổng số hàm lợng axit béo bão hoà không bão hoà hai chủng PQ6 PQ7 chiếm 52,46 46,13%; 51,80 41,38% hàm lợng tổng số axit béo, tơng ứng Trong đó, hai chủng PQ6 PQ7 có hàm lợng axit béo tổng số chiếm 90% tổng số lipit Đặc biệt chủng PQ6, bên cạnh DHA, phát thấy có mặt EPA AA, mặc dù, giá trị phần trăm chúng tổng số axit béo thấp nhiều so với hàm lợng DHA (bảng 2) Đây đặc điểm u việt chủng PQ6 thành phần axít béo không bão hoà (PUFAs), cung cấp dẫn liệu khoa học quan träng cho viƯc lùa chän chđng PQ6 ®Ĩ tiÕn hành nghiên cứu sâu đờng sinh tổng hợp PUFAs DHA, EPA đối tợng này, nh nuôi trồng chủng với quy mô lớn để thu sinh khối giầu axit béo không bão hoà đa nối đôi nêu làm thức ăn tơi sống nhân tạo cho nuôi trồng thuỷ sản làm thực phẩm chức cho ngời động vật nuôi Trên giới, nghiên cứu độc tính trờng diễn bán trờng diễn vi tảo giàu DHA Schizochytrium đợc tiến hành chuột 54 thỏ nhằm kiểm chứng tính an toàn nh tác dụng loại vi tảo biển trớc ng−êi sư dơng [1, 2] Tõ kÕt qu¶ chØ hai bảng 2, tính toán đợc hàm lợng DHA hai chủng PQ6 PQ7 1,57 1,48 g/l, tơng ứng So với loại vi tảo biển Labyrinthula Việt Nam vừa đợc công bố, chủng vi tảo Schizochytrium đợc phân lập huyện đảo Phú Quốc có khả sinh tổng hợp DHA với hàm lợng cao gấp khoảng 10 lần Nh vậy, chủng vi tảo biển dị dỡng thuộc chi Schizochytrium đối tợng tiềm có khả sinh tổng hợp DHA cao so với tất thể vi tảo vi sinh vËt hiƯn ë ViƯt Nam [5] NÕu so víi chđng Schizochytrium limacinum SR21 cđa NhËt B¶n [10, 11] - chủng đợc chọn nuôi trồng để thơng mại hóa sản phẩm DHA nay, đợc nuôi bình tam giác (tơng tự nh thí nghiệm chúng tôi) lại có TLK hàm lợng DHA cao 2,7 lần (tính lít), so với chủng PQ6 PQ7, tơng ứng Tuy nhiên, tính hàm lợng DHA giá trị TLK (gr) thu đợc chủng PQ6 PQ7 lại đạt 14,11% 13,12% TLK, tơng ứng, có giá trị cao so với chủng Schizochytrium limacinum SR21 nói (11,67%) Các số liệu đợc trình bày kết nghiên cứu bớc đầu hàm lợng DHA chủng vi tảo biển Schizochytrium sp PQ6 PQ7 đợc phân lập huyện đảo Phú Quốc môi trờng M1 chủng Việt Nam Ngoài ra, kết sơ thu đợc nuôi cấy chủng PQ6 hệ thống lên men lít cho thấy hàm lợng lipit tổng số DHA chủng tăng lên 2,3 lần, tơng ứng, so với số liệu thu đợc tiến hành thí nghiệm bình tam giác 250 ml vừa đợc nêu III KếT LUậN Từ kết thu đợc trên, rút số kết luận sau: Với quy trình phân lập có cải tiến cho phù hợp với điều kiện củaViệt Nam, lần đầu tiên, phân lập đợc Việt Nam loại vi tảo biển dị dỡng Schizochytrium giàu DHA từ đớc trôi dạt vùng rừng ngập mặn ven biển huyện đảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang Với hàm lợng DHA cao thu đợc từ hai chủng Schizochytrium sp PQ6 PQ7 phân lập 1,57 1,48 g/l, tơng ứng, môi trờng M1, cho thấy chủng vi tảo biển dị dỡng Schizochytrium đối tợng tiềm cần đợc tiếp tục nghiên cứu để nuôi trồng, thu sinh khối giàu PUFAs nh DHA làm thực phẩm chức cho ngời, làm thức ăn tơi sống nhân tạo cho động vật nuôi nuôi trồng thủy sản Việt Nam TàI LIệU THAM KHảO Hammond B G et al., 2001: Regulatory Toxicology and Pharmacology, 33: 192-204, 205-217, 356-362 Hammond B G et al., 2002: Regulatory Toxicology and Pharmacology, 35: 255-265 Honda D et al., 1998: Mycol Res., 102(4): 439 - 448 Honda D et al., 1999: J Eukaryot Microbiol., 46(6): 637-647 Hoàng Lan Anh cs., 2005: Tạp chí Công nghệ sinh học, 3(3): 1-7 Nguyễn Văn Mùi, 2001: Thực hành hóa sinh học Nxb Đại học Quốc gia Hµ Néi, 63-66 Porter D., 1990: Handbook of protoctista: 388 - 398 John and Bartlett, Boston Raghukumar S., 2002: Europ J Protistol., 38: 127-145 Sijtsma L and de Swaaf M E., 2004: Appl Microbiol Biotechnol., 64: 146-153 10 Xiao Qiu., 2003: Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids., 68: 181-186 11 Yokochi T et al., 1998: Appl Microbiol Biotechnol., 49: 72-79 SUCCESSFUL ISOLATION OF SCHIZOCHYTRIUM - A NEW HETEROTROPHIC MARINE MICROALGA CONTAINING HIGH POLYUNSATURATED FATTY ACID - DHA FROM PHUQUOC DISTRICT COASTS Dang Diem Hong, Hoang Lan Anh, ngo thi hoai thu SUMMARY Polyunsaturated fatty acids - PUFAs have known such as essential components of the cell membranes of various tissues and as precursors of the eicosanoids that are special importance in the brain and blood vessels, and are considered essential for pre - and post - natal brain and retinal development In PUFAs ω-3, docosahexaenoic acid (DHA) is absolutely necessary for normal development of the fetus and baby DHA has some positive effects on human diseases such as hypertension, arthritis, arteriosclerosis, depression and thrombosis… Therefore, DHA has contributed to many kind of worth product such as milk for pregnant woman and baby, drugs and functional food for human and animals In this paper, for the first time, we succeeded in isolating of Schizochytrium sp PQ6 and PQ7 - a new heterotrophic marine microalga, from Phu Quoc district coasts The growth rate, dry weight, concentration of total lipid and the component of PUFAs in M1 media were analyzed in both strains The DHA content of strains Schizochytrium sp PQ6 and PQ7 are about 1.57 and 1.48 g/l, respectively In comparison with other current marine microalgae in Vietnam, Schizochytrium sp PQ6 and PQ7 have the highest concentration of PUFAs, especially content of DHA That gives us new prospect for using these Schizochytrium as animal feed (e.g for rotifer, krills, shrimp’s larvae, etc.) and functional food for human Ngµy nhËn bµi: 4-1-2007 55 ... LUậN Phân lập vi tảo Schizochytrium Với 17 mẫu đớc có sống thu vùng rừng ngập mặn ven biển huyện đảo Phú Quốc, phát hiện, phân lập nuôi cấy ổn định điều kiện phòng thí nghiệm đợc chủng vi tảo Schizochytrium. .. trình phân lập có cải tiến cho phù hợp với điều kiện củaViệt Nam, lần đầu tiên, phân lập đợc Vi t Nam loại vi tảo biển dị dỡng Schizochytrium giàu DHA từ đớc trôi dạt vùng rừng ngập mặn ven biển huyện. .. DHA hai chủng PQ6 PQ7 1,57 1,48 g/l, tơng ứng So với loại vi tảo biển Labyrinthula Vi t Nam vừa đợc công bố, chủng vi tảo Schizochytrium đợc phân lập huyện đảo Phú Quốc có khả sinh tổng hợp DHA