Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa Asparaginase của Aspergillus Oryzae trong nấm men Pichia Pastoris :  Luận văn ThS. Sinh học : 60 42 01 07

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Dung NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ASPARAGINASE CỦA ASPERGILLUS ORYZAE TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Dung NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ASPARAGINASE CỦA ASPERGILLUS ORYZAE TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đỗ Thị Huyền TS Đinh Nho Thái Hà Nội – Năm 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Huyền trưởng phòng Kỹ thuật di truyền, GS TS Trương Nam Hải nguyên trưởng phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, ThS Nguyễn Thị Hương Trà, Viện Cơ điện nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch TS Đinh Nho Thái, Bộ môn Di truyền, khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội tận tình hướng dẫn, quan tâm tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Trong thời gian học tập nghiên cứu phịng Kỹ thuật Di truyền, tơi tập thể cán nghiên cứu phòng, đặc biệt ThS Nguyễn Thanh Ngọc, CN Lê Tùng Lâm bảo giúp đỡ nhiệt tình Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Tơi xin cảm ơn thầy giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội giảng dạy bảo cho kiến thức kỹ cần thiết Lời cuối cùng, xin chân thành cảm ơn cha mẹ, người thân gia đình tơi đồng nghiệp ủng hộ, tạo điều kiện chia sẻ khó khăn tơi thời gian qua Xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Dung MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ACRYLAMIDE TRONG THỰC PHẨM 1.1.1 Khả gây bệnh acrylamide 1.1.2 Cơ chế tạo acrylamide sản xuất bánh nƣớng 1.1.3 Hàm lƣợng acrylamide số thực phẩm 1.2 ASPARAGINASE 1.2.1 Asparaginase 1.2.2 Ứng dụng asparaginase để làm giảm acrylamide thực phẩm 1.2.3 Công nghệ sản xuất asparaginase 1.2.3.1 Sản xuất asparaginase từ chủng E coli tái tổ hợp 1.2.3.2 Sản xuất asparaginase từ chủng đƣợc chứng nhận an toàn (chủng GRAS) tái tổ hợp .10 1.3 HỆ BIỂU HIỆN TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS 12 1.3.1 Những đặc điểm chung hệ biểu nấm men 12 1.3.2 Những ƣu điểm hệ biểu nấm men 13 1.3.3 Hệ biểu P pastoris 14 1.3.3.1 Promoter AOX1 14 1.3.3.2 Chủng biểu 15 1.3.3.3 Vector biểu gen 17 1.3.3.4 Tích hợp gen ngoại lai vào hệ gen P pastoris 18 1.3.4 Quá trình tiết protein ngoại bào P pastoris 19 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 VẬT LIỆU 21 2.1.1 Chủng vi sinh vật plasmid 21 2.1.2 Hóa chất, enzyme, máy móc thiết bị 21 2.1.3 Dung dịch môi trƣờng sử dụng 22 2.1.3.1 Môi trƣờng dung dịch sử dụng để biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli DH10b 22 2.1.3.2 Dung dịch đƣợc sử dụng để tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli 22 2.1.3.3 Dung dịch đƣợc sử dụng điện di DNA gel agarose 23 2.1.3.4 Môi trƣờng biến nạp biểu gen ngoại lai tế bào nấm men P pastoris 23 2.1.3.5 Dung dịch sử dụng điện SDS-PAGE 23 2.1.3.6 Dung dịch sử dụng nhuộm bạc 24 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Nghiên cứu phân tích cải biến trình tự gen công cụ tin sinh 24 2.2.2 Phƣơng pháp PCR 25 2.2.3 Điện di DNA gel agarose 26 2.2.4 Quy trình biến nạp sốc nhiệt 27 2.2.5 Quy trình tách DNA plasmid 28 2.2.6 Kiểm tra DNA thu đƣợc enzyme hạn chế 29 2.2.7 Tinh DNA plasmid để gửi giải trình tự cột Qiagen 29 2.2.8 Phản ứng nối ghép gen 30 2.2.9 Biến nạp DNA vào tế bào nấm men phƣơng pháp xung điện 30 2.2.10 Lên men chủng P Pastoris 31 2.2.11 Điện di SDS – PAGE 31 2.2.12 Thử hoạt tính asparaginase phƣơng pháp điện di khơng biến tính thử hoạt tính đặt gel đĩa thạch 32 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 CẢI BIẾN TRÌNH TỰ GEN ASPARAGINASE CỦA A ORYZAE 3.1.1 Lựa chọn vùng gen thích hợp để biểu asparaginase tái tổ hợp 36 3.1.2 Cải biến sơ gen asparaginse 37 3.1.3 Đánh giá số phù hợp mã ba gen asp1 chủng biểu 41 3.1.4 Thiết kế vùng gen để biểu asp1 P pastoris 42 3.2 NHÂN DÒNG GEN ASP1 .43 3.2.1 Kiểm tra dòng plasmid tái tổ hợp enzyme hạn chế 44 3.2.2 Giải trình tự gen asp1 45 3.3 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN pPIC-ASP1 .45 3.3.1 Ghép nối gen asp1 vào vector biểu pPIC9 45 3.3.2 Kiểm tra gen asp1 plasmid tái tổ hợp pPIC-asp1 PCR 47 3.3.3 Tách lƣợng lớn vector biểu tái tổ hợp mang gen asp1 48 3.4 TẠO CHỦNG NẤM MEN P PASTORIS MANG ASP1 49 3.5 BIỂU HIỆN PROTEIN ASP1 TRONG NẤM MEN P PASTORIS SMD1168 TRONG BÌNH TAM GIÁC 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ Hình Sơ đồ minh họa hình thành acrylamide chế biến thực phẩm Hình Sơ đồ minh họa chế phản ứng L-asparaginase Hình Bản đồ vector biểu pPIC9 ngoại lai nấm men P pastoris 18 Hình Sự tích hợp vector biểu vào hệ gen P pastoris locus his4 .19 Hình Sơ đồ tóm tắt q trình thiết kế vector biểu để biểu gen asp1 tế bào nấm men P pastoris SMD1168 35 Hình Đồ thị dự đốn có mặt, vị trí điểm cắt tín hiệu tiết có asparaginase A oryzae 36 Hình Trình tự đoạn gen asp đƣợc sử dụng để cải biến biểu nấm men P pastoris 37 Hình Biểu đồ phân bố tần số sử dụng codon dọc theo chiều dài gen asp định biểu P pastoris (A) Biểu đồ mức độ phù hợp mã asp so với mã chủng biểu P pastoris (B) 38 Hình Đồ thị so sánh tần suất sử dụng codon hai chủng A oryzae (đỏ) P pastoris (đen) 39 Hình 10 So sánh trình tự protein đƣợc dịch mã từ gen asp asp1 40 Hình 11 So sánh trình tự gen asp1 đƣợc cải biến trình tự gen asp chƣa cải biến 41 Hình 12 Biểu đồ phân bố tần số sử dụng codon dọc theo chiều dài gen asp1 định biểu P pastoris (A) Biểu đồ phần trăm phù hợp mã gen asp1 đƣợc biểu chủng biểu P pastoris (B) 41 Hình 13 Trình tự gen asp1 cần đặt có chứa thêm trình tự mã hóa cho vị trí cắt tín hiệu tiết nấm men (trình tự đƣợc gạch chân), vị trí cắt enzyme giới hạn XhoI, NotI (đƣợc tô đậm) .42 Hình 14 Phân tích dịng plasmid pUC-asp1 gel điện di agarose 1% 44 Hình 15 Phân tích sản phẩm cắt plasmid pUC-asp1 cặp enzyme XhoI NotI gel agarose 1% 45 Hình 16 Sơ đồ vector pPIC9 (trái) ảnh điện (phải) kết cắt pPIC9 NotI (đƣờng chạy 1) XhoI ( đƣờng chạy 2) 46 Hinh 17 Phân tích gen asp1, pPIC9 sau đƣợc cắt cặp enzyme NcoI+XhoI đƣợc tinh chế gel agarose 1% 47 Hình 18 Ảnh điện di kết PCR kiểm tra có mặt gen asp1 vector pPIC9 cặp mồi AOX1 48 Hình 19 Phân tích plasmid pPIC-asp1 sản phẩm cắt kiểm tra pPIC-asp1 NotI XhoI gel điện di agarose 1% 49 Hình 20 Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra pPUC-asp1 StuI 50 Hình 21 Sản phẩm biến nạp pPIC-asp1 vào nấm men P pastoris 50 Hình 22 Phân tích sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc chủng tái tổ hợp P pastoris SMD1168 mang gen asp1 với cặp mồi AOX1 51 Hình 23 Đƣờng cong sinh trƣởng chủng P pastoris tái tổ hợp theo thời gian 53 Hình 24 Phân tích protein ngoại bào từ dịch nuôi cấy chủng nấm men tái tổ hợp thời điểm khác gel polyacrylamide 12,6% 54 Hình 25 A: Gel khơng biến tính nhuộm Commassie; B: Xác định hoạt tính ASP gel thẩm thấu gel điện di không biến tính xuống đĩa thạch có 1% asparagine .55 Bảng Một số chủng P pastoris phổ biến đƣợc sử dụng để biểu protein tái tổ hợp 16 Bảng Khả sinh trƣởng dòng nấm men tái tổ hợp đƣợc giám sát thông qua OD600 theo thời gian lên men 52 BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribonucleic AOX Alcohol oxidase APS Ammonium persulfate ARN Axit ribonucleic ASP Asparaginase Amp Ampicillin BMGY Buffered Minimal Glycerol Yeast BMMY Buffered Minimal Methanol Yeast bp Base pair dNTP 2’- deoxyribonucleotide 5’ – triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid ETBr Ethidium bromide E coli Escherichia coli GRAS Generally Recognized as Safe kb Kilobase kDa Kilo Dalton LB Luria-Bertani MCS Multiple cloning site ( vị trí đa nối) MD Minimal Dextrose mARN Messenger RNA (ARN thông tin) P pastoris Pichia pastoris PCR Polymerase Chain Reaction ( phản ứng chuỗi trùng hợp) SDS Sodium dodecyl sunfat TAE Tris-acetate-EDTA TE Tris-EDTA MỞ ĐẦU Hiện tỷ lệ ngƣời mắc bệnh ung thƣ ngày tăng Một yếu tố dẫn đến bệnh ung thƣ chế độ ăn uống Những thực phẩm chứa nhiều mỡ, ƣớp muối, hun khói đƣợc coi thực phẩm dẫn đến bệnh chết ngƣời Tuy vậy, ngƣời dân nhận thức đƣợc thực phẩm tƣởng chừng vô hại nhƣ loại bánh nƣớng lại chứa acrylamide, chất có khả gây ung thƣ Năm 2002 nhà khoa học Thụy Điển tìm chất sản phẩm thực phẩm nhƣ khoai tây chiên, bánh mỳ, bánh quy, ngũ cốc [10] Acrylamide hình thành thực phẩm giàu tinh bột đƣợc chiên rán nhiệt độ 120oC Nguyên nhân nhiệt độ cao, asparagine bột làm bánh phản ứng với đƣờng khử tạo thành hợp chất có màu vàng nâu chứa acrylamide [29] Các nhà khoa học giới làm sáng tỏ sở khoa học việc sử dụng asparaginase để làm giảm lƣợng acrylamide thực phẩm giàu tinh bột nhờ việc loại bỏ asparagine Enzyme asparaginase xúc tác thủy phân asparagine thành axit aspartic ammonia, không cho asparagine tham gia phản ứng Maillard để hình thành acrylamide [8] Trên giới hãng Novozymes A/S Denmark sản xuất thƣơng mại hóa thành cơng asparaginase tái tổ hợp từ chủng nấm sợi A oryzae ứng dụng công nghiệp thực phẩm với tên thƣơng mại Acrylaway®L (2007) [24] Trong dƣợc phẩm asparaginase đƣợc sử dụng điều trị bệnh ung thƣ máu với tên thƣơng mại Elspar [11] Hiện giá thành asparaginase thị trƣờng cao nên việc ứng dụng enzyme để làm giảm acrylamide trình chế biến thực phẩm chiên nƣớng Việt Nam hạn chế Với mong muốn tạo chủng sản xuất asparaginase tái tổ hợp giống với asparaginase thƣơng mại để sử dụng nƣớc, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu biểu gen mã hóa asparaginase Aspergillus oryzae nấm men Pichia pastoris” Nấm men P pastoris hệ thống biểu protein ngoại lai đƣợc nhà khoa học sử dụng rộng rãi đặc tính ƣu việt chủng an tồn sinh học, pPIC-asp1 pPIC9 pPIC-asp1 M kb 10 8,0 kb 3,0 1,1 kb A 1,0 B Hình 19 Phân tích plasmid pPIC-asp1 sản phẩm cắt kiểm tra pPIC-asp1 NotI XhoI gel điện di agarose 1% 3.4 TẠO CHỦNG NẤM MEN P PASTORIS MANG ASP1 Để biểu gen, sử dụng chủng nấm men P pastoris SMD1168 Chủng bị đột biến gen pep4 gen mã hóa cho carboxypeptidase A cần thiết cho kích hoạt protease khác nên có ƣu điểm lớn việc hạn chế protein ngoại lai bị cắt (pep4-) Đồng thời chủng có chứa his4 mã hóa protein histidinol dehydrogenase bị gây đột biến nên chủng phát triển mơi trƣờng có bổ sung histidine (His-) Đây thị nhận biết chủng chứa vector biểu sau biến nạp vector biểu chứa gen his4 bình thƣờng Hơn nữa, chủng có kiểu hình Mut+ mang gen aox1, aox2 đáp ứng đƣợc enzyme alcohol oxidase cho tế bào chuyển hóa methanol tốt cho chủng sinh trƣởng tổng hợp protein ngoại lai Để tích hợp pPIC-asp1 vào hệ gen nấm men P pastoris SMD1168, enzyme hạn chế StuI (vị trí nhận biết gen his4) đƣợc sử dụng để cắt mở vòng pPIC-asp1 cho băng DNA có kích thƣớc khoảng 9,1 kb tổng kích thƣớc pPIC9 (8,0 kb) cộng với gen asp1 (1,1 kb) Sản phẩm cắt đƣợc kiểm tra gel agarose 49 0,8% đƣợc tinh chế kit Qiagen (Hình 20) pPIC-asp1 mở vịng đƣợc tích hợp vào locus HIS4 hệ gen tế bào nấm men P pastoris SMD 1168 Các thể biến nạp sau đƣợc ủ mơi trƣờng MD (khuyết dƣỡng histidin) ngày 28oC Kết dòng nấm men mọc màu trắng tách biệt với (Hình 21) Những khuẩn lạc mọc mơi trƣờng MD chứng tỏ chúng có khả tổng hợp histidine, nhƣ biến nạp thành công vector PIC-asp1 vào tế bào nấm men P pastoris pPIC-asp1 M 9,1 kb kb 10 3,0 1,0 Hình 20 Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra pPUC-asp1 StuI Hình 21 Sản phẩm biến nạp pPIC-asp1 vào nấm men P pastoris Theo nguyên lý plasmid đƣợc chuyển vào tế bào xảy sáp nhập vào gen tế bào nấm men theo hai phƣơng thức: chèn gen thay gen Do chiến lƣợc sử dụng hƣớng đến phƣơng thức tái tổ hợp tƣơng đồng vị trí promoter 50 AOX1 nên đa phần thể biến nạp có chèn gen [5] Khi đƣợc mở vòng StuI, plasmid pPIC–asp1 đƣợc định hƣớng trao đổi chéo cài toàn cấu trúc biểu gen ngoại lai vào vùng gen his4 hệ gen Vì thế, cấu trúc gen AOX1 hệ gen đƣợc bảo toàn để sản xuất enzyme alcohol oxidase chuyển hóa nguồn methanol nhƣ nguồn carbon cho nấm men sinh trƣởng Đây kiểu hình Mut+ chủng tái tổ hợp đƣợc ƣu tiên lựa chọn methanol vừa đƣợc sử dụng làm chất cảm ứng sinh tổng hợp protein ngoại lai vừa nguồn carbon để chủng sinh trƣởng tốt [6] Tuy nhiên tái tổ hợp thay gen vậy, sau biến nạp tạo plasmid pPIC–asp1 vào chủng nấm men P pastoris, tiến hành kiểm tra sàng lọc kiểu hình Mut+ chủng tái tổ hợp PCR sử dụng cặp mồi AOX1 (Invitrogen) Kết (Hình 22) cho thấy sản phẩm PCR từ chủng tái tổ hợp mang hai gen đƣợc khuếch đại: (1) gen AOX1 genome nấm men (kích thƣớc 2,2 kb); (2) cấu trúc mang gen asp1 vector (kích thƣớc 1,6 kb kích thƣớc gen ngoại lai 1,1 kb đoạn gen AOX1 vector pPIC9 có kích thƣớc 0,5 kb) Nhƣ vậy, chủng tái tổ hợp đƣợc lựa chọn có kiểu hình Mus+ M kb 10 3,0 2,2 kb 2,0 1,6 kb 1,5 1000 1,0 0,75 Hình 22 Phân tích sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc chủng tái tổ hợp P pastoris SMD1168 mang gen asp1 với cặp mồi AOX1 1- 4: Sản phẩm PCR từ bốn chủng tái tổ hợp khác M: Thang DNA chuẩn 51 3.5 BIỂU HIỆN PROTEIN ASP1 TRONG NẤM MEN P PASTORIS SMD1168 TRONG BÌNH TAM GIÁC Các chủng nấm men P pastoris SMD1168 mang plasmid pPIC9 (dùng làm đối chứng âm) P pastoris SMD1168 mang gen asp1 đƣợc nuôi cấy song song đƣợc cảm ứng methanol 0,5% 72 Methanol đƣợc P pastoris sử dụng nhƣ hợp chất có carbon, bổ sung nguồn carbon vào mơi trƣờng [13] Dịch nuôi cấy đƣợc thu lại sau ly tâm loại bỏ tế bào Để theo dõi trình sinh trƣởng chủng nấm men tái tổ hợp xem việc chứa nhiều của vector gen có làm ảnh hƣởng tới sức sống thể biến nạp hay không tiến hành đo phổ hấp phụ dịch nuôi cấy bƣớc sóng 600nm Bảng Khả sinh trƣởng dòng nấm men tái tổ hợp đƣợc giám sát thông qua OD600 theo thời gian lên men pPIC9: chủng P pastoris mang vector pPIC9 Mẫu giờ 12 24 48 72 Dòng 1 8,77 37,35 54,23 63,07 75,73 Dòng 8,43 40,08 56,6 66,83 82,93 Dòng 8,16 39,2 55,8 66,43 77,1 Dòng 7,94 39,42 58,8 73,33 114,7 pPIC9 8,48 37,48 56,1 66,37 76,27 Nhìn vào hình 23 bảng dễ dàng nhận thấy đƣờng cong sinh trƣởng dòng nấm men mang gen asp1 giống Cả chủng đối chứng mang plasmid pPIC9 chủng có mang gen đƣờng cong sinh trƣởng tƣơng đối giống Nhƣ vậy, kết luận gen asp1 khơng ảnh hƣởng tới trình sinh trƣởng chủng P pastoris tái tổ hợp Theo nghiên cứu Vƣơng Quốc Khánh cộng cho thấy khả tăng trƣởng thể biến nạp không bị 52 giảm sức sống tƣợng sát nhập gen gây [4] Trong khoảng thời gian thu mẫu đến 24 sau cảm ứng, giá trị OD600 đo đƣợc dịng tế bào xấp xỉ nhau, khơng nhận thấy khác biệt dòng tế bào Bắt đầu từ thời điểm 48 dòng số phát triển mạnh đạt OD600 73,33 chủng lại xấp xỉ quanh giá trị OD600 = 66 Đến thời điểm 72 giờ, dòng tế bào số phát triển mạnh đạt giá trị OD600 114,7, dòng số với giá trị OD600 = 82,92, dòng số 1, 3, đối chứng âm lần lƣợt 75,73, 77,1, 76,27 Hình 23 Đƣờng cong sinh trƣởng chủng P pastoris tái tổ hợp theo thời gian Picasp1: chủng P pastoris mang gen asp1; pPIC9: chủng P pastoris mang vector pPIC9 Nhƣ vậy, dòng tế bào số cho thấy phát triển ổn định mạnh Để chắn protein ngoại lai đƣợc biểu hiện, mẫu dịch tiết ngoại bào dòng số thu đƣợc thời điểm ni cấy đƣợc xử lý biến tính điện di gel polyacrylamide nồng độ 12,6% Chúng sử dụng phƣơng pháp nhuộm bạc sau điện di mẫu gel polyacrylamide 12,6%, phƣơng pháp có độ nhạy cao nhiều phƣơng pháp nhuộm coomassie Kết điện di (Hình 24) cho thấy ASP1 đƣợc tổng hợp có kích 50 kDa thời điểm 21, 37, 46, 54, 72 nuôi cấy Protein tái tổ hợp có xu hƣớng đậm dần lên theo thời gian nuôi cấy từ 21 54 không tăng thêm 53 4h Theo tính tốn lý thuyết, asp1 đƣợc tổng hợp khơng bị glycosyl hóa có kích thƣớc khoảng 40 kDa Tuy nhiên nấm men P pastoris mang gen asp1 lại tổng hợp protein có kích thƣớc 50 kDa tạo thành băng protein sát điện di Rất enzyme bị glycosyl hóa mức khác Các nghiên cứu trƣớc ASP1 có khả bị protease phân cắt số vị trí, điển hình vị trí amino acid 35, 40 bị glycosyl hóa mạnh [24] Vì thế, nguyên nhân làm cho ASP1 đƣợc tổng hợp có kích thƣớc khác Qua ƣớc đốn phần mềm phân tích protein Expasy, trình tự ASP1 có vị trí N-glycosyl hóa (vị trí NVTY,14 NFTQ, 19 NTTL, 24 NVTI, 231 NITS, 249 NDTL) Glycosyl hoá thay đổi hậu dịch mã phổ biến đƣợc thực P pastoris Tuy nhiên, dạng O-glycosyl hóa xảy P pastoris Tƣơng tự nhƣ asparaginase A niger, trình tự enzyme có cấu trúc bậc gồm 361 amino acid, với kích thƣớc ƣớc đốn khoảng 40 kDa Tuy nhiên, enzyme bị glycosyl hóa làm tăng kích thƣớc enzyme lên 50 kDa [47] 21 37 46 72 54  ASP1 ASP1  ASP1  ASP1  ASP1 M kDa 66,2 45,0 35,5 22,5 Hình 24 Phân tích protein ngoại bào từ dịch nuôi cấy chủng nấm men tái tổ hợp thời điểm khác gel polyacrylamide 12,6% (-): Mẫu protein chủng đối chứng P pastoris SMD1168 mang plasmid pPIC9 ASP1: Mẫu protein chủng P pastoris SMD1168 mang plasmid pPIC9-asp1 M: Thang protein chuẩn 54 Để khẳng định protein có kích thƣớc 50 kDa ASP1 tái tổ hợp, tiến hành điện di khơng biến tính với mẫu protein ngoại bào thu đƣợc thời điểm 37, 46 54 Kết cho thấy, mơi trƣờng khơng có chất biến tính, ASP1 tồn dƣới dạng dimer có kích thƣớc khoảng 100 kDa (Hình 25A) có hoạt tính thủy phân chất asparagine thành NH3 làm đổi màu phenol đỏ thành vàng mơi trƣờng có chất (Hình 25B) Phenol đỏ chất thị pH thƣờng dùng phòng sinh học phân tử tế bào, gặp mơi trƣờng có pH lớn 8,2 chuyển sang màu hồng đậm với môi trƣờng có pH nhỏ 6,8 chuyển sang màu vàng, khoảng 6,8 đến 8,2 có màu cam Phản ứng chất enzyme asparaginase với chất asparagine tạo sản phẩm acid aspatic ammomium Sau phản ứng ammonium bay hết, để lại đĩa thạch acid aspatic xuất băng màu vàng nhạt, sau ủ 20 phút nhiệt độ 37oC Nhƣ qua thí nghiệm chứng minh đƣợc chủng biểu đƣợc enzyme asparaginase có hoạt tính, xác định đƣợc xác băng asparaginase điện di Nhƣ gen asp1 đƣợc biểu thành công tế bào nấm men P pastoris 37  ASP1 54 46 ASP1 M ASP1 37  ASP1 54 46  ASP M kDa ASP1 116 66,0 45,0 35,0 A B Hình 25 A: Gel khơng biến tính nhuộm Commassie; B: Xác định hoạt tính ASP gel thẩm thấu gel điện di khơng biến tính xuống đĩa thạch có 1% asparagine 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Với kết thu đƣợc trình thực đề tài, rút số kết luận sau: - Gen asp1 mã hóa cho enzym asparaginase Aspergillus oryaze đƣợc cải biến 13 mã ba có tần số sử dụng thấp dƣới 20% chủng nấm men P pastoris đƣợc thay codon đồng nghĩa có tần xuất sử dụng cao làm tăng số CIA từ 0,58 lên 0,63 - Vector biểu pPIC9 mang gen asp1 đƣợc thiết kế thành cơng - Đã chọn đƣợc dịng nấm men tái tổ hợp P pastoris mang gen asp1 có kiểu hình Mut+ dùng cho biểu gen - Enzyme aspraginase đƣợc biểu thành công dƣới dạng glycosyl hóa, đƣợc tiết mơi trƣờng ni cấy có hoạt tính sinh học II KIẾN NGHỊ - Nâng cao sản lƣợng asparaginase ngoại bào việc thay đổi mơi trƣờng lên men qui trình lên men - Nghiên cứu thu hồi enzyme để dùng cho thử nghiệm làm giảm acrylamide tạo thành số sản phẩm bánh nƣớng 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thị Trung (2002), Phân lập biểu gen mã hóa β- Amylase đậu tương nấm men Pichia pastoris, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Phạm Thùy Linh, Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Đỗ Thị Huyền, Trần Ngọc Tân, Nguyễn Thị Thanh Nhành, Lê Văn Trƣờng, Phạm Văn Ty, Trƣơng Nam Hải (2010), “Ghép nối biểu gen mã hóa enterocin P vi khuẩn Enterococcus faecium Pichia pastoris X33”, Tạp Chí Cơng Nghệ Sinh Học 8, tr 221–226 Võ Viết Cƣờng, Lê Thị Huệ, Đỗ Thị Huyền, Lê Quỳnh Giang, Nguyễn Thị Quý, Trƣơng Nam Hải (2013), “Biểu gen HA5.1 đƣợc cải biến mã có hoạt tính sinh học nấm men Pichis pastoris X33”,Tạp Chí Sinh Học 35, tr 255–264 Vƣơng Cát Khánh, Ngô Thị Huyền Trang, Nguyễn Phạm Phƣơng Thanh, Đặng Thị Phƣơng Thảo, Trần Linh Thƣớc (2014), “Nghiên cứu cấu trúc sàng lọc dòng nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp đa biểu nhân tố tăng trƣởng từ tiểu cầu (BB-PDGF-BB) mức độ cao”, Tạp Chí Sinh Học 36, tr 77-83 Phạm Thị Kim Liên, Đặng Tất Trƣờng, Trần Văn Hiếu (2013), “Tạo dòng biểu nhân tố kích thích tạo dịng bạch cầu – đại thực bào HGM-CSF tái tổ hợp hệ thống Pichia pastoris”, Tạp Chí Phát Triển KH&CN, 3, tr 22-29 Nguyễn Thanh Ngọc, Lê Tùng Lâm, Nguyễn Thị Dung, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Thị Hƣơng Trà, Trƣơng Nam Hải (2014), “Nghiên cứu biểu gen mã hóa Asparaginase Aspergillus oryzae nấm men Pichia pastoris” Tạp Chí Sinh Học, 36, TCSH14-013 Đỗ Thị Hồng (2005), Nghiên cứu biểu vùng gen preM-env virus Dengue typ nấm men Pichia pastoris, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 57 Tài liệu tiếng Anh Anese, M., Quarta, B., and Frias, J (2011), “Modelling the effect of asparaginase in reducing acrylamide formation in biscuits”, Food Chem, 126, pp 435–440 Archer, A.H.S and D.L (2013), “Acrylamide in Foods: A Review and Update”, University of Florida, 4, pp 1-4 10 Budolfsen, G., Jensen, M.T., Heldt-Hansen, H.P., Stringer, M.A., and Lange, L (2004), Method of preparing a heat-treated product, United States Patent 8859023 11 Bunpo, P., Murray, B., Cundiff, J., Brizius, E., Aldrich, C.J., and Anthony, T.G (2008), “Alanyl-glutamine consumption modifies the suppressive effect of Lasparaginase on lymphocyte populations in mice”, J Nutr, 138, pp 338–343 12 Campbell, H.A., Mashburn, L.T., Boyse, E.A., and Old, L.J (1967), “Two LAsparaginases from Escherichia coli B Their Separation, Purification, and Antitumor Activity”, Biochemistry (Mosc), 6, pp.721–730 13 Cereghino, J.L., and Cregg, J.M (2000b), “Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris”, FEMS Microbiol Rev, 24, pp 45–66 14 Choi, J.H., and Lee, S.Y (2004), “Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli”, Appl Microbiol Biotechnol, 64, pp 625–635 15 Clare, J.J., Romanes, M.A., Rayment, F.B., Rowedder, J.E., Smith, M.A., Payne, M.M., Sreekrishna, K., and Henwood, C.A (1991), “Production of mouse epidermal growth factor in yeast: high-level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies”, Gene, 105, pp 205–212 16 Claus, A., Carle, R., and Schieber, A (2008), “Acrylamide in cereal products: A review”, Journal Cereal Science, 47, pp 118–133 17 Cregg, J.M., Madden, K.R., Barringer, K.J., Thill, G.P., and Stillman, C.A (1989), “Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris”, Mol Cell Biol, 9, pp 1316–1323 58 18 DeJong, P.J (1972), “L-Asparaginase Production by Streptomyces griseus” Appl Microbiol, 23, pp 1163–1164 19 Dunlop, P.C., Meyer, G.M., Ban, D., and Roon, R.J (1978), “Characterization of two forms of asparaginase in Saccharomyces cerevisiae”, J Biol Chem, 253, pp 1297–1304 20 El-Bessoumy, A.A., Sarhan, M., and Mansour, J (2004), “Production, isolation, and purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation”, J Biochem Mol Biol, 37, pp 387–393 21 Gellissen, G (2000), “Heterologous protein production in methylotrophic yeasts”, Appl Microbiol Biotechnol, 54, pp 741–750 22 Gulati, R., Saxena, R.K., and Gupta, R (1997), “A rapid plate assay for screening l-asparaginase producing micro-organisms”, Lett Appl Microbiol, 24, pp 23–26 23 Harms, E., Wehner, A., Jennings, M.P., Pugh, K.J., Beacham, I.R., and Röhm, K.H (1991), “Construction of expression systems for Escherichia coli asparaginase II and two-step purification of the recombinant enzyme from periplasmic extracts”, Protein Expr Purif, 2, pp 144–150 24 Hendriksen, H.V., Kornbrust, B.A., Østergaard, P.R., and Stringer, M.A (2009), “Evaluating the Potential for Enzymatic Acrylamide Mitigation in a Range of Food Products Using an Asparaginase from Aspergillus oryzae”, J Agric Food Chem, 57, pp 4168–4176 25 Jahic, M., Veide, A., Charoenrat, T., Teeri, T., and Enfors, S.-O (2006), “Process technology for production and recovery of heterologous proteins with Pichia pastoris”, Biotechnol Prog, 22, pp 1465–1473 26 Jones, G.E (1977) “Genetics of Expression of Asparaginase II Activity in Saccharomyces cerevisiae”, J Bacteriol, 129, pp 1165–1167 59 27 Khushoo, A., Pal, Y., and Mukherjee, K.J (2005), “Optimization of extracellular production of recombinant asparaginase in Escherichia coli in shakeflask and bioreactor”, Appl Microbiol Biotechnol, 68, pp 189–197 28 Kukurová, K., Morales, F.J., Bednáriková, A., and Ciesarová, Z (2009), “Effect of L-asparaginase on acrylamide mitigation in a fried-dough pastry model”, Mol Nutr Food Res, 53, pp 1532–1539 29 Lineback, D.R., Coughlin, J.R., and Stadler, R.H (2012), “Acrylamide in foods: a review of the science and future considerations”, Annu Rev Food Sci Technol, 3, pp 15–35 30 Lingnert, H., Grivas, S., (2002), “Acrylamide in food: mechanisms of formation and influencing factors during heating of foods”, Scand J Nutr, 46, pp 159–172 31 Maria Antonieta Ferrara, N.M.B.S (2006), “Asparaginase production by a recombinant Pichia pastoris strain harbouring Saccharomyces cerevisiae ASP3 gene”, Enzyme Microb Technol, pp 1457–1463 32 Mucci, L.A., Dickman, P.W., Steineck, G., Adami, H.-O., and Augustsson, K (2003), “Dietary acrylamide and cancer of the large bowel, kidney, and bladder: absence of an association in a population-based study in Sweden”, Br J Cancer, 88, pp 84–89 33 Peterson, R.E., and Ciegler, A (1969), “L-Asparaginase Production by Various Bacteria”, Appl Microbiol, 17, pp 929–930 34 Roberts, J., Burson, G., and Hill, J.M (1968), “New Procedures for Purification of l-Asparaginase with High Yield from Escherichia coli”, J Bacteriol, 95, pp 2117–2123 35 Romanos, M.A., Scorer, C.A., and Clare, J.J (1992), “Foreign gene expression in yeast: a review”, Yeast Chichester Engl, 8, pp 423–488 36 Sarquis, M.I de M., Oliveira, E.M.M., Santos, A.S., and Costa, G.L da (2004), “Production of L-asparaginase by filamentous fungi”, Mem Inst Oswaldo Cruz, 99, pp 489–492 60 37 Soniyamby Ambi Rani, L.S.P.B.V (2012), “Isolation and screening of LAsparaginase producing fungi from soil samples”, Int J Pharm Sci, 4, pp 279– 282 38 Sumner, S.C., MacNeela, J.P., and Fennell, T.R (1992), “Characterization and quantitation of urinary metabolites of acrylamide in rats and mice using 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy”, Chem Res Toxicol, 5, pp 81–89 39 Swain, A.L., Jaskólski, M., Housset, D., Rao, J.K., and Wlodawer, A (1993), “Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy”, Proc Natl Acad Sci U S A, 90, pp 1474–1478 40 Zhang, W., Inan, M., and Meagher, M.M (2000), “Fermentation strategies for recombinant protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris”, Biotechnol Bioprocess Eng, 5, pp 275–287 41 Zyzak, D.V., Sanders, R.A., Stojanovic, M., Tallmadge, D.H., Eberhart, B.L., Ewald, D.K., Gruber, D.C., Morsch, T.R., Strothers, M.A., Rizzi, G.P., et al (2003), “Acrylamide Formation Mechanism in Heated Foods”, J Agric Food Chem, 51, pp 4782–4787 42 DSM Food Specialties (2006), GRAS Notification for Asparaginase from A Gentically Modified Strain of Aspergillus niger 43 Catalog no, K1710-01 Manual Pichia Expression Kit 44 Invitrogen, Pichia expression kit, “A manual of methods for expression of recombinant proteins in Pichia pastoris”, Version M: 011102: 25-0043, Catolog no K1710-01 45 Tokmakov, A.A., Kurotani, A., Takagi, T., Toyama, M., Shirouzu, M., Fukami, Y., and Yokoyama, S (2012), “Multiple post-translational modifications bear upon heterologous protein synthesis”, J Biol Chem, jbc.M112.366351 46 Hou, J., Tyo, K., Liu, Z., Petranovic, D., and Nielsen, J (2012), “Engineering of vesicle trafficking improves heterologous protein secretion in Saccharomyces cerevisiae”, Metab Eng, 14, pp 120–127 61 47 DSM 2012, GRAS notification for an asparaginase from a genetically modified strain of Aspergillus niger 48 Lin-Cereghino, G.P., Stark, C.M., Kim, D., Chang, J., Shaheen, N., Poerwanto, H., Agari, K., Moua, P., Low, L.K., Tran, N., et al (2013), “The Effect of ?-Mating Factor Secretion Signal Mutations on Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris”, Gene 519, pp 311–317 49 Daly R., Hearn M T W., 2005, “Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production” J Mol Recognit JMR, 18, pp 119-138 50 Jia M., Xu M., He B., Rao Z., 2013, “Cloning, expression, and characterization of L-asparaginase from a newly isolated Bacillus subtilis B11-06”, J Agric Food Chem, 61, pp 9428-9434 51 Kotzia G A., Labrou N E., 2007, “L-asparaginase from Erwinia chrysanthemi 3937: Cloning, expression and characterization”, J Biotechnol, 127, pp 657-669 52 Oza V P., Parmar P P., Patel D H., Subramanian R B., 2011, “Cloning, expression and characterization of L-asparaginase from Withania somnifera L for large scale production”, Biotech, 1, pp 21-26 53 Ferrara M A., Severino N M B., Mansure J J., Martins A S., Oliveira E M M., Siani A C., Pereira Jr N., Torres F A G., Bon E P S., 2006, “Asparaginase production by a recombinant Pichia pastoris strain harbouring Saccharomyces cerevisiae ASP3 gene”, Enzyme Microb Technol, 39, pp.1457-1463 54 Meeting J F E C on F A., Organization, W H 2007, “Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants: Sixty-eighth Report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives”, World Health Organization 55 Novel asparaginase enzyme, 2011, WO 2011134916 A1 56 Sambrook, J and Green, M R (1996) “Molecular cloning: A laboratory manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press 62 57 Sue Macauley-Patrick, * Mariana L Fazenda, Brian McNeil and Linda M Harvey (2005) “Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system” Yeast 22, pp 249–270 58 Hiller, K., Grote, A., Scheer, M., Münch, R., and Jahn, D (2004) PrediSi: prediction of signal peptides and their cleavage positions Nucleic Acids Res 32, W375–W379 Trang Web 61 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 62 http://primerdigital.com/fastpcr.html 63 http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_analysis 63