Nghiên cứu phân lập và khảo sát hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của các hợp chất thứ cấp từ ba chủng xạ khuẩn streptomyces g246, g261, g248 thu thập tại vùng biển miền trung việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - CAO ĐỨC DANH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG SINH, GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ BA CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES G246, G261, G248 THU THẬP TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG - VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CAO ĐỨC DANH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG SINH, GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ BA CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES G246, G261, G248 THU THẬP TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG - VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa Hữu Mã số: 44 01 14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Habil Phạm Văn Cƣờng TS Trần Đăng Thạch Hà Nội - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan, cơng trình nghiên cứu tơi thực hướng dẫn khoa học PGS TS Habil Phạm Văn Cường TS Trần Đăng Thạch Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, số kết lần công bố tạp chí khoa học chun ngành có uy tín với đồng ý cho phép đồng tác giả Tồn thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc xuất xứ Nghiên cứu sinh Cao Đức Danh LỜI CẢM ƠN Luận án hồn thành Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Kinh phí thực từ đề tài thuộc đề tài VAST.TĐ.DLB.04/16-18 VAST ĐA47.12/16-19 Trong trình nghiên cứu, tác giả nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy cô, nhà khoa học đồng nghiệp, bạn bè gia đình Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy hướng dẫn khoa học PGS.TS Habil Phạm Văn Cường, TS Trần Đăng Thạch hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực Luận án Tơi xin cảm ơn PGS TS Đoàn Thị Mai Hương anh chị phòng Tổng hợp hữu cơ, TS Lê Thị Hồng Minh nhà khoa học phòng Cơng nghệ sinh học – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam quan tâm, giúp đỡ, thảo luận đưa dẫn cho luận án Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu trường THPT Hương Khê, Ban Giám đốc Sở GD&ĐT Hà Tĩnh tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành khóa học Tôi xin cảm ơn GS.TS Đỗ Công Thung cán kiêm thợ lặn Viện Tài nguyên Môi trường biển giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt chuyến thu mẫu ngồi biển Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới sở đào tạo Viện Hóa sinh biển Học viện Khoa học công nghệ, Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, cán phụ trách nghiên cứu sinh giúp đỡ suốt trình học tập Cuối tơi xin cảm ơn bạn bè gia đình ln bên tơi, cổ vũ động viên tơi lúc khó khăn để vượt qua hoàn thành tốt luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả Cao Đức Danh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG i DANH MỤC CÁC HÌNH iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Sự phân bố tính đa dạng vi sinh vật biển 1.2 Xạ khuẩn hình thành hợp chất thứ cấp từ xạ khuẩn 1.2.1 Xạ khuẩn (Actinobacteria) 1.2.2 Sự hình thành hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học xạ khuẩn 1.3 Các họ xạ khuẩn biển thƣờng gặp 1.3.1 Họ Streptomycetaceae 1.3.2 Họ Micromonosporaceae 1.3.3 Các họ khác xạ khuẩn biển 1.4 Các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn biển 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.4.1.1 Các hợp chất có hoạt tính kháng sinh 1.4.1.2 Các hợp chất có hoạt tính kháng lao 15 1.4.1.3 Các hợp chất có hoạt tính chống ung thư gây độc tế bào 18 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 26 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu thiết bị nghiên cứu 32 2.1.1 Vật liệu 32 2.1.2 Hóa chất 32 2.1.3 Thiết bị 33 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu 33 2.2.2 Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn biển [74-76] 34 2.2.3 Phƣơng pháp làm chủng que cấy vòng [74, 77] 35 2.2.4 Phƣơng pháp giữ giống xạ khuẩn sau phân lập [74, 77, 78] .35 2.2.5 Phƣơng pháp hoạt hố ni cấy [74, 77, 78] 35 2.2.6 Phƣơng pháp tạo cặn chiết từ dịch nuôi cấy để sàng lọc hoạt tính sinh học 2.2.7 Phƣơng pháp định danh xạ khuẩn 2.2.7.1 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn 2.2.7.2 Phương pháp phân loại xạ khuẩn kỹ thuật sinh học ph 2.2.8 Phƣơng pháp sinh khối lƣợng lớn [83] 2.2.9 Phƣơng pháp phân lập hợp chất thứ cấp 2.2.10 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân 2.2.11 Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 2.2.13 Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng lao [86] CHƢƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Kết thu mẫu 3.2 Kết phân lập chủng xạ khuẩn 3.3 Kết thử hoạt tính sinh học chủng thu đƣợc 3.4 Kết định danh chủng xạ khuẩn G246, G261, G248 3.4.1 Quan sát đặc điểm hình thái chủng nghiên cứu 3.4.2 Nhân gen 16S ARN riboxom 3.4.3 Giải trình tự gen 3.5 Kết sinh khối lƣợng lớn chủng xạ khuẩn G246, G261, G2 3.6 Kết phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ ch khuẩn Streptomyces sp G246 3.6.1 Xử lý mẫu, tạo cặn chiết 3.6.2 Phân lập chất từ cặn chiết 3.6.3 Thơng số vật lí liệu phổ hợp chất phân lập đƣợc từ chủng Streptomyces sp G246 3.6.3.1 trihydroxylflavanone 3.6.3.2 tetrahydroxylchalcone 3.6.3.3 Hợp chất G246-3: cyclo-(Pro-Gly) 3.6.3.4 Hợp chất G246-4: cyclo-(L-Pro-L-Tyr) 3.6.3.5 Hợp chất G246-5: cyclo-(D-Pro-L-Tyr) 3.6.3.6 Hợp chất G246-6: cyclo-(Pro-Ala) 53 3.6.3.7 Hợp chất G246-7: norharman 53 3.6.3.8 Hợp chất G246-8: tryptophan 54 3.6.3.9 Hợp chất G246-9: indol-3-carboxylic acid 54 3.6.3.10 Hợp chất G246-10: phenyl alanin 54 3.7 Kết phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G261 54 3.7.1 Xử lý mẫu, tạo cặn chiết 54 3.7.2 Phân lập chất từ cặn chiết chủng Streptomyces sp G261 55 3.7.3 Thông số vật lý liệu phổ hợp chất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G261 57 3.7.3.1 Hợp chất G261-1: norharman 57 3.7.3.2 Hợp chất G261-2: butane-2,3-diol 57 3.7.3.3 Hợp chất G261-3: pyrrole-2-carboxylic acid 57 3.7.3.5 Hợp chất G261-5: 3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid 57 3.7.3.6 Hợp chất G261-6: 2-acetamidobenzamide 58 3.7.3.7 Hợp chất G261-7: phenyl alanine 58 3.7.3.8 Hợp chất G261-8: cyclo-(pro-gly) 58 3.7.3.9 Hợp chất G261-9: cyclo-(Pro-Ala) 58 3.7.3.10 Hợp chất G261-10: cyclo-(Leu-Pro) 58 3.7.3.11 Hợp chất G261-11: cyclo-(Pro-Tyr) 58 3.7.3.12 Hợp chất G261-12: cyclo-trans-4-OH-(Pro-Phe) .59 3.8 Kết phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G248 59 3.8.1 Xử lý mẫu, tạo cặn chiết 59 3.8.2 Phân lập chất từ cặn chiết 60 3.8.3 Thông số vật lý liệu phổ hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G248 62 3.8.3.1 Hợp chất G248-1: cyclo-(Pro – Leu) 62 3.8.3.2 Hợp chất G248-2: cyclo-(Pro-Phe) 63 3.8.3.3 Hợp chất G248-3: norharman 63 3.8.3.4 Hợp chất G248-4: cyclo (Pro-Tyr) 63 3.8.3.5 Hợp chất G248-5: cyclo-(Pro-Gly) 63 3.8.3.6 Hợp chất G248-6: cyclo-(Pro-Trp) 64 3.8.3.7 Hợp chất G248-7: adenine 64 3.8.3.8 Hợp chất G248-8: 2-(4-hydroxyphenyl)acetic acid .64 3.8.3.9 Hợp chất G248-9: (2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′-dimethoxy-5,2′- dihydroxylflavanone 64 3.8.3.10 Hợp chất G248-10: (2S)-6-prenyl-4′-methoxy-5,7- dihydroxylflavanone 64 3.8.3.11 Hợp chất G248-11: (2S,2″S)-6-lavandulyl-5,7,2′,4′- tetrahydroxylflavanone 64 3.8.3.12 Hợp chất G248-12: (2″S)-5′-lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′- tetrahydroxylchalcone 65 3.8.3.13 Hợp chất G248-13: (2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′- trihydroxylflavanone 65 3.9 Kết thử hoạt tính sinh học hợp chất phân lập đƣợc .65 3.9.1 Kết thử hoạt tính VSVKĐ hợp chất 65 3.9.2 Kết thử hoạt tính kháng lao hợp chất phân lập đƣợc .65 3.9.3 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập đƣợc 65 CHƢƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 68 4.1 Kết thu mẫu 68 4.2 Kết phân lập chủng xạ khuẩn 68 4.3 Kết thử hoạt tính sinh học chủng thu đƣợc 68 4.4 Kết định danh chủng xạ khuẩn G246, G261, G248 69 4.4.1 Quan sát đặc điểm hình thái chủng nghiên cứu .69 4.4.2 Nhân gen 16S ARN riboxom 69 4.4.3 Giải trình tự gen xác định tên chủng xạ khuẩn 70 4.5 Kết sinh khối lƣợng lớn chủng xạ khuẩn G246, G261, G248 .70 4.6 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G246 70 4.6.1 Hợp 5,2′,4′- chất G246-1: (2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy- trihydroxylflavanone (hợp chất mới) 70 4.6.2 Hợp 2,4,2′,6′- chất G246-2: (2″S)-5′-lavandulyl-4′-methoxy- tetrahydroxylchalcone (hợp chất mới) 77 4.6.3 Hợp chất G246-3: cyclo-(Pro-Gly) 83 4.6.4 Hợp chất G246-4: cyclo-(L-Pro-L-Tyr) 84 4.6.5 Hợp chất G246-5: cyclo-(D-Pro-L-Tyr) 85 4.6.6 Hợp chất G246-6: cyclo-(Pro-Ala) 86 4.6.7 Hợp chất G246-7: norharman 87 4.6.8 Hợp chất G246-8: tryptophan 88 4.6.9 Hợp chất G246-9: indole-3-carboxylic acid 88 4.6.10 Hợp chất G246-10: phenyl alanin 89 4.6.11 Tổng hợp hợp chất phân lập đƣợc từ chủng Streptomyces sp G246 90 4.7 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G261 91 4.7.1 Hợp chất G261-1: norharman 91 4.7.2 Hợp chất G261-2: butane-2,3-diol 91 4.7.3 Hợp chất G261-3: pyrrole-2-carboxylic acid 92 4.7.4 Hợp chất G261-4: 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4-carboxylic acid 92 4.7.5 Hợp chất G261-5: acid 3-hydroxy-4-methoxybenzoic 95 4.7.6 Hợp chất G261-6: 2-acetamidobenzamide 96 4.7.7 Hợp chất G261-7: phenylalanin 96 4.7.8 Hợp chất G261-8: cyclo-(Pro-Gly) 97 4.7.9 Hợp chất G261-9: cyclo-(Pro-Ala) 97 4.7.10 Hợp chất G261-10: cyclo-(Pro-Leu) 98 4.7.11 Hợp chất G261-11: cyclo-(Pro-Tyr) 99 4.7.12 Hợp chất G261-12: cyclo-trans-4-OH-(Pro-Phe) .100 4.7.13 Hợp chất G261-13: cyclo-(Leu-Tyr) 101 4.7.14 Tổng hợp hợp chất phân lập đƣợc từ chủng Streptomyces sp G261 102 4.8 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G248 103 77 Phổ 13 C NMR hợp chất G248-10: 125.76 MHz, CD3OD PLIII 11 Hợp chất G248-11: (2S,2″S)-6-lavandulyl-5,7,2′,4′tetrahydroxylflavanone Phổ khối HR-ESI-MS hợp chất G248-11 78 Phổ H-NMR (500 MHz; CD3OD) hợp chất G248-11 79 Phổ 13 C-NMR hợp chất G248-11 80 Phổ DEPT hợp chất G248-11: 125.76 MHz, CD3OD 1 Phổ H- H COSY hợp chất G248-11: 500.13 MHz, CD3OD 81 Phổ HMBC G248-11 ( H: 500.13 MHz, HSQC hợp chất G248-11 ( H: 500.13 MHz, 13 C: 125.76 MHz, CD3OD) 13 C: 125.76 MHz, CD3OD) 82 Phổ CD hợp chất G249-11 Phổ CD ECD hợp chất G249-11 83 PL III 12 Hợp chất G248-12: (2″S)-5′-lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′tetrahydroxylchalcone Phổ HR- ESI-MS hợp chất G248-12 100 98 96 94 92 511.19cm-1 %T 90 88 3695.84cm-1 86 84 82 80 78 cm-1 Phổ IR hợp chất G248-12 84 85 Phổ H-NMR (500 MHz; CD3OD) hợp chất G248-12 Phổ 13 C NMR hợp chất G248-12: 125.76 MHz, CD3OD 86 Phổ DEPT hợp chất G248-12: 125.76 MHz, CD3OD 1 Phổ H- H COSY hợp chất G248-12: 500.13 MHz, CD3OD 87 Phổ HMBC G248-12 ( H: 500.13 MHz, 13 C: 125.76 MHz, CD3OD) HSQC hợp chất G248-12 88 Phổ CD hợp chất G249-12 Phổ CD ECD đồng phân 2″S- G248-12 2″R-G248-12 89 PL III 13 Hợp chất G248-13: (2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′trihydroxylflavanone Phổ HR-ESI-MS hợp chất G248-13 Phổ H-NMR (500 MHz; CD3OD) hợp chất G248-13 90 ... ba chủng xạ khuẩn Streptomyces G246, G261, G248 thu thập vùng biển miền Trung - Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu: Phát hợp chất có hoạt tính kháng sinh gây độc tế bào từ nguồn vi sinh vật đáy biển. .. biển miền Trung Việt Nam, cụ thể là: - Nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy chủng vi sinh vật phân lập từ vùng biển miền Trung – Việt Nam - Khảo sát hoạt tính gây. .. loại kháng sinh mới, hoạt chất có tính kháng lao, chống ung thư Vì chúng tơi thực luận án với tên đề tài: ‘ Nghiên cứu phân lập khảo sát hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào hợp chất thứ cấp từ ba