Phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen ZmNF YB2 và ZmNAC1 nhằm đáp ứng khả năng chống chịu với điều kiện hạn hán ở cây ngô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN HỮU KIÊN PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN ZmNF-YB2 VÀ ZmNAC1 NHẰM ĐÁP ỨNG KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN HÁN Ở CÂY NGÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, năm 2014 http://www.lrc.tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - NGUYỄN HỮU KIÊN PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN ZmNF-YB2 VÀ ZmNAC1 NHẰM ĐÁP ỨNG KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN HÁN Ở CÂY NGÔ Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Đồng HÀ NỘI, năm 2014 http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC Lời cảm ơn…………………………………………………………………………………i Lời cam đoan…………………………………………………………………… ………ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT………………………………… iii BẢNG…………………………………………………………… v DANH DANH MỤC MỤC CÁC CÁC HÌNH……………………………………………………………….vi MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan ngô 1.1.1 Nguồn gốc địa lý ngô 1.1.2 Nguồn gốc di truyền ngô 1.1.3 Đặc điểm nông sinh học ngô 1.1.4 Vai trò ngô kinh tế 1.1.5 Tình hình sản xuất ngô giới Việt Nam 1.1.5.1 Tình hình sản xuất ngô giới 1.1.5.2 Tình hình sản xuất ngơ Việt Nam 10 1.2 Tình hình phát triển ngơ biến đổi gen giới Việt Nam 11 1.2.1 Các phương pháp chuyển gen vào ngô 11 1.2.2 Thành tựu triển vọng ngô biến đổi gen giới Việt Nam 13 1.3 Ảnh hƣởng hạn hán đến trồng phản ứng trồng với điều kiện hạn hán 16 1.3.1 Hạn hán nhu cầu tạo trồng kháng hạn 16 1.3.2 Khái niệm tính chiu hạn phản ứng trồng với điều kiện hạn17 1.4 Tổng quan gen NF-YB2 NAC1 19 1.4.1 Khái niệm vai trò nhân tố phiên mã với điều kiện bất lợi phi sinh học…………………………………………………………………………………… 19 1.4.2 Tổng quan gen NF-YB2 20 1.4.3 Tổng quan gen NAC1 22 http://www.lrc.tnu.edu.vn Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Vật liệu nghiên cứu 26 2.1.1 Vật liệu thực vật 26 2.1.2 DNA plasmid chủng vi khuẩn 26 2.1.3 Hóa chất 26 2.1.4 Các thiết bị máy móc 27 2.1.5 Địa điểm nghiên cứu 27 2.2 Phƣơng pháp 27 2.2.1 Phương pháp tìm kiếm liệu thiết kế mồi đặc hiệu cho gen ZmNF-YB2 ZmNAC1 27 2.2.2 Phương pháp tổng hợp cDNA 28 2.2.3 Tách dòng gen ZmNF-YB2 ZmNAC1 từ cDNA giống NTCB 32 2.2.4 Thiết kế vector siêu biểu gen ZmNF-YB2 ZmNAC1 37 2.2.5 Khảo sát khả tiếp nhận gen ZmNF-YB2 ZmNAC1 số dòng ngơ Việt Nam 42 2.2.6 Các tiêu theo dõi đánh giá 43 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Kết tách chiết RNA tổng số từ giống NTCB 44 3.2 Kết phân lập gen ZmNF-YB2 ZmNAC1 từ cDNA giống NTCB 45 3.3 Thiết kế vector siêu biểu pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 pZY:CaMV5S::ZmNAC1 51 3.4 Kết đánh giá khả tiếp nhận gen số dòng ngô Việt Nam sử dụng vector pZY:CaMV35S::ZmNFYB2 pZY:CaMV35S::ZmNAC1 55 3.4.1 Kết biến nạp gen ZmNF-YB2 ZmNAC1 vào dòng ngơ 55 3.4.2 Kết phân tích mang gen ZmNF-YB2 ZmNAC1 kỹ thuật PCR…………………………………………………………………………………… 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC………………………………………………………………………………68 http://www.lrc.tnu.edu.vn i Lời cảm ơn Trước hết Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô cán công tác Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập viện Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Đồng, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ hỗ trợ tơi suốt q trình cơng tác thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Nhân dịp này, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán bộ, anh, chị, em Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp giúp đỡ động viên tơi q trình công tác nghiên cứu khoa học vừa qua Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè nhiệt tình động viên, giúp đỡ tơi trình học tập, nghiên cứu khoa học sống Luận văn thực từ nguồn kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn công nghệ gen” thuộc chương trình đề tài cấp nhà nước lĩnh vực CNSH Nông nghiệp Xin chân thành cảm ơn! Hà nội, tháng năm 2014 Nguyễn Hữu Kiên http://www.lrc.tnu.edu.vn ii Lời cam đoan Tôi xin cam đoan trực tiếp thực nghiên cứu luận văn Mọi kết thu nguyên bản, không chỉnh sửa chép từ nghiên cứu khác, số liệu, sơ đồ kết luận văn chưa công bố Mọi liệu hình ảnh, biểu đồ trích dẫn tham khảo luận văn thu thập sử dụng từ nguồn liệu mở với đồng ý tác giả Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Tác giả Nguyễn Hữu Kiên http://www.lrc.tnu.edu.vn iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine (Benzyladeninpurin) Bp Base pair cDNA Complementary DNA Cs Cộng CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic Acid DEPC Diethyl pyrocarbonate dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate E.coli Escherichia coli EDTA Ethylen dimine tetra acetic acid g/l Gam/lít IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside Kb Kilobase kDa KiloDalton http://www.lrc.tnu.edu.vn iv LB Luria Bertani mg/l Miligam/lít NTCB Ngơ tẻ cao OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid Rnase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulphate TAE Tris-Acetic acide-EDTA Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase TE Tris-EDTA X-Gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Dự báo nhu cầu ngô giới đến năm 2020 Bảng 1.2 Diện tích, suất, sản lượng ngơ giới 2009 – 2012 10 Bảng 1.3 Sản xuất ngô Việt Nam từ năm 2009 – 2012 11 Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng 29 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng 31 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 31 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR gen ZmNF-YB2 ZmNAC1 từ cDNA 32 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 33 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng gắn 3’A Overhang 34 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng gắn đoạn gen vào vector tách dòng 35 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng PCR từ khuẩn lạc 36 Bảng 2.10 Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn 37 Bảng 2.11 Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid 38 Bảng 2.12 thành phần phản ứng loại nhóm 5’ phosphatase 39 Bảng 2.13 Thành phần phản ứng gắn đoạn gen vào vector 39 Bảng 2.14 Thành phần phản ứng cắt plasmid pZY:CaMV35S 40 Bảng 3.1 Kết tách chiết RNA tổng số giống NTCB 44 Bảng 3.2 Kết biến nạp vector pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 pZY:CaM35S::ZmNAC1 vào dòng ngơ Việt Nam 56 Bảng 3.3 Kết phân tích dòng ngơ chuyển gen ZmNF-YB2 ZmNAC1 hệ T0 dòng ngơ sử dụng biến nạp 59 http://www.lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế đáp ứng thực vật điều kiện hạn hán 19 Hình 2.1 Vector plasmid pGEM-T Easy mở vòng 35 Hình 2.2 Bản đồ cấu trúc vector biểu pZY:CaMV35S 38 Hình 3.1 Kết điện di kiểm tra RNA tổng số 45 Hình 3.2 Kết khuếch đại gen ZmNF-YB2 từ cDNA 46 Hình 3.3.a Kết PCR gen ZmNAC1 từ cDNA; b Kết PCR đoạn gen ZmNAC1 dự kiến sau xử lý với sorbitol 12 47 Hình 3.4.a Kết điện điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ khuẩn lạc mang gen ZmNF- YB2; b Kết kiểm tra sản phẩm PCR khuẩn lạc mang gen ZmNAC1 49 Hình 3.5 Cấu trúc vector siêu biểu pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 52 Hình 3.6 Cấu trúc vector siêu biểu pZY:CaMV35S::ZmNAC1 52 Hình 3.7.a Kết PCR gen ZmNF-YB2 sử dụng cặp mồi 35S-F/ZmNF-YB2Asc-R; b Kết PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi 35S-F/ZmNAC1BamHI-R 53 Hình 3.8.a Kết cắt vector pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 enzyme giới hạn AscI; b Kết cắt vector pZY:CaMV35S::ZmNAC1 enzyme giới hạn BamHI 54 Hình 3.9 Quy trình biến nạp gen ZmNF-YB2 ZmNAC1 vào dòng ngơ Việt Nam 59 Hình 3.10 Kết phân tích PCR gen chọn lọc (Bar) ngơ chuyển genZmNF- YB2 hệ To 60 Hình 3.11 Kết phân tích PCR gen đích ZmNF-YB2 ngô chuyển gen hệ To 60 Hình 3.12 Kết phân tích PCR gen chọn lọc (Bar) ngô chuyển gen ZmNAC1 hệ To 61 http://www.lrc.tnu.edu.vn 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Tách dòng thành cơng đoạn gen ZmNF-YB2 ZmNAC1 thuộc nhóm nhân tố phiên mã có khả nâng cao khả chống chịu với điều kiện hạn hán từ giống ngô tẻ Cao Bằng Kết tách dòng cho thấy gen ZmNF-YB2 có 537 nucleotide mã hóa cho 178 amino acid, gen ZmNAC1 có 882 nucleotide mã hóa cho 293 amino acid Thiết kế thành cơng vector siêu biểu có chứa đoạn gen ZmNF-YB2 ZmNAC1 điều khiển promoter 35S Kết phân tích PCR dòng ngô sau biến nap chứng tổ tổ hợp vector siêu biểu pZY:CaMV35S::ZmNF-YB2 pZY:CaMV35S:ZmNAC1 sử dụng để chuyển gen vào dòng ngơ chọ lọc Việt Nam II KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu quy trình biến nạp ngơ nhằm nâng cao hiệu chuyển gen ZmNF-YB2 ZmNAC1 vào dòng ngơ Việt Nam Tiếp tục phân tích đánh giá sau chuyển gen ZmNF-YB2 ZmNAC1 hệ kỹ thuật PCR, Southern blot… Từ kết thu chuyển gen, tiếp tục nghiên cứu đánh giá biểu gen ZmNF-YB2 ZmNAC1 điều kiện hạn hán khác http://www.lrc.tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƢỚC Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hương, Phạm Thị Hương, Lê Thị Thu Về, Lê Thị Lan, Nguyễn Chiến Hữu, Lê Huy Hàm (2013), Nghiên cứu biến nạp gen kháng hạn vào số dòng ngơ chọn lọc thơng qua vi khuẩn Agrobacterium Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 2(41): 61-67 Lê Thị Thu Hiền cộng (2003),Cây trồng biến đổi di truyền: thực trạng triển vọng, Cơng nghệ sinh học, 1(3): 265-285 Nguyễn Hữu Hồng (2009), Giá trị dinh dưỡng ngô, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Nguyễn Thị Thanh cộng (1999), Tạo cải (Brassica oleracea var botrycis) cải xanh (B juncea) mang gen kháng sâu cry1ac gen bar kháng thuốc cỏ dại thông qua A tumefaciens, Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc: 1121-1128 Phạm Thị Lý Thu (2007), Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phơi non xác định phương pháp chuyển gen thích hợp ngô Luận án Tiến Sĩ sinh học, Viện Cơng nghệ Sinh học Ngơ Hữu Tình (2009), Chọn lọc lai tạo giống ngô, Nxb Nông nghiệp Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2007), Công nghệ sinh học tập năm công nghệ vi sinh môi trường, Nxb Giáo dục Vũ Văn Vụ (1996), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo Dục TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI Aida M., Ishida T., Fukaki H., Fujisawa H., & Tasaka M (1997), Genes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant, Plant Cell, 9:841-857 10 Boyer J.S (1982), Plant productivity and environment, Science, 218:443-448 11 Cook E R., Seager R., Cane M A., Stahle D.W (2007), Earth, Sci Rev, 81:93-134 12 Collinge M., & Boller T (2001), Differential induction of two potato genes, Stprx2 and StNAC, in response to infection by Phytophthora infestans and to wounding, Plant Mol Biol, 46(5):521e9 13 Cutler S R., Rodriguez P L., Finkelstein R R., Abrams S R (2010), Abscisic acid: emergence of acoresignaling network”, Annual Reviewof Plant Biology, 61:651679 14 Edmeades O G (2007), Drought tolerance in Maize: An Emerging Reality Companion document to excutive summary, ISAAA briefs: 39-2008 15 Fang Y., You J., Xie K., Xie W., Xiong L (2008), Systematic sequence analysis and identification of tissue-specific or stress-responsive genes of NAC transcription factor family in rice, Mol Genet Genomics, 280:535-46 16 Gusmaroli G., Tonelli C., Mantovani R (2001), Regulation of the CCAAT-binding NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana, Gene, 264:173-185 17 Hankenberg D., Wu Y., Voigt A., Adams R., Schramm P., Grimm B (2011), Studies on diferential nuclear translocation mechanism and assembly of the three subunits of the arabidopsis thaliana transcription factor NF-Y, Mol Plant, doi: 10.1093/mp/ssr107 18 Hao Y J., Wei W., Song Q X., Chen H W., Zhang Y Q., Wang F., Zou H F., Lei G., Tian A G., Zhang W K., Ma B., Zhang J S., Chen S Y (2011), Soybean NAC transcription factor promote abiotic stress tolerance and lateral root formation in transgenic plants, The Plant Journal, 68:302-313 19 Hu H., Dai M., Yao J., Xiao B., Li X., Zhang Q., et al (2006), Overexpressing a NAM, ATAF and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice, Proc Natl Acad Sci USA, 103(129):87-92 20 Huang T., Duman J G (2002), Cloning and characterization of a thermal hysteresis (antifreeze) protein with DNA-binding activity from winter bittersweet nightshade, Solanum dulcamara, Plant Mol Biol, 48:339-50 21 IFPRI (2003), 2020 Projections, Washington, D.C 22 Ishiguro S., & Nakamura K (1994), Characterization of a cDNA encoding a novel DNAbinding protein, SPF1, that recognizes SP8 sequences in the 5, upstream regions of genes coding for sporamin and b-amylase from sweet potato, Mol Genet Genomics, 244:563-571 23 James, C (2013), Global status of commercialized biotech/GM crops: 2013, ISAAA: Ithaca, NY 24 Katia P., Roderick W K., Nerina G., Valentina C., Monica F., Chiara T., Ben F H., Roberto M (2012), The promiscuous life of plant nuclear factor Y transcription factors, The Plant Cell, 24: 4777-4792 25 Kazuo N., Kazuko Y S (2005), Molecular studies on stress-responsive gene expression in Arabidopsis and improvement of stress tolerance in crop plants by regulon biotechnology, JARQ39 (4): 221-229 26 Kim T H., Bohmer M., Hu H., Nishimura N., Schroeder J I (2010), Guard cell Signal transduction network: Advances in understanding abscisis acid, CO1, and Ca 2+ signaling, Annu Rev Plant Biol, 61:561-591 27 Kumimoto R W., Zhang Y., Siefers N., Holt B F (2010), NF-YC3, NF-YC4 and NF-YC9 are required for constants-mediated, photoperiod-dependent flowering in Arabidopsis thaliana, Plant J, 63:379-391 28 Kizis D., Pages M (2002), Maize DRE-binding proteins DBF1 and DBF2 are involved in rab17 regulation through the drought-responsive element in an ABA- dependent pathway, Plant J, 30:679-689 29 Le D T., Nishiyama R., Watanabe Y., Mochida K., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K., Tran L S P (2011), Genome-wide survey and expression analysis of the plant-specific NAC transcription factor family in soybean during development and dehydration stress, DNA Research, 18:263-276 30 Li W X., Oono Y., Zhu J., He X J., Wu J M., Lida K., Lu X Y., Cui X., Jin H., Zhu J K (2010), The Arabidopsis NFYA5 transcription factor is regulated transcriptionally and postranscriptionally to promote drought resistance, The Plant Cell, 20:2238-2251 31 Liu J.X., Howell S.H (2010), bZIP28 and NF-Y transcription factors are activated by ER stress and assemble into a transcriptional complex to regulate stress response genes in Arabidopsis, Plant Cell, 22:782-796 32 Lu M., Ying S., Zhang D F., Shi Y S., Song Y C., Tian Y., Li Y (2012), A maize stressresponsive NAC transcription factor, ZmNAC1, confers enhanced tolerance to dehydration in transgenic Arabidopsis”, Plant Cell Reports, 31(9):1701 33 Maity S.N., Crombrugghe B D (1998), Role of the CCAAT-binding protein CBF/NF-Y in transcription, Trends Biochem Sci, 23:174-178 34 Manuela M C., João P M., João S P (2003), Understanding plant response to drought from genes to the whole plant, Functional Plant Biology, 30:239-264 35 Masiero S., Imbriano C., Ravasio F., Favaro R., Pelucchi N., Gorla M S., Mantovani R., Colombo L., Kater M M (2002), Ternary complex formation between MADS-box transcription factors and the histone fold protein NF-YB, J.Biol Chem, 277(22):652926435 36 Mochida K., Yoshida T., Sakurai T., Yamaguchi- Shinozaki K., Shinozaki K., Tran L-S.P (2009), In silico analysis of transcription factor repertoire and prediction of stress responsive transcription factors in soybean, DNA Res 37 Mohammed N., Akhter M S., Shoshi K., (2013), Roles of NAC transcription factors in the regulation of biotic and abiotic stress responses in plants, Microbiology 4:doi 10.3389/fmicb 38 Nakashima K., Takasaki H., Mizoi J., Shinozaki K., & Yamaguchi-shinozaki K (2012), NAC transcription factors in plant abiotic stress responses, Biochimica et Biophysica Acta, 1819:97-103 39 Nakashima K., Ito Y., & Yamaguchi-shinozaki K (2009), Transcriptional regulatory networks in response to abiotic stresses in Arabidopsis and grasses, Plant Physiol, 149:88-95 40 Nakashima K., Tran L P., Nguyen D V., Fujita M., Maruyama K., Todaka D., et al (2007), Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress responsive gene expression in rice, Plant J, 51:617e30 http://www.lrc.tnu.edu.vn 41 Nelson D E., Repet P P., Adams T R., Creelman R A., Wu J., Warney D C., Anstrom D C., Bensen R J., Castiglioni P P., Donnarummo M G., HinChey B S., Kumimoto R W., Maszle D R., Canales R D., Krolikowski K A., Dotson S B., Gutterson N., Ratclife O J., Heard J E (2007), Plant nucleare factor Y (NF-Y) B subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields on water-limted acres, Pnas, 104:16450-16455 42 Ooka H., Satoh K., Doi K., Nagata T., Otomo Y., Murakami K (2003), Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana, DNA Res, 20:239-247 43 Petit J R., Jouzel J., Raynaud D., Barkov N I., Barnola J M., Basile I., Bender M., Chappellaz J., Davis M., Delaygue G., Delmotte M., Kotlyakov V M., Legrand M., Lipenkov V Y., Lorius C., Pespin L., Ritz C., Saltzman E., Stivernard M (2009), Climate and atmospheric history of the past 420,000 years from the Vostok ice core, Antarctica, Nature, 399:429-436 44 Pingali P L., Pandey S (2001), World maize needs meeting: technological opportunities and priorities for the public section, Pingali P (ed) CIMMYT 19992000 World maize facts and trends Meeting world maize needs: technological opportunities and priorities for the public section.CIMMYT, Mexico city: 1-3 45 Riechmann J L., Heard J., Martin G., Reuber L., Jiang C Z., Keddie J., Adam L., Pineda O., Raclife O J., Samaha R R (2000), Arabidopsis transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes, Science, 290: 2105-2110 46 Rivero M R, Kojima M., Gepstein A., Sakakibara H., Mittler R., Gepstein S., Blumwald E (2007), Delayed leaf senescence induces extreme drought tolerance in a flowering plant, PNAS, 104(49):19631-19636 47 Roderick W K., Chamindika L S., Krystal K G., Jan R R., Nicholas S., Ben F H (2013), Nuclear factor Y transcription factors have both opposing and additive roles in ABAmediated seed germination, PLoS ONE, 8(3):e59841 http://www.lrc.tnu.edu.vn 48 Rushton P J., Bokowiec M T., Han S., Zhang H., Brannock J F., Chen X., et al (2008), Tobacco transcription factors: novel insights into transcriptional regulation in the Solanaceae, Plant Physiol 49 Saibo N J M., Lourenco T., Oliveira M M (2009), Transcription factors and regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses, Annals of Botany, 103: 609-623 50 Salinger M J, Sivakumar M V K., Motha R (2005), Climatic, Change, 70:341–362 51 Schmutz J., Steven B C., Jessica S., Jianxin M., Therese M., Nelson W., David L H., Qijian S., Jay J T., Jianlin C., Xu D., Hellsten U., May G D., Yu Y., Sakurai T., Umezawa T., Bhattacharyya M K., Sandhu D., Valliyodan B., Lindquist E., Peto M., Grant D., Shu S., Goodstein D., Barry K., Montona F G., Abernathy B., Jianchang D., Zhixi T., Liucun Z., Navdeep G., Trupti J., Marc L., Anand S., Zhang X C., Shinozaki K., Nguyen H T., Wing R A., Cregan P., Specht J., Grimwood J., Rokhsar D., Stacey G., Shoemaker R C., Jackson S A (2010), Genome sequence of the palaeopolyploid soybean, Nature, 463:178-183 52 Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2007), Gene networks involved in drought stress response and tolerance, J Exp Bot, 58:221-227 53 Siefers N., Dang K K., Kumimoto R W., Bynum W E T., Tayrose G., Holt B F (2009), Tissue-specific expression patterns of Arabidopsis NF-Y transcription factors suggest potential for extensive combinatorial complexity, Plant Physiol, 149:625-641 54 Sinha S., Maity S N., Lu J., de Crombrugghe B (1995), Recombinant rat CBF-C, the third subunit of CBF/NFY, allows formation of a protein-DNA complex with CBF-A and CBF-B and with yeast HAP2 and HAP3, Proc Natl Acad Sci USA, 92:1624-1628 55 Tiwari S B., Shen Y., Chang H C., Hou Y., Harris A., Ma S F., McPartland M., Hymus G J., Adam L., Marion C., Belachew A., Repet P P., Reuber T L., Ratclife O J (2010), The flowering time regulator constans is recruited to the flowering locus T promoter via a unique cis-element, New Phytol, 187:56-66 http://www.lrc.tnu.edu.vn 56 Tran L.S., Nishiyama R., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K (2010), Potential utilization of NAC transcription factors to enhance abiotic stress tolerance in plants by biotechnological approach, GM Crops, 1(1):32-39 57 Udvardi M K., Kakar K., Wandrey M., Montanari O., Murray J., Andriankaja A., Zhang J Y., Benedito V., Hofer J M I., Chueng F., et al (2007), Legume transcription factors: global regulators of plant development and response to the environment, Plant Physiol, 144: 538-549 58 Umezawa T., Nakashima K., Miyakawa T., Kuromori T., Tanokura M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2010), Molecular basis of the core regulatory network in ABA responses: Sensing, Signaling and transport, Plant Cell Physiol, 51(11):1821-1839 59 Vavilov N.I (1926), Studies on the Conbining Ability of CIMMYT Germplasm, CIMMYT Research Highlights: 24-33 60 Wang Y, Ying J., Kuzma M , Chalifoux M., Sample A., Arthur M C., Uchacz T., Sarvas C., Wan J., Dennis T D , Court M P., Huang Y (2005), Molecular tailoring of farnesylation for plant drought tolerance and yield protection, The Plant Journal, 43:413-424 61 Xia N., Zhang G., Sun Y F., Zhu L., Xu L S., Chen X M., Liu B., Yu Y T., Wang X J., Huang L L., & Kang Z S (2010), TaNAC8, a novel NAC transcription factor gene in wheat, responds to stripe rust pathogen infection and abiotic stresses, Physiol Mol Plant Pathol, 74: 394e402 62 Xiao H., Sha T., Yi A., Dong-Chao Z., Xin-Li X., Wie-Lun Y (2013), Overexpression of the poplar NF-YB7 transcription factor factor drought tolerance and improves water-use efficiency in Arabidopsis, Journal of Experimental Botany, 64(14):4589-4601 63 Yamaguchi-shinozaki K., Koizumi M., Urao S., & Shinozaki K (1992), Molecular cloning and characterization of cDNAs for genes that are responsive to desiccation in Arabidopsis thaliana: sequence analysis of one cDNA clone that encodes a putative transmembrane channel protein, Plant Cell Physiol, 33:217-224 http://www.lrc.tnu.edu.vn 64 Yamamoto A., Kagaya Y., Toyoshima R., Kagaya M., Takeda S., Hattori T (2009), Arabidopsis NF-YB subunits LEC1 and LEC1-like activate transcription by interacting with seed-specific ABRE-binding factors, The Plant Journal 58:843-856 TÀI LIỆU WEB 65 FAOSTAT (2014), http://faostat.fao.org/ 66 ISAAA (2009), Brief report 41-2009 67 ISAAA (2014), http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/commercialtrait/default.asp? TraitTypeID =6&Trait=Abiotic%20Stress%20Tolerance 68 PlantTFDB database, http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/ 69 NCBI, http://ncbi.nlm.nih.gov/ http://www.lrc.tnu.edu.vn PHỤ LỤC Phụ lục Môi trường nuôi cấy khuẩn Môi trƣờng LB: - Môi trường LB lỏng: 5g/l Yeast extract, 10 g/l Triptone, 10 g/l Nacl, pH=7 - Môi trường LB đặc: LB lỏng bổ sung 15g/l Bactor-agar, pH=7 Môi trƣờng YEB: - Môi trường YEB lỏng: 55g/l Yeast extract, 10 g/l Peptone, 10 g/l Nacl pH=7 - Môi trường YEB đặc: YEB lỏng bổ sung 15 g/l Bactor-agar, pH=7 Phụ lục Thành phần môi trường nuôi cấy ngô Thành phần IM CCM SeM RM N6 salts + + + + + - N6 vitamin + + + + + MS salts - - - - - + MS vitamin - - - - - + 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml Sucrose 68.5 g 30 g 30 g 30 g 30 g Glucose 36 g L-proline 0.7 g 0.7 g 0.7 g 0.7 g 0.7 g MES 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 2,4-D, 1mg/ml 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml Glycine (0,2g/500ml) http://www.lrc.tnu.edu.vn ReM EcM 60 g BAP (mg/l) 1mg 100 mg Myo inositol (mg/l) pH w/KOH 5.2 Gellan-gum (g/l) 5.8 5.8 5.8 5.8 5,5-6 5,5-6 5,5-6 5,5-6 5.8 Agar (g/l) 8-9 Khử trùng, sau bố sung: Silver nitrate, 8.5 mg/ml 0.1 ml L-cysteine 0.4 g 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 1ml 1ml 1ml PPT (Phosphinothricin) mg/l mg/l Hygromycin 5mg/l 5mg/l Acetosyringone, 100 mM ml Cefotaxime (250mg/ml) 1ml MS*: Thành phần muối khoáng vitamin theo Murashige Skoog (Murashige et al., 1962) N6*: Thành phần muối khoáng vitamin theo Chu et al (1975) Phụ lục Trình tự nucleotide amino acid mã hóa gen NTCB-ZmNF-YB2 ATG GCG GAA GCT CCG GCG AGC CCT GGC GGC GGC GGC GGG AGC CAC GAG AGC GGG AGC CCC AGG GGA GGC GGA GGC GGT GGC AGC GTC AGG GAG CAG GAC AGG TTC CTG AGT CGC ATC ATG AAC GGG AAG ATC GCC AAG GAC GCT AAG GTC ATC ACT AAG AAG GCC ATC GAG ACC CCG GCT GTG CAG GAG TGC CCC http://www.lrc.tnu.edu.vn ATC TCC GCC AAC ATC GAG TTC TCC TTC ATC AGC GAA GCG AGT GAC AAG TGC AAT GGC GAC GAT CTG GAC TAC ATT GAA CCC CTG TGG GCC ATG GCC ACG CTG CTC AAG GTG TAC ATG GAG GGT GAT AGC AAG TTA ATT AAA AAG GAT GCT CAG AGG GAG AAG CGG AAG ACC CTT ACT GGT CAT GCT CTA GGG TTT CAG AAG TAC AAA TCT AGC GAT GGC TCG MAEAPASPGGGGGSHESGSPRGGGGGGSVREQDRFLPIANISRIMKKAIPANGKIAKDAK ETVQECVSEFISFITSEASDKCQREKRKTINGDDLLWAMATLGFEDYIEPLKVYLQKYRE MEGDSKLTAKSSDGSIKKDALGHVGASSSAAEGMGQQGAYNQGMGYMQPQYHNGDISN* Phụ lục Kết so sánh trình tự nucleotide gen NTCB-ZmNF-YB2 phân lập từ giống ngô tẻ Cao Bằng với giống ngô B73(gb|DQ333304.1|) DQ333304 ZmNFY-B2 DQ333304 ZmNF-YB2 DQ333304 ZmNF-YB2 DQ333304 ZmNF-YB2 DQ333304 ZmNF-YB2 DQ333304 ZmNF-YB2 DQ333304 ZmNF-YB2 DQ333304 ZmNF-YB2 DQ333304 ZmNF-YB2 DQ333304 1 ATGGCGGAAGCTCcggcgagccctggcggcggcggcgggagccacgagagcgggagc ccc aggggaggcggaggcggTGGCAGCGTCAGGGAGCAGGACAGGTTCCTGCCC 61 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCGCCAAC 61 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 121 ATCAGTCGCATCATGAAGAAGG CCATCCCGGCTAACGGG ||||||||||||||||| 121 |||||||||||||||||||||| 160 AAGATCGCCAAGGACGCTAAGGAGACCGTGCAGGAGTGCGTCTCCGAG TTCATCTCCTTC 181 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 220 ATCACTAGCGAAGCGAGTGACAAGTGCCAGAGGGAGAAGCGGAAGAC CATCAATGGCGAC 241 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 280 GATCTGCTGTGGGCCATGGCCACGCTGGGGTTTGAAGACTACATTGAAC CCCTCAAGGTG 301 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 340 TACCTACAGAAGTACAGAGAGATGGAGGGTGATAGCAAGTTAACTGCTA AATCTAGCGAT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| 361 ||||| TACCTGCAGAAGTACAGAGAGATGGAGGGTGATAGCAAGTTAACTGCAA 400 GGCTCGATTAAAAAGGATGCTCTTGGTCATGTGGGAGCAAGTAGCTCAG ||||| |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| 421 GGCTCAATTAAAAAGGATGCCCTTGGTCATGTGGGAGCAAGTAGCTCA 460 ATGGGCCAACAGGGAGCATACAACCAAGGAATGGGTTATATGCAACCTC AGTACCATAAC 481 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 520 GGGGATATCTCAAACTAA 537 |||||||||||||||||| 541 GGGGATATCTCAAACTAA http://www.lrc.tnu.edu.vn GCT AAC CAA GGA ATG GGT TAT ATG CAA CCT CAG TAC CAT AAC GGG GAT ATC TCA AAC TAA ZmNF-YB2 GAA AGA GAG GTG GGA GCA AGT AGC TCA GCA GAA GGG ATG GGC CAA CAG GGA GCA TAC ATC 60 60 120 12 159 18 219 24 279 30 339 36 399 42 459 48 519 54 NTCBNFYB2 NTCBNFYB2 MAEAPASPGGGGGSHESGSPRGGGGGGSVREQDRFLPIANISRIMKKAIP 54 ANGK -1 60 55 -MAEAPASPGGGGGSHESGSPRGGGGGGSVREQDRFLPIANISRIMKKAIP 113 IAKDAKETVQECVSEFISFITSEASDKCQREKRKTINGDDLLWAMATLGFEDY 61 IEPLKV 120 DQ333304 IAKDAKETVQECVSEFISFITSEASDKCQREKRKTINGDDLLWAMATLGFE 17 NTCB114 YLQKYREMEGDSKLTAKSSDGSIKKDALGHVGASSSAAEGMGQQGAYNQ NFYB2 121 GMGYMQPQYHN YLQKYREMEGDSKLTAKSSDGSIKKDALGHVGASSSAA+GMGQQGAYNQ NTCB174 GDISN 178 NFYB2 GDISN 181 GDISN 185 Phụ lục Kết trình tự nucleotide trình tự mã hóa amino axit gen NTCB- ZmNAC1 ATGAGCGGCGCCGGTCCGGATCTGCAGCTGCCACCGGGGTTCCGGTTCCACCCGACGGAC GAGGAGCTGGTGATGCACTACCTCTGCCGCCGCTGCGCCGGCCTGCCCATCGCCGTCCCC ATCATCGCCGAGATCGACCTCTACAAGTTCGACCCATGGCAGCTCCCCAGGATGGCACTG TACGGCGAGAAGGAGTGGTACTTCTTCTCCCCGCGGGACCGCAAGTACCCGAACGGGTCC AGGCCCAACCGCGCCGCCGGGGCTGGGTACTGGAAGGCCACCGGCGCTGACAAGCCCGTG GGCACGCCCAAGCCGCTGGCCATCAAGAAGGCGCTCGTCTTCTACGCCGGCAAGGCGCCC AAGGGCGAGAAGACCAACTGGATCATGCACGAGTACCGCCTCGCCGACGTCGACCGCTCG GCGCGCAAGAAGAACAGCCTCAGGTTGGATGACTGGGTCCTGTGCCGCATCTACAACAAG AAGGGCGGCGGGCTGGAGAAGGCGCCGGCGGCCGGCGGCGACCACAAGCCTGTGTTCGCC ACGGCGGCGGTGAGCTCCCCGCCGGAGCAGAAGCCGTTCGTGGCGGCGGCGGGCGGGCTG CCCCCGGCGTTCCCGGGGCTGGCGGCGTACTACGACCGGCCATCGGACTCGATGCCGCGG CTGCACGCGGACTACTCCAGCTGCTCGGAGCAGGTGCTGTCCCCGGAGCAGCTGGCGTGC GACCGGGAGGTGCAGAGCCAGCCCAAGATCAGCGAGTGGGAGCGGACCTTCGCCTCCGAC CCCGTGAGCCCCGCGGGCTCCATGCTCGACCCCGTCCTCGGCCACGCCGGCGGCGACCCG CTGCTGCAGGACATCCTCATGTACTGGGGCAAGCCGTTCTAG MSGAGPDLQLPPGFRFHPTDEELVMHYLCRRCAGLPIAVPIIAEIDLYKFDPWQLPRMAL YGEKEWYFFSPRDRKYPNGSRPNRAAGAGYWKATGADKPVGTPKPLAIKKALVFYAGKAP KGEKTNWIMHEYRLADVDRSARKKNSLRLDDWVLCRIYNKKGGGLEKAPAAGGDHKPVFA TAAVSSPPEQKPFVAAAGGLPPAFPGLAAYYDRPSDSMPRLHADYSSCSEQVLSPEQLAC DREVQSQPKISEWERTFASDPVSPAGSMLDPVLGHAGGDPLLQDILMYWGKPF http://www.lrc.tnu.edu.vn Phụ lục Kết so sánh trình tự gen ZmNAC1 phân lập từ giống NTCB với trình tự gen có mã số gb|EU224278.1| Query Sbjct Query 26 61 Sbjct Query 86 121 Sbjct Query 146 181 Sbjct Query 206 241 Sbjct Query 266 301 Sbjct Query 326 361 Sbjct Query 386 421 Sbjct Query 446 481 Sbjct Query 506 541 Sbjct Query 566 601 Sbjct Query 626 661 Sbjct Query 686 721 Sbjct Query 746 781 Sbjct Query 806 841 Sbjct 866 ATGAGCGGCGCCGGTCCGGATCTGCAGCTGCCACCGGGGTTCCGGTTCCACCCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGAGCGGCGCCGGTCCGGATCTGCAGCTGCCACCGGGGTTCCGGTTCCACCCG ACGGAC GAGGAGCTGGTGATGCACTACCTCTGCCGCCGCTGCGCCGGCCTGCCCATCGCCG TCCCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGGAGCTGGTGATGCACTACCTCTGCCGCCGCTGCGCCGGCCTGCCCATCGCCG TCCCC ATCATCGCCGAGATCGACCTCTACAAGTTCGACCCATGGCAGCTCCCCAGGATGG CACTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCATCGCCGAGATCGACCTCTACAAGTTCGACCCATGGCAGCTCCCCAGGATGG CACTG TACGGCGAGAAGGAGTGGTACTTCTTCTCCCCGCGGGACCGCAAGTACCCGAAC GGGTCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGCGAGAAGGAGTGGTACTTCTTCTCCCCGCGGGACCGCAAGTACCCGAAC GGGTCC AGGCCCAACCGCGCCGCCGGGGCTGGGTACTGGAAGGCCACCGGCGCTGACAA GCCCGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGGCCCAACCGCGCCGCCGGGGCTGGGTACTGGAAGGCCACCGGCGCTGACAA GCCCGTG GGCACGCCCAAGCCGCTGGCCATCAAGAAGGCGCTCGTCTTCTACGCCGGCAAG GCGCCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCACGCCCAAGCCGCTGGCCATCAAGAAGGCGCTCGTCTTCTACGCCGGCAAG GCGCCC AAGGGCGAGAAGACCAACTGGATCATGCACGAGTACCGCCTCGCCGACGTCGAC CGCTCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGGGCGAGAAGACCAACTGGATCATGCACGAGTACCGCCTCGCCGACGTCGAC CGCTCG GCGCGCAAGAAGAACAGCCTCAGGTTGGATGACTGGGTCCTGTGCCGCATCTAC AACAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGCGCAAGAAGAACAGCCTCAGGTTGGATGACTGGGTCCTGTGCCGCATCTAC AACAAG AAGGGCGGCGGGCTGGAGAAGGCGCCGGCGGCCGGCGGCGACCACAAGCCTG TGTTCGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGGGCGGCGGGCTGGAGAAGGCGCCGGCGGCCGGCGGCGACCACAAGCCTG TGTTCGCC ACGGCGGCGGTGAGCTCCCCGCCGGAGCAGAAGCCGTTCGTggcggcggcgggcgg gctg |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGGCGGCGGTGAGCTCCCCGCCGGAGCAGAAGCCGTTCGTGGCGGCGGCGG GCGGGCTG cccccggcgttcccggggctggcggcgTACTACGACCGGCCATCGGACTCGATGCCGCGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCCCGGCGTTCCCGGGGCTGGCGGCGTACTACGACCGGCCATCGGACTCGATG CCGCGG CTGCACGCGGACTACTCCAGCTGCTCGGAGCAGGTGCTGTCCCCGGAGCAGCTG GCGTGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCACGCGGACTACTCCAGCTGCTCGGAGCAGGTGCTGTCCCCGGAGCAGCTG GCGTGC GACCGGGAGGTGCAGAGCCAGCCCAAGATCAGCGAGTGGGAGCGGACCTTCGC CTCCGAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACCGGGAGGTGCAGAGCCAGCCCAAGATCAGCGAGTGGGAGCGGACCTTCGC CTCCGAC CCCGTGAGCCCCGCGGGCTCCATGCTCGACCCCGTCCTCGGCCACGCCGGCGGC GACCCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCGTGAGCCCCGCGGGCTCCATGCTCGACCCCGTCCTCGGCCACGCCGGCGGC GACCCG CTGCTGCAGGACATCCTCATGTACTGGGGCAAGCCGTTCTAG 882 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCTGCAGGACATCCTCATGTACTGGGGCAAGCCGTTCTAG 907 http://www.lrc.tnu.edu.vn 60 85 120 145 180 205 240 265 300 325 360 385 420 445 480 505 540 565 600 625 660 685 720 745 780 805 840 865 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ... chiu hạn Yêu cầu đề tài - Phân lập gen ZmNF- YB2 ZmNAC1 từ giống ngô Tẻ Cao Bằng - Thiết kế vector siêu biểu gen ZmNF- YB2 ZmNAC1 - Khảo sát khả tiếp nhận gen ZmNF- YB2 ZmNAC1 dòng ngơ chọn lọc Việt... chống chịu với điều kiện hạn hán ngơ” Mục đích đề tài Phân lập thiết kế vector nhằm tăng cường biểu gen ZmNF- YB2 ZmNAC1 phục vụ cho công tác chọn tạo dòng ngơ biến đổi gen có khả chiu hạn Yêu cầu... phản ứng sinh hố sinh lí để tồn thích nghi) [25] Xuất phát từ vấn đề yêu cầu cấp thiết này, tiến hành nghiên cứu đề tài Phân lập thiết kế vector biểu gen ZmNF- YB2 ZmNAC1 nhằm đáp ứng khả chống chịu