Phân lập nấm aspergillus flavus và aspergillus paraciticus sinh độc tố từ hạt lạc

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực khóa luận cám ơn thơng tin trích dẫn khóa luận ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2015 Người viết báo cáo Phạm Như Trọng Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii iiii LỜI CÁM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thực Khoa Vi sinh - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia hướng dẫn PGS.TS Phạm Xuân Đà Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, cố gắng, nỗ lực thân, nhận nhiều giúp đỡ, quan tâm từ thầy cơ, đồng nghiệp, gia đình, bạn bè Tôi Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Xuân Đà hướng dẫn tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cám ơn chân thành tới cán Khoa Vi sinh, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Và cuối cùng, xin cám ơn gia đình bạn bè ln sát cánh bên tôi, chia sẻ, tạo động lực cho suốt trình học tập, nghiên cứu Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2015 Người viết báo cáo Phạm Như Trọng Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC v DANH MỤC BẢNG viii ix DANH DANH MỤC MỤC VIẾT HÌNH TẮT x PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích - Yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN THỨ HAI - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung lạc 2.1.1 Cấu tạo lạc 2.1.2 Giá trị công dụng lạc đời sống người 2.2 Nấm mốc sinh độc tố aflatoxin lạc 2.2.1 Các loại nấm sinh aflatoxin lạc 2.2.2 Đặc điểm hình thái 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng A flavus A parasitcus 2.2.4 Điều kiện sinh độc tố 2.3 Độc tố afatoxin 2.2.1 Lịch sử phát aflatoxin 2.2.2 Định nghĩa 2.2.3 Cấu tạo tính chất hóa lý aflatoxin 2.2.4 Độc tính aflatoxin 10 2.2.5 Cơ chế tác động aflatoxin thể 11 2.2.6 Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin 11 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v 2.3 Các phương pháp xác định có mặt độc tố aflatoxin 11 2.3.1 Phương pháp hóa sinh 11 2.3.2 Phương pháp vi sinh 11 2.3.3 Phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR 12 2.4 Tình hình nghiên cứu độc tố aflatoxin lạc 14 2.4.1 Ngoài nước 14 2.4.2 Trong nước 14 PHẦN THỨ BA - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Đối tượng 16 3.1.1 Chủng chuẩn nấm Aspergillus mẫu lạc 16 3.1.2 Dụng cụ thiết bị 16 3.1.3 Các môi trường sử dụng q trình nghiên cứu 16 3.1.4 Hóa chất 16 3.2 Phương pháp nghiên cứu 17 3.2.1 Phương pháp phân lập nấm mốc A flavus A parasiticus 17 3.2.2 Phương pháp định danh nấm mốc dựa vào hình thái cấu tạo vi thể 19 3.2.3 Phương pháp dịnh danh nấm mốc dựa vào trình tự gen ITS 19 3.2.4 Xác định khả sinh độc tố dựa vào phương pháp sắc ký khối phổ 23 PHẦN THỨ TƯ - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết phân lập nấm mốc A flavus A parasiticus 26 4.2 Kết định danh nấm mốc dựa vào hình thái cấu tạo vi thể 26 4.4 Kết giải trình tự gen ITS định danh nấm A flavus, A parasitcus 31 4.4.1 Kết tách chiết ADN 31 4.4.2 Kết khuếch đại phản ứng PCR đặc hiệu 32 4.4.3 Kết giải trình tự 33 4.4.4 Kết chụp ảnh hiển vi điện tử quét 36 4.5 Kết phân tích khả sinh độc tố aflatoxin sắc ký khối phổ 39 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi PHẦN NĂM - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC 43 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Đặc điểm hình thái nấm A flavus A parasiticus Bảng 2.2 Công thức phân tử aflatoxin tính chất Bảng 3.1 Chương trình gradient pha động 24 Bảng 3.2 Điều kiện chạy khối phổ 24 Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc cấu tạo vi thể 27 Bảng 4.2 Kết định danh nấm A flavus A parasiticus 31 Bảng 4.3 Kết đo nồng độ ADN sau tách chiết 32 Bảng 4.4 Kết tìm kiếm ngân hàng gen quốc tế 36 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn viii viiiv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cơng thức cấu tạo chung aflatoxin Hình 2.2 Trình tự đoạn ITS đinh danh nâm 12 Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc sau ngày nuôi cấy môi trường MEA 29 Hình 4.2 Hình thái khuẩn lạc sau ngày nuôi cấy môi trường MEA 30 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR đoạn ITS 33 Hình 4.4 Trình tự từ nu từ 330 đên nu 590 35 Hình 4.5 Trình tự ADN nấm M45 35 Hình 4.6 Ảnh hiển vi điện tử quét nấm M50 37 Hình 4.7 Sắc đồ chạy săc ký khối phổ nấm M45 39 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ix DANH MỤC VIẾT TẮT ADN : Axid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid ribonucleic ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EDTA : Ethylendiamin Tetraacetc Acid ITS : Internal Transcriped Spacer HPLC : High-performance Liquid Chromatography MEA : Malt Extract Agar PCR : Polymerase Chain Reaction TAE : Tris-acetate-EDTA TLC : Thin Layer Chromatography YEP : Yeast Extract Peptone Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn x PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nấm mốc nguyên nhân hàng đầu gây nên giảm chất lượng phá hủy nông sản sau thu hoạch, nhiều chủng nấm sinh độc tố nấm (mycotoxin) nhiễm vào thực phẩm ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe người không may ăn phải, phổ biến chi Aspergillus (A flavus; A parasitcus; …) có khả sinh độc tố aflatoxin, chủng nấm thuộc chi có phổ hoạt động rộng có khả lây nhiễm nhiều loại nông sản ngơ, lạc, bơng, đậu tương … Các loại hạt có dầu (đặc biệt lạc) thích hợp cho phát triển nấm Aspergillus hình thành độc tố aflatoxin, loại độc tố không bị phân hủy điều kiện đun nấu thông thường, có khả gây ung thư người sử dụng lâu dài [4] Cây lạc công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Cây lạc chiếm vị trí quan trọng kinh tế giới không gieo trồng diện tích lớn 100 nước, mà lạc nguồn cung cấp lượng (573 Kcal/100g), bổ sung đạm chất béo quan trọng cho người, hạt lạc sử dụng rộng rãi để làm thực phẩm nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất bánh kẹo [11] Tuy nhiên điều kiện khí hậu nước ta, khí hậu nhiệt đới gió mùa, điều kiện bảo quản lạc kho nhỏ lẻ chưa quan tâm Đó điều kiện thuận lợi cho loài nấm mốc phát triển, xâm nhiễm khơng có biện pháp kiểm sốt nghiêm ngặt Trong năm gần cơng tác vệ sinh an tồn thực phẩm có tến rõ rệt ngày trọng Từ năm 70 nhà khoa học dựa vào hình thái xây dựng hệ thống phân loại nấm đầy đủ, phương pháp truyền thống dựa kỹ thuật vi sinh hình thái học sợi nấm, chồi túi bào tử [4] Tuy nhiên phương pháp truyền thống đòi hỏi thời gian tiến hành lâu thường đến 10 ngày hệ sợi nấm phát triển đầy đủ Do đó, nhà khoa học phát triển kỹ thuật sinh học phân tử kỹ thuật PCR, giải trình gen… để phát định danh nấm sinh độc tố aflatoxin Và phương pháp sắc ký lỏng khối phổ dùng để xác định khả sinh độc tố aflatoxin chủng nấm Xuất phát từ thực tế trên, để đảm bảo chất lượng sản phẩm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng tiến hành đề tài " phân lập nấm Aspergillus flavus va Aspergillus paraciticus sinh đôc tô từ hạt lạc " 1.2 Mục đích - Yêu cầu 1.2.1 Mục đích Phân lập, định danh chủng nấm sinh độc tố aflatoxin lạc phương pháp hình thái học kết hợp giải trình tự gen ITS Từ xác định khả sinh độc tố aflatoxin chủng nấm 1.2.2 Yêu cầu - Phân lập chủng nấm mốc A flavus; A parasiticus có khả sinh độc tố afatoxin mẫu lạc thu thập từ chợ Hà Nội; - Xây dựng phương pháp định danh nấm mốc sinh độc tố aflatoxin dựa vào hình thái kết hợp giải trình tự gen ITS; - Phân tích khả sinh độc tố afatoxin sắc ký lỏng khối phổ Hình 4.4 Trình tự từ nu 330 đên nu 590 34 Từ kết săc đồ trình tự nucleotde xuất hình 4.5 Hình 4.5 Trình tự ADN nấm M45 Từ kết giải trình tự gen mẫu nấm Chúng so sánh trình tự ngân hàng gen, sử dụng phần mềm trực tuyến Blast địa : (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=Blast Search&LINK_LOC=blasthome) Dựa vào mức độ tương đồng chủng phân tích chủng cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI để định danh Hình 4.6 kết so sánh chủng M50 35 Trong hình 4.6 kết so sánh chủng M50 với liệu ngân hàng gen quốc tế cho thấy chủng FIB PP2.2 có mức điểm cao nhất( 1022/1022) so với chủng M50 so sánh, có mức độ bao phủ trình tự phân tích 100%, có mức độ tương đồng 99% Kết so với kết hình thái học bảng 4.2 có khác biệt, dựa vào hình thái học chủng M50 phân vào nhóm A.flavus khác bàn luận sâu phần kết ảnh hiển vi điện tử quét bào tử Tiến so sánh tất chủng giải trình tự với dự liệu ngân hành gen quốc tế thu kết bảng 4.4 Bảng 4.4 Kết tìm kiếm ngân hàng gen quốc tế Mẫu nấm Chủng, trình tự ngân hàng gien quốc tế Đoạn ADN so sánh Loài xác định Phần trăm đoạn so sánh % Mức đồng trình tự % M45 MTCC 8654 ITS1, ITS2 Aspergillus flavus 100 100 M50 FIB PP 2.2 ITS1, ITS2 Aspergillus flavus 100 99 M46 KP214054.1 ITS1, ITS2 Aspergillus flavus 100 100 M43 QRF360 ITS1, ITS2 Aspergillus flavus 100 100 M14 Kết giải trình tự xấu ITS1, ITS2 Khơng định lồi M21 Kết giải trình tự xấu ITS1, ITS2 Khơng định lồi M31 Kết giải trình tự xấu ITS1, ITS2 Khơng định lồi Trong chủng giải trình tự có chủng định danh A flavus chủng chưa định danh sai lỗi xảy Trong chủng giải trình tự có chủng kết trùng với kết hình thái học 4.4.4 Kết chụp ảnh hiển vi điện tử quét Để khẳng định sâu phân loại tến hành chụp ảnh hiển vi điện tử quét bào tử hai mẫu M50 M8.1 phòng kính hiển vi - Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương - 131 Lò Đúc sau so sánh với hình ảnh chuẩn công bố Rodrigues P cộng (2007) hình 4.7 36 Hình 4.7 ảnh hiển vi điện tử quét A.paracitcus (a) A flavus( b) a theo Rodrigues P cộng (2007) Hình 4.8 Ảnh hiển vi điện tử quét bao tử chủng M50 37 Hình 4.9 Ảnh hiển vi điện tử quét nấm M8.1 So sánh hình 4.8 mẫu M50 với hình 4.6 cho thấy chủng M50 thuộc A.flavus với đặc điểm bề mặt bào tử có thùy dạng hạt đậu, rãnh thùy nông đều, hình 4.8 có đặc điểm giống với A.paraciticus: Nhìn hình 4.9 ta thấy hình thái khuẩn lạc nấm M8.1 hình cầu,xù xì có gai nhọn thùy chia sâu Kết hợp kết hình thái ảnh hiển vi điện tử kết luận nấm M8 Aspergillus parasiticus 38 4.5 Kết phân tích khả sinh đơc tơ aflatoxin sắc ký khôi phổ Để bước đầu đánh giá khả sinh độc tố aflatoxin chủng phân lập tến hành với hai chủng M45 M33 o Mẫu thử nuôi mẫu lạc điều kiện: 25 C, tuần, Và phân tích kỹ thuật sắc ký khối phổ Khoa Độc học dị nguyên - Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia Chuẩn AFB1 M45 Hình 4.7 Sắc đồ chạy săc ký khối phổ nấm M45 Min Thời gian lưu nấm M45 trùng với thời gian lưu chuẩn, độc tố thuộc nhóm B1 nồng độ aflatoxin B1 nấm M45 định lượng 6,8 ppb, kết tương tự với chủng M 33 aflatoxin B1 với nồng độ 8,60ppb 39 PHẦN NĂM KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Xây dưng đươc phương p háp phân lập định danh nấm mốc có khả sinh đơc tơ aflatoxin lac băng phương phap hinh thai hoc kêt hơp giai trinh tư gen ITS Phân lâp đươc 30 chủng nghi ngờ Aspergillus flavus Aspergillus parasitcus lạc - Khăng đinh băng hinh thai hoc 18 chủng Aspergillus flavus; - Khăng đinh băng hinh thai hoc 12 chủng Aspergillus parasitcus; - Khăng đinh đươc 04 chủng la Aspergillus flavus giải trình tự đoạn ITS Xác định 02 chủng la Aspergillus flavus sinh đôc tô aflatoxin B1với nồng độ 6,8 ppb 8,6 ppb băng săc ky khôi phô 5.2 Kiến nghị Thâm đinh phương phap phân lâp va đinh danh nâm Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus nên mâu lac va môt sô nông san Tiêp tuc đinh danh 26 khuân lac nghi ngơ lai va phân tch kha sinh đôc tô aflatoxin Phân lâp va đinh danh cac nâm sinh đôc tô mycotoxin khac lac va cac nông san khac TÀI LIỆU THAM KHẢO Tai liệu tiếng việt Nguyễn Thùy Châu (1996) Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc độc tố chúng ngơ, gạo Việt Nam biện pháp phòng trừ, Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học, Trường Đại học Quốc Gia Hà Nội Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000) Vi nấm dùng công nghệ sinh học, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Lê Văn Lương, Quyền Đình Thi (2004) Kỹ thuật di truyền ứng dụng, Nhà xuất Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Hồng Miên (1980) Nấm mốc độc thực phẩm, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Quyền Đình Thi (2005) Tập 1: Những kỹ thuật phân tích DNA, Cơng nghệ sinh học, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Tiêu chuẩn ngành 52 TCN-TQTP 0009:2004 Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc Aspergillus parasitcus, Aspergillus versi-color thực phẩm Tiêu chuẩn ngành 52 TCN-TQTP 0001: 2003 Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus thực phẩm TCVN 8275-2:2010 Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng nấm men nấm mốc - Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc sản phẩm có hoạt độ nước nhỏ 0.95 TCVN 6507-5-2013 Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật 10 TCVN 6004- 2008 Vi sinh vật thực phẩm chức chăn nuôi Yêu cầu chung hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật 11 Viện Dinh Dưỡng - Bộ Y tế (2007) Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam, Nhà xuất Y học, tr.66 Tai liệu nước ngoài 12 Eduardo Beltrán., María Ibáñez., Juan Vicente Sancho., Miguel Ángel Cortés., Vicent Yusà., Félix Hernández (2007) “UHPLC–MS/MS highly sensitve determination of aflatoxins, the aflatoxin metabolite M1 and ochratoxin A in baby food and milk”, Food Chemistry, Issue 2, Pages 737–74 13 Josep M Guerrero, Josepa Gene´, Alberto M Stchigel (1999) Developments in Fungal Taxonomy , Clinical microbiology reviews, p.454-489 14 Anderson H.W., Nehring E.W and Wichser W.R (1973), “Aflatoxin contaminaton of Corn in the Field” Journal of Agriculturre and Food Chemistry, Issue 23, pp 775-782 15 Wang J., & Liu X M (2006),“Surveillance on contaminaton of total afatoxins in corn, peanut, rice, walnut and pine nut in several areas in china”, Chinese Journal of Prevantve Vetrinary Medicine, Issue 4, pp.33-37 16 Rodrigues P., Soares C., Kozakiewicz Z., Paterson R.R.M., Lima N and Venâncio N ( 2007) Identfication and characterization of Aspergillus flavus and aflatoxins, Communicatng Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology 17 Virmani S.M (1997), “Risk of aflatoxin contamination of ground nut in Vietnam appreliminary study”, India conference, No CP 1137, pp 66-78 18 Meritxell Ventura, Antonio Gomez, Ivan Anaya, Jordi Diaz, Francesc Broto, Montserrat Agut, Lluis Comellas (2004), “Determination of aflatoxin B1, G1, B2, G2 in medicinal herbs by liquid chromatography – tantandem mass, spectrmetry”, Journal of Chromatography A , Issue 1048, pp 25-29 19 Nakai V.K., Rocha de L.O., Goncalez, E., Fonseca H., Ortega E M M., & Corrêa B.(2008), “Distribution of fungi and aflatoxins in a stored peanut variety”, Food Chemistry, Issue 106, pp 285-290 20 Jiujiang yu., Deepak Bhatnagar., Thomas E Cleveland Completed sequence of aflatoxin parthway gene clusted in Aspergilus paracitcus FEBS Letters 564, 2004 ( 126-130) Tai liệu Internet 21 http://123doc.vn/document/72047-chuyen-de-cay-lac.htm, ngày truy cập 15/1/2015 PHỤ LỤC Mơt sơ đoạn trình tự nucleotde nấm M43 44 Mơt sơ đoạn trình tự nucleotde nấm M50 45 46 Mơt sơ đoạn trình tự nucleotde nấm M46 47 48 ... 3.2.1 Phương pháp phân lập nấm mốc A flavus va A parasiticus Lấy mẫu lạc nhân thu thập từ chợ khác nhau, đánh số thứ tự, tến hành pha loãng phân lập Phương pháp phân lập A flavus; A parasiticus... paraciticus sinh đôc tô từ hạt lạc " 1.2 Mục đích - Yêu cầu 1.2.1 Mục đích Phân lập, định danh chủng nấm sinh độc tố aflatoxin lạc phương pháp hình thái học kết hợp giải trình tự gen ITS Từ xác định... khả sinh độc tố aflatoxin chủng nấm 1.2.2 Yêu cầu - Phân lập chủng nấm mốc A flavus; A parasiticus có khả sinh độc tố afatoxin mẫu lạc thu thập từ chợ Hà Nội; - Xây dựng phương pháp định danh nấm