Phân Lập Nấm Aspergillus Flavus Và Aspergillus Paraciticus Sinh Độc Tố Từ Hạt Lạc

B GIÁOăD CăVÀă ÀOăT O VI NăHÀNăLÂMăKHOAăH C VÀăCỌNGăNGH VI T NAM VI NăSINHăTHÁIăVÀăTÀIăNGUYÊNăSINHăV T =============***============= PH MăNH ăTR NG PHÂNăL P N M ASPERGILLUS FLAVUS VÀăASPERGILLUS PARACITICUS SINHă CT T H TL C LUÂNăV NăTHACăSIăSINHăHOC HƠăN iă- 2015 S hoá b i Trung tâm H c li u – HTN http://www.lrc.tnu.edu.vn i B GIÁOăD CăVÀă ÀOăT O VI NăHÀNăLÂMăKHOAăH C VÀăCỌNGăNGH VI T NAM VI NăSINHăTHÁIăVÀăTÀIăNGUYÊNăSINHăV T =============***============= PHÂNăL P N M ASPERGILLUS FLAVUS VÀăASPERGILLUS PARACITICUS SINHă CT T H TL C LUÂNăV NăTHACăSIăSINHăH C Chuyênănganh: Viăsinhăvơt Mƣăs : 62 42 40 Ng iăh ngădơnăkhoaăhoc: PGS.TS Ph măXuơnă Ơ H căviên: Ph măNh ăTr ng HƠăNơiă- 2015 S hố b i Trung tâm H c li u – HTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii L IăCAMă OANă Tôiăxinăcamăđoanăr ng,ăs ăli uăvàăk tăqu ănghiênăc uătrongăkhóaălu nănàyă làătrungăth c Tơiăxinăcamăđoanăr ng, m i s giúpăđ cho vi c th c hi năkhóaălu nănàyă đưăđ căcámă năvàăcácăthơngătinăđ cătríchăd nătrongăkhóaălu nănàyăđưăđ c ghi rõăngu n g c Hà N i, ngày 20 tháng 12 n m 2015 Ng i vi tăbáoăcáo Ph măNh ăTr ng S hoá b i Trung tâm H c li u – HTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii L IăCÁMă N Khóaălu n t t nghi pănàyăđ c th c hi n t i Khoa Vi sinh - Vi n Ki m nghi mă ană toànă v sinh th c ph m Qu că giaă d i s h ng d n c a PGS.TS Ph măXuână Vi n tr ng Vi n Ki m nghi măanătoànăv sinh th c ph m Qu c gia hoànăthànhăđ tàiăt t nghi pănày,ăngoàiăs c g ng, n l c c a b n thân,ă tôiă đưă nh nă đ c r t nhi u s giúpă đ ,ă quană tâmă t th yă cô, đ ng nghi p, giaăđình,ăb năbè TơiăXinăg i l i c mă năsâuăs c t i PGS.TS Ph măXuână àăđưăh d năvàăt oăđi u ki năchoătơiăhồnăthànhăkhóaălu nănày ng Tơiă xin g i l iă cámă nă chână thànhă t iă cácă cánă b Khoa Vi sinh, Vi n Ki m nghi mă ană toànă v sinh th c ph m Qu că giaă đưă t nă tìnhă giúpă đ vàă t o u ki n thu n l iăchoătôiăth c hi năđ tàiănày Vàăcu iăcùng,ătơiăxinăcámă năgiaăđìnhăvàăb năbèăđưălnăsátăcánhăbênătơi, chia s , t oăđ ng l căchoătơiătrongăsu tăqătrìnhăh c t p,ănghiênăc u Hà N i, ngày 20 tháng 12 n m 2015 Ng i vi tăbáoăcáo Ph măNh ăTr ng S hoá b i Trung tâm H c li u – HTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv M CăL C L IăCAMă OAN i M CăL C v DANHăM CăB NG viii DANHăM CăHÌNH ix DANHăM CăVI TăT T x PH NăTH ăNH Tă- M ă 1.1.ăă U tăv năđ 1.2.ăM căđíchă- Yêuăc u 1.2.1.ăM căđích 1.2.2.ăYêuăc u PH NăTH ăHAIă- T NGăQUANăTÀIăăLI U 2.1.ăăGi iăthi uăchungăv ăăl c 2.1.1.ăC uăt oăc aăl c 2.1.2 Giáătr ăvàăcôngăd ngăc aăl căđ iăv iăđ iăs ngăc aăconăng i 2.2.ăN măm căsinhăđ căt ăaflatoxinăătrênăl c 2.2.1.ăCácălo iăn măsinhăaflatoxinătrênăl c 2.2.2.ă căđi măhìnhăthái 2.2.3 Cácăy uăt ă nhăh ngăt iăs ăsinhătr ngăA flavus A parasiticus 2.2.4.ă i uăki năsinhăđ căt 2.3.ă căt ăaflatoxin 2.2.1.ăL chăs ăphátăhi năaflatoxin 2.2.2.ă nhăngh a 2.2.3.ăC uăt oăvàătínhăch tăhóaălỦăc aăaflatoxin 2.2.4.ă cătínhăc aăaflatoxin 10 2.2.5 C ăch ătácăđ ngăc aăaflatoxinătrongăc ăth 11 2.2.6.ăC ăch ăsinhăt ngăh păaflatoxin 11 S hoá b i Trung tâm H c li u – HTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v 2.3.ăCácăph ngăphápăxácăđ nhăs ăcóăm tăc aăđ căt ăaflatoxin 11 2.3.1.ăPh ngăphápăhóaăsinh 11 2.3.2.ăPh ngăphápăviăsinh 11 2.3.3.ăPh ngăphápăs ăd ngăk ăthu tăPCR 12 2.4 Tìnhăhìnhănghiênăc uăv ăđ căt ăaflatoxinătrênăl c 14 2.4.1.ăNgoàiăăn c 14 2.4.2.ăTrongăn c 14 PH NăTH ăBA 3.1.ă iăt IăT NGăVÀăPH NGăPHÁPăNGHIÊNăC U 16 ng 16 3.1.1.ăCh ngăchu năn măAspergillus vàăm uăl c 16 3.1.2.ăD ngăc ăvàăthi tăb 16 3.1.3.ăCácămơiătr ngăchínhăs ăd ngătrongăqătrìnhănghiênăc u 16 3.1.4.ăHóaăch t 16 3.2.ăPh ngăphápănghiênăc u 17 3.2.1.ăPh ngăphápăphânăl păn măm căA flavus A parasiticus 17 3.2.2.ăPh ngăphápăđ nhădanhăn măm căd aăvào hìnhătháiăvàăc uăt oăviăth 19 3.2.3.ăPh ngăphápăd nhădanhăn măm căd aăvàoătrìnhăt ăgenăITS 19 3.2.4.ăXácăđ nhăkh ăn ngăsinhăđ căt ăd aăvàoăph PH NăTH ăT ngăphápăs căkỦăkh iăph 23 - K TăQU ăVÀăTH OăLU N 26 4.1 K tăqu ăphânăl păn măm c A flavus A parasiticus 26 4.2.ăK tăqu ăđ nhădanhăn măm căd aăvàoăhìnhătháiăvàăc uăt oăviăth 26 4.4.ăK tăqu ăgi iătrìnhăt ăgenăITS đ nhădanhăn măA flavus, A parasiticus 31 4.4.1.ăK tăqu ătáchăchi tăADN 31 4.4.2.ăK tăqu ăkhu chăđ iăb ngăph nă ngăPCRăđ căhi u 32 4.4.3.ăK tăqu ăgi iătrìnhăt 33 4.4.4.ăK tăqu ăch pă nhăhi năviăđi năt ăquét 36 4.5 K tăqu ăphânătíchăkh ăn ngăsinhăđ căt ăaflatoxinăb ngăs căkỦăkh iăph 39 S hoá b i Trung tâm H c li u – HTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi PH NăN M - K TăLU NăVÀăKI NăNGH 40 5.1.ăK tălu n 40 5.2 Ki n ngh 40 TÀIăLI UăTHAMăKH O 41 PH ăL C 43 S hoá b i Trung tâm H c li u – HTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii DANHăM CăB NG B ngă2.1.ă căđi măhìnhătháiăn măA flavus A parasiticus B ngă2.2.ăCôngăth căphânăt ăc aăcácăaflatoxinăvàătínhăch t B ngă3.1.ăCh ngătrìnhăgradientăc aăphaăđ ng 24 B ngă3.2.ă i uăki năch yăkh iăph 24 B ngă4.1.ă căđi măhìnhătháiăkhu năl căvàăc uăt oăviăth 27 B ngă4.2.ăK tăqu ăđ nhădanhăn măA flavus A parasiticus 31 B ngă4.3.ăK tăqu ăđoăn ngăđ ăADNăsauăkhiătáchăchi t 32 B ngă4.4.ăK tăqu ătìmăki mătrênăngânăhàngăgenăqu căt 36 S hoá b i Trung tâm H c li u – HTN http://www.lrc.tnu.edu.vn viii DANHăM CăHỊNH Hìnhă2.1.ăCơngăth căc uăt oăchungăc aăaflatoxin Hìnhă2.2 Trìnhăt ăđo n ITS đinhădanhănâm 12 Hìnhă4.1.ăHìnhătháiăkhu năl căsauă5ăngàyăniăc yătrênămơiătr ngăMEA 29 Hìnhă4.2.ăHìnhătháiăkhu năl căsauă7ăngàyăniăc yătrênămơiătr ngăMEA 30 Hìnhă4.3.ăK tăqu ăđi nădiăs năph măPCRăđo n ITS 33 Hìnhă4.4.ăTrìnhăt ăt ănuăt ă330ăđênănuă590 35 Hìnhă4.5.ăTrìnhăt ăADNăc aăn măM45 35 Hìnhă4.6.ă nhăhi năviăđi năt ăquétăn măM50 37 Hìnhă4.7 S căđ ăch yăs căkỦăkh iăph ăn măM45 39 S hoá b i Trung tâm H c li u – HTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ix DANH M C VI T T T ADN : Axid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid ribonucleic ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EDTA : Ethylendiamin Tetraacetic Acid ITS : Internal Transcriped Spacer HPLC : High-performance Liquid Chromatography MEA : Malt Extract Agar PCR : Polymerase Chain Reaction TAE : Tris-acetate-EDTA TLC : Thin Layer Chromatography YEP : Yeast Extract Peptone S hoá b i Trung tâm H c li u – HTN http://www.lrc.tnu.edu.vn x Hình 4.4 Trình t t nu 330 đên nu 590 34 T k t qu s căđ trìnhăt nucleotideăđ c xu tăraătrongăhìnhă4.5 Hình 4.5 Trình t ADN c a n m M45 T k t qu gi iătrìnhăt gen c a m u n mătrênă.ăChúngătơiăsoăsánhătrìnhăt c aăđóă trênă ngână hàngă gen,ă s d ng ph n m m tr c n Blast t iă đ a ch : (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=Blast Search&LINK_LOC=blasthome) D aă vàoă m că đ t ngă đ ng gi a ch ngă phână tíchăvàăch ngăđưăcơngăb trênăngânăhàngăgenăqu c t NCBIăđ đ nh danh Hìnhă4.6ăk t qu soăsánhăc a ch ng M50 35 Trongăhìnhă4.6ălàăk t qu soăsánh ch ng M50 v i d li uătrênăngânăhàngăgenă qu c t cho th y ch ngăFIBăPP2.2ălàăcóăm căđi m cao nh t( 1022/1022) so v i ch ng M50ăđ căsoăsánh,ăcóăm căđ bao ph trìnhăt phânătíchălàă100%,ăvàăcóăm căđ t ngă đ ngălàă99%.ăK t qu nàyăsoăv i k t qu hìnhătháiăh c b ng 4.2ăcóăs khácăbi t, d aăvàoăhìnhătháiăh c ch ngăM50ăđ căphânăvàoănhómăA.flavus s khácănhauănàyăs đ căbànălu năsâuăh nă ph n k t qu nh hi năviăđi n t quétăbàoăt Ti năsoăsánhăt t c cácăch ng gi iătrìnhăt v i d li uătrênăngânăhànhăgenăqu c t chúngătôiăthuăđ c k t qu nh ătrongăb ng 4.4 B ng 4.4 K t qu tìm ki m ngân hàng gen qu c t M u n m M45 M50 M46 M43 M14 M21 M31 Ch ng,ătrìnhăt trênăngânăhàngă gien qu c t MTCC 8654 FIB PP 2.2 KP214054.1 QRF360 K t qu gi i trìnhăt x u K t qu gi i trìnhăt x u K t qu gi i trìnhăt x u Trong ch ngăđ ch ngă ch aă đ nhă danhă đ o n ADN soăsánh ITS1, ITS2 ITS1, ITS2 ITS1, ITS2 ITS1, ITS2 ITS1, ITS2 ITS1, ITS2 ITS1, ITS2 Loàiăxácăđ nh Aspergillus flavus Aspergillus flavus Aspergillus flavus Aspergillus flavus Không đ nh đ c lồi Khơng đ nh đ c lồi Khơng đ nh đ c lồi c gi iătrìnhăt cóă4ăch ngăđ Ph nătr mă đo n so sánhă% 100 100 100 100 M căđ ng nh tătrìnhă t % 100 99 100 100 căđ nhădanhălàăA flavus vàă3ă c sai l i x y Trong ch ng gi iă trìnhă t thìă cóă 3ă ch ng k t qu trùngăv i k t qu hìnhătháiăh c 4.4.4 K t qu ch p nh hi n vi n t quét ăkh ngăđ nhăsâuăh năv ăphânălo iăchúngătôiăti năhànhăch pă nhăhi năviăđi nă t ăqtăbàoăt ăc aăhaiăm uăM50ăvàăM8.1ăt iăphòngăkínhăhi năviă- Vi năV ăSinhăD chă T ăTrungă ngă- 131ăLòă úc.ăăsauăđóăsoăsánhăv iăhìnhă nhăchu năđưăđ căcơngăb ăb iă Rodrigues P vàăc ngăs ă(2007)ătrongăhìnhă4.7 36 Hìnhă4.7 nhăhi năviăđi năt ăquét A.paraciticus (a)ăvàăA flavus( b) a theo RodriguesăăPăvàăc ngăs ă(2007)ă Hìnhă4.8.ă nhăhi năviăđi năt ăquétăbƠoăt ăch ngăM50 37 Hìnhă4.9 nh hi năviăđi n t quétăn m M8.1 Soăsánh hìnhă4.8 c aăm uăM50ăv iăhìnhă4.6ăchoăth yăch ngăM50ăthu că A.flavus v iănh ngăđ căđi mătrênăb ăm tăbàoăt ăcóăcácăthùyăd ngănh ăh tăđ u,ăvàărưnhă gi aăcácăthùyănơngăvàăđ u,ăcònăhìnhă4.8ăcóănh ngăđ căđi măgi ngăv iăA.paraciticus: Nhìnăhìnhă4.9 ta th yă hìnhătháiăkhu n l c c a n mă M8.1ăhìnhăc u,xùăxìăvàăcóă gai nh năthùyăchiaăsâu.ăK t h p c a k t qu hìnhătháiăvàă nh hi năviăđi n t chúngătôiă k t lu n n măM8ălàăAspergillus parasiticus 38 4.5 K t qu phơnătíchăkh n ngăsinhăđ c t aflatoxin b ng s căkýăkh i ph đ b că đ uăđánhăgiáăkh n ngăsinhăđ c t aflatoxin c aăcácăch ngăphânăl p căchúngătôiăti năhànhăv i hai ch ngăM45ăvàăM33 M u th đ cănuôiătrênăn n m u l c u ki n: 25oC, tu n,ăVàăđ phână tíchă b ng k thu t s că kỦă kh i ph t iă Khoaă nghi măanătoànăv sinh th c ph m qu c gia c c h c d nguyênă - Vi n ki m Chu n AFB1 M45 Hình 4.7 S c đ ch y s c ký kh i ph n m M45 Min Th iă giană l uă c a n mă M45ă trùngă v i th iă giană l uă c a chu n, đ c t thu c nhómă B1 n ngă đ aflatoxin B1 c a n mă M45ă đ că đ nhă l ngă làă 6,8ă ppb,ă k t qu t ngăt v i ch ngăMă33ălàăaflatoxin B1 v i n ngăđ 8,60ppb 39 PH NăN M K T LU NăVÀăKI N NGH 5.1 K t lu n Xâyăd ngăđ căph ngăp hápăphânăl păvàăđ nhădanhăn măm căcóăkh ăn ngă sinhăđơcătơăaflatoxinătrongălacăb ngăph gen ITS Phânălâpăđ că ngăphapăhinhăthaiăhocăkêtăh păgiaiătrinhăt ă 30 ch ngănghiăng ă Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus l c - Kh ngăđinhăb ngăhinhăthaiăhocă18 ch ngălàăAspergillus flavus; - Kh ngăđinhăb ngăhinhăthaiăhoc 12 ch ngălà Aspergillus parasiticus; - Kh ngăđinhăđ Xácăđ nhăđ că04 ch ngăălaăAspergillus flavus gi iătrìnhăt ăđo năITS că02 ch ngălaăAspergillus flavus sinhăđôcătôăaflatoxin B1v i n ngăđ 6,8 ppb vàă8,6ăppb b ngăs căkyăkhôiăphô 5.2 Ki n ngh Thâmăđinhăph ngăphapăphânălâpăvaăđinhădanhănâmă Aspergillus parasiticus trongănênămâuălacăvaămôtăsôănôngăsan Aspergillus flavus Tiêpătucăđinhădanhă 26 khuânălacănghiăng ăconălaiăvaăphânătichăkhaăn ngăsinhă đôcătôăaflatoxin Phânălâpăvaăđinhădanhăcacănâmăsinhăđôcătôămycotoxinăkhacătrongălacăvaăcacă nôngăsanăkhac 40 TÀIăLI U THAM KH O TƠiăli u ti ng vi t Nguy năThùyăChâuă(1996).ăăNghiên c u m c đ nhi m n m m c đ c t c a chúng ngô, g o Vi t Nam bi n pháp phòng tr , Lu năánăphóăti năs ăkhoaăh c sinh h c,ăTr ngă i h c Qu căGiaăHàăN i 2.ăBùiăXuână ng, Nguy năHuyăV nă(2000).ăVi n m dùng công ngh sinh h c, Nhàăxu t b n khoa h căvàăk thu tăHàăN i 3.ăLêăV năL ng,ăQuy nă ìnhăThiă(2004).ăK thu t di truy n ng d ng,ăNhàăxu t b năă i h c Qu căGiaăHàăN i Nguy n H ngăMiênă(1980) N m m c đ c th c ph m,ăNhàăxu t b n khoa h c vàăk thu tăHàăN i 5.ăQuy nă ìnhăThiă(2005).ăT pă1:ăNh ngăk ăthu tăc ăb nătrongăphânătíchăDNA,ăCơng ngh sinh h c, Nhàăxu tăb năkhoaăh căvàăk ăthu tăHàăN i 6.ăTiêuăchu năngànhăă52 TCN-TQTP 0009:2004 Th ngăquyăk ăthu tăđ nhădanhăn mă m căAspergillus parasiticus, Aspergillus versi-color trongăth căph m 7.ăTiêuăchu năngànhăă52ăTCN-TQTP 0001: 2003 Th ngăquyăk ăthu tăđ nhădanhăn mă m c Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus th căph m TCVN 8275-2:2010 Vi sinh v t th c ph mă vàă th că nă ch nă nuôiă - Ph ngă phápă đ nhă l ng n m men n m m c - Ph n 2: K thu tă đ m khu n l că trongă cácă s n ph măcóăho tăđ n c nh h năho c b ng 0.95 TCVN 6507-5-2013 Vi sinh v t th c ph măvàăth că năch nănuôiă- Chu n b m u th , huy năphùăbanăđ uăvàăcácădungăd chăphaăloưngăth păphânăđ ki m tra vi sinh v t 10 TCVN 6004- 2008 Vi sinh v t th c ph măvàăch ngăch nănuôi.ăYêuăc u chungăvàăh ng d n ki m tra vi sinh v t 11 Vi năDinhăD ng - B Y t (2007) B ngăthànhăph n th c ph m Vi t Nam, Nhàă xu t b n Y h c, tr.66 TƠiăli uăn căngoƠi 12 Eduardoă Beltrán.,ă Maríaă Ibáđez.,ă Juană Vicenteă Sancho.,ă Miguelă Ángelă Cortés.,ă Vicentă Yusà.,ă Félixă Hernándeză (2007).ă ắUHPLCậMS/MS highly sensitive 41 determination of aflatoxins, the aflatoxin metabolite M1 and ochratoxin A in baby foodăandămilk”,ăFood Chemistry, Issue 2, Pages 737ậ74 13 Josepă M.ă Guerrero,ă Josepaă Gene´,ă Albertoă M.ă Stchigelă (1999).ă Developments in Fungal Taxonomy , Clinical microbiology reviews, p.454-489 14 Andersonă H.W.,ă Nehringă E.Wă andă Wichseră W.R.ă (1973),ă ắAflatoxină contaminationăofăCornăinătheăField”.ăJournal of Agriculturre and Food Chemistry, Issue 23, pp 775-782 15 Wang J., & Liu X M (2006),ắSurveillance on contamination of total aflatoxins in corn,ăpeanut,ărice,ăwalnutăandăpineănutăinăseveralăareasăinăchina”, Chinese Journal of Prevantive Vetrinary Medicine, Issue 4, pp.33-37 16 Rodrigues P., Soares C., Kozakiewicz Z., Paterson R.R.M., Lima N and Venâncioă N.ă (ă 2007).ă Identification and characterization of Aspergillus flavus and aflatoxins, Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology 17 Virmani S.M (1997),ăắRiskăofăaflatoxină contaminationăofăgroundănutăină Vietnamă appreliminaryăstudy”,ăIndia conference, No CP 1137, pp 66-78 18 Meritxell Ventura, Antonio Gomez, Ivan Anaya, Jordi Diaz, Francesc Broto, Montserrat Agut, Lluis Comellas (2004), ắDetermination of aflatoxin B1, G1, B2, G2 in medicinal herbs by liquid chromatography ậ tantandem mass, spectrmetry”,ăJournal of Chromatography A , Issue 1048, pp 25-29 19 Nakai V.K., Rocha de L.O., Goncalez, E., Fonseca H., Ortega E M M., & Corrêa B.(2008),ă ắDistributionă ofă fungiă andă aflatoxinsă ină aă storedă peanută variety”, Food Chemistry, Issue 106, pp 285-290 20 Jiujiang yu., Deepak Bhatnagar., Thomas E Cleveland Completed sequence of aflatoxin parthway gene clusted in Aspergilus paraciticus FEBS Letters 564, 2004 ( 126-130) TƠiăli u Internet 21 http://123doc.vn/document/72047-chuyen-de-cay-lac.htm, ngàyătruyăc p 15/1/2015 42 PH L C M t s đo nătrìnhăt nucleotide n m M43 43 44 M t s đo nătrìnhăt nucleotide n m M50 45 46 M t s đo nătrìnhăt nucleotide n m M46 47 48 ... GIÁOăD CăVÀă ÀOăT O VI NăHÀNăLÂMăKHOAăH C VÀăCỌNGăNGH VI T NAM VI N SINH THÁIăVÀăTÀIăNGUYÊN SINH V T =============***============= PHÂNăL P N M ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ASPERGILLUS PARACITICUS SINH ... gen và làăhaiălồiăcóăkh n ng sinh đ c t aflatoxin m nh nh t Vi căxácăđ nhăcácăloàiă sinh aflatoxin hi n t i d aăvàoăđ căđi măhìnhăthái và lo i mycotoxin s n sinh ho c d aăvàoătrìnhăt ADNă(Ito và c... n ph mă và b o v s c iătiêuădùngăăchúngătôiăti năhànhăđ tàiă" phơnăl p n m Aspergillus flavus vƠ Aspergillus paraciticus sinh đ c t t h t l c " 1.2.ăM căđíchă- Yêuăc uă 1.2.1 M c đích Phân l