Phân lập nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus sinh độc tố từ hạt lạc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT =============***============= PHẠM NHƢ TRỌNG PHÂN LẬP NẤM ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ASPERGILLUS PARACITICUS SINH ĐỘC TỐ TỪ HẠT LẠC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT =============***============= PHÂN LẬP NẤM ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ASPERGILLUS PARACITICUS SINH ĐỘC TỐ TỪ HẠT LẠC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vâ ̣t Mã số: 62 42 40 Ngƣời hƣớng dẫn khoa ho ̣c: PGS.TS Phạm Xuân Đà Học viên: Phạm Nhƣ Trọng Hà Nô ̣i - 2015 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực khóa luận cám ơn thơng tin trích dẫn khóa luận ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2015 Ngƣời viết báo cáo Phạm Nhƣ Trọng Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii LỜI CÁM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thực Khoa Vi sinh - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia hướng dẫn PGS.TS Phạm Xuân Đà Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, cố gắng, nỗ lực thân, nhận nhiều giúp đỡ, quan tâm từ thầy cơ, đồng nghiệp, gia đình, bạn bè Tôi Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Xuân Đà hướng dẫn tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cám ơn chân thành tới cán Khoa Vi sinh, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Và cuối cùng, xin cám ơn gia đình bạn bè ln sát cánh bên tơi, chia sẻ, tạo động lực cho suốt trình học tập, nghiên cứu Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2015 Ngƣời viết báo cáo Phạm Nhƣ Trọng Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC v DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC VIẾT TẮT x PHẦN THỨ NHẤT - MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích - Yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN THỨ HAI - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung lạc 2.1.1 Cấu tạo lạc 2.1.2 Giá trị công dụng lạc đời sống người 2.2 Nấm mốc sinh độc tố aflatoxin lạc 2.2.1 Các loại nấm sinh aflatoxin lạc 2.2.2 Đặc điểm hình thái 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng A flavus A parasiticus 2.2.4 Điều kiện sinh độc tố 2.3 Độc tố aflatoxin 2.2.1 Lịch sử phát aflatoxin 2.2.2 Định nghĩa 2.2.3 Cấu tạo tính chất hóa lý aflatoxin 2.2.4 Độc tính aflatoxin 10 2.2.5 Cơ chế tác động aflatoxin thể 11 2.2.6 Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin 11 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v 2.3 Các phương pháp xác định có mặt độc tố aflatoxin 11 2.3.1 Phương pháp hóa sinh 11 2.3.2 Phương pháp vi sinh 11 2.3.3 Phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR 12 2.4 Tình hình nghiên cứu độc tố aflatoxin lạc 14 2.4.1 Ngoài nước 14 2.4.2 Trong nước 14 PHẦN THỨ BA - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Đối tượng 16 3.1.1 Chủng chuẩn nấm Aspergillus mẫu lạc 16 3.1.2 Dụng cụ thiết bị 16 3.1.3 Các mơi trường sử dụng trình nghiên cứu 16 3.1.4 Hóa chất 16 3.2 Phương pháp nghiên cứu 17 3.2.1 Phương pháp phân lập nấm mốc A flavus A parasiticus 17 3.2.2 Phương pháp định danh nấm mốc dựa vào hình thái cấu tạo vi thể 19 3.2.3 Phương pháp dịnh danh nấm mốc dựa vào trình tự gen ITS 19 3.2.4 Xác định khả sinh độc tố dựa vào phương pháp sắc ký khối phổ 23 PHẦN THỨ TƢ - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết phân lập nấm mốc A flavus A parasiticus 26 4.2 Kết định danh nấm mốc dựa vào hình thái cấu tạo vi thể 26 4.4 Kết giải trình tự gen ITS định danh nấm A flavus, A parasiticus 31 4.4.1 Kết tách chiết ADN 31 4.4.2 Kết khuếch đại phản ứng PCR đặc hiệu 32 4.4.3 Kết giải trình tự 33 4.4.4 Kết chụp ảnh hiển vi điện tử quét 36 4.5 Kết phân tích khả sinh độc tố aflatoxin sắc ký khối phổ 39 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi PHẦN NĂM - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC 43 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Đặc điểm hình thái nấm A flavus A parasiticus Bảng 2.2 Công thức phân tử aflatoxin tính chất Bảng 3.1 Chương trình gradient pha động 24 Bảng 3.2 Điều kiện chạy khối phổ 24 Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc cấu tạo vi thể 27 Bảng 4.2 Kết định danh nấm A flavus A parasiticus 31 Bảng 4.3 Kết đo nồng độ ADN sau tách chiết 32 Bảng 4.4 Kết tìm kiếm ngân hàng gen quốc tế 36 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cơng thức cấu tạo chung aflatoxin Hình 2.2 Trình tự đoạn ITS đinh ̣ danh nấ m 12 Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc sau ngày nuôi cấy môi trường MEA 29 Hình 4.2 Hình thái khuẩn lạc sau ngày nuôi cấy môi trường MEA 30 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR đoạn ITS 33 Hình 4.4 Trình tự từ nu từ 330 đên nu 590 35 Hình 4.5 Trình tự ADN nấm M45 35 Hình 4.6 Ảnh hiển vi điện tử quét nấm M50 37 Hình 4.7 Sắc đồ chạy sắ c ký khối phổ nấm M45 39 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ix DANH MỤC VIẾT TẮT ADN : Axid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid ribonucleic ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EDTA : Ethylendiamin Tetraacetic Acid ITS : Internal Transcriped Spacer HPLC : High-performance Liquid Chromatography MEA : Malt Extract Agar PCR : Polymerase Chain Reaction TAE : Tris-acetate-EDTA TLC : Thin Layer Chromatography YEP : Yeast Extract Peptone Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn x 34 Hình 4.4 Trình tự từ nu 330 đên nu 590 Từ kết sắ c đồ trình tự nucleotide xuất hình 4.5 Hình 4.5 Trình tự ADN nấm M45 Từ kết giải trình tự gen mẫu nấm Chúng tơi so sánh trình tự ngân hàng gen, sử dụng phần mềm trực tuyến Blast địa : (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=Blast Search&LINK_LOC=blasthome) Dựa vào mức độ tương đồng chủng phân tích chủng công bố ngân hàng gen quốc tế NCBI để định danh Hình 4.6 kết so sánh chủng M50 35 Trong hình 4.6 kết so sánh chủng M50 với liệu ngân hàng gen quốc tế cho thấy chủng FIB PP2.2 có mức điểm cao nhất( 1022/1022) so với chủng M50 so sánh, có mức độ bao phủ trình tự phân tích 100%, có mức độ tương đồng 99% Kết so với kết hình thái học bảng 4.2 có khác biệt, dựa vào hình thái học chủng M50 phân vào nhóm A.flavus khác bàn luận sâu phần kết ảnh hiển vi điện tử quét bào tử Tiến so sánh tất chủng giải trình tự với dự liệu ngân hành gen quốc tế thu kết bảng 4.4 Bảng 4.4 Kết tìm kiếm ngân hàng gen quốc tế Mẫu nấm M45 M50 M46 M43 M14 M21 M31 Chủng, trình tự ngân hàng gien quốc tế MTCC 8654 FIB PP 2.2 KP214054.1 QRF360 Kết giải trình tự xấu Kết giải trình tự xấu Kết giải trình tự xấu Đoạn ADN so sánh ITS1, ITS2 ITS1, ITS2 ITS1, ITS2 ITS1, ITS2 ITS1, ITS2 ITS1, ITS2 ITS1, ITS2 Loài xác định Aspergillus flavus Aspergillus flavus Aspergillus flavus Aspergillus flavus Khơng định lồi Khơng định lồi Khơng định lồi Phần trăm đoạn so sánh % 100 100 100 100 Mức đồng trình tự % 100 99 100 100 Trong chủng giải trình tự có chủng định danh A flavus chủng chưa định danh sai lỗi xảy Trong chủng giải trình tự có chủng kết trùng với kết hình thái học 4.4.4 Kết chụp ảnh hiển vi điện tử quét Để khẳng định sâu phân loại tiến hành chụp ảnh hiển vi điện tử quét bào tử hai mẫu M50 M8.1 phòng kính hiển vi - Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương - 131 Lò Đúc sau so sánh với hình ảnh chuẩn cơng bố Rodrigues P cộng (2007) hình 4.7 36 Hình 4.7 ảnh hiển vi điện tử quét A.paraciticus (a) A flavus( b) a theo Rodrigues P cộng (2007) Hình 4.8 Ảnh hiển vi điện tử quét bào tử chủng M50 37 Hình 4.9 Ảnh hiển vi điện tử quét nấm M8.1 So sánh hình 4.8 mẫu M50 với hình 4.6 cho thấy chủng M50 thuộc A.flavus với đặc điểm bề mặt bào tử có thùy dạng hạt đậu, rãnh thùy nơng đều, hình 4.8 có đặc điểm giống với A.paraciticus: Nhìn hình 4.9 ta thấy hình thái khuẩn lạc nấm M8.1 hình cầu,xù xì có gai nhọn thùy chia sâu Kết hợp kết hình thái ảnh hiển vi điện tử kết luận nấm M8 Aspergillus parasiticus 38 4.5 Kết phân tích khả sinh độc tố aflatoxin sắc ký khối phổ Để bước đầu đánh giá khả sinh độc tố aflatoxin chủng phân lập tiến hành với hai chủng M45 M33 Mẫu thử nuôi mẫu lạc điều kiện: 25oC, tuần, Và phân tích kỹ thuật sắc ký khối phổ Khoa Độc học dị nguyên - Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia Chuẩn AFB1 M45 Hình 4.7 Sắc đồ chạy sắ c ký khối phổ nấm M45 Min Thời gian lưu nấm M45 trùng với thời gian lưu chuẩn, độc tố thuộc nhóm B1 nồng độ aflatoxin B1 nấm M45 định lượng 6,8 ppb, kết tương tự với chủng M 33 aflatoxin B1 với nồng độ 8,60ppb 39 PHẦN NĂM KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Xây dựng đươ ̣c phương p háp phân lập định danh nấm mốc có khả sinh đô ̣c tố aflatoxin la ̣c bằ ng phương pháp hình thái ho ̣c kế t hơ ̣p giải trình tự gen ITS Phân lâ ̣p đươ ̣c 30 chủng nghi ngờ Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus lạc - Khẳ ng đinh ̣ bằ ng hiǹ h thái ho ̣c 18 chủng Aspergillus flavus; - Khẳ ng đinh ̣ bằ ng hiǹ h thái ho ̣c 12 chủng Aspergillus parasiticus; - Khẳ ng đinh ̣ đươ ̣c 04 chủng là Aspergillus flavus giải trình tự đoạn ITS Xác định 02 chủng là Aspergillus flavus sinh đô ̣c tố aflatoxin B1với nồng độ 6,8 ppb 8,6 ppb bằ ng sắ c ký khố i phổ 5.2 Kiến nghị Thẩ m đinh ̣ phương pháp phân lâ ̣p và đinh ̣ danh nấ m Aspergillus parasiticus nề n mẫu la ̣c và mô ̣t số nông sản Aspergillus flavus Tiế p tu ̣c đinh ̣ danh 26 khuẩ n la ̣c nghi ngờ còn la ̣i và phân tić h khả sinh đô ̣c tố aflatoxin Phân lâ ̣p và đinh ̣ danh các nấ m sinh đô ̣c tố mycotoxin khác la ̣c và các nông sản khác 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Thùy Châu (1996) Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc độc tố chúng ngô, gạo Việt Nam biện pháp phòng trừ, Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học, Trường Đại học Quốc Gia Hà Nội Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000) Vi nấm dùng công nghệ sinh học, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Lê Văn Lương, Quyền Đình Thi (2004) Kỹ thuật di truyền ứng dụng, Nhà xuất Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Hồng Miên (1980) Nấm mốc độc thực phẩm, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Quyền Đình Thi (2005) Tập 1: Những kỹ thuật phân tích DNA, Cơng nghệ sinh học, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội Tiêu chuẩn ngành 52 TCN-TQTP 0009:2004 Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc Aspergillus parasiticus, Aspergillus versi-color thực phẩm Tiêu chuẩn ngành 52 TCN-TQTP 0001: 2003 Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus thực phẩm TCVN 8275-2:2010 Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng nấm men nấm mốc - Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc sản phẩm có hoạt độ nước nhỏ 0.95 TCVN 6507-5-2013 Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật 10 TCVN 6004- 2008 Vi sinh vật thực phẩm chức chăn nuôi Yêu cầu chung hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật 11 Viện Dinh Dưỡng - Bộ Y tế (2007) Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam, Nhà xuất Y học, tr.66 Tài liệu nƣớc ngoài 12 Eduardo Beltrán., María Ibáđez., Juan Vicente Sancho., Miguel Ángel Cortés., Vicent Yusà., Félix Hernández (2007) “UHPLC–MS/MS highly sensitive 41 determination of aflatoxins, the aflatoxin metabolite M1 and ochratoxin A in baby food and milk”, Food Chemistry, Issue 2, Pages 737–74 13 Josep M Guerrero, Josepa Gene´, Alberto M Stchigel (1999) Developments in Fungal Taxonomy , Clinical microbiology reviews, p.454-489 14 Anderson H.W., Nehring E.W and Wichser W.R (1973), “Aflatoxin contamination of Corn in the Field” Journal of Agriculturre and Food Chemistry, Issue 23, pp 775-782 15 Wang J., & Liu X M (2006),“Surveillance on contamination of total aflatoxins in corn, peanut, rice, walnut and pine nut in several areas in china”, Chinese Journal of Prevantive Vetrinary Medicine, Issue 4, pp.33-37 16 Rodrigues P., Soares C., Kozakiewicz Z., Paterson R.R.M., Lima N and Venâncio N ( 2007) Identification and characterization of Aspergillus flavus and aflatoxins, Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology 17 Virmani S.M (1997), “Risk of aflatoxin contamination of ground nut in Vietnam appreliminary study”, India conference, No CP 1137, pp 66-78 18 Meritxell Ventura, Antonio Gomez, Ivan Anaya, Jordi Diaz, Francesc Broto, Montserrat Agut, Lluis Comellas (2004), “Determination of aflatoxin B1, G1, B2, G2 in medicinal herbs by liquid chromatography – tantandem mass, spectrmetry”, Journal of Chromatography A , Issue 1048, pp 25-29 19 Nakai V.K., Rocha de L.O., Goncalez, E., Fonseca H., Ortega E M M., & Corrêa B.(2008), “Distribution of fungi and aflatoxins in a stored peanut variety”, Food Chemistry, Issue 106, pp 285-290 20 Jiujiang yu., Deepak Bhatnagar., Thomas E Cleveland Completed sequence of aflatoxin parthway gene clusted in Aspergilus paraciticus FEBS Letters 564, 2004 ( 126-130) Tài liệu Internet 21 http://123doc.vn/document/72047-chuyen-de-cay-lac.htm, ngày truy cập 15/1/2015 42 PHỤ LỤC Mợt sớ đoạn trình tự nucleotide nấm M43 43 44 Mợt sớ đoạn trình tự nucleotide nấm M50 45 46 Mợt sớ đoạn trình tự nucleotide nấm M46 47 48 ... VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT =============***============= PHÂN LẬP NẤM ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ASPERGILLUS PARACITICUS SINH ĐỘC TỐ TỪ HẠT LẠC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên... paraciticus sinh độc tố từ hạt lạc " 1.2 Mục đích - Yêu cầu 1.2.1 Mục đích Phân lập, định danh chủng nấm sinh độc tố aflatoxin lạc phương pháp hình thái học kết hợp giải trình tự gen ITS Từ xác... 3.2.1 Phương pháp phân lập nấm mốc A flavus và A parasiticus Lấy mẫu lạc nhân thu thập từ chợ khác nhau, đánh số thứ tự, tiến hành pha loãng phân lập Phương pháp phân lập A flavus; A parasiticus