Nghiên cứu sản xuất interleukin 2 người tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào escherichia coli trong điều kiện GMP

LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan tồn kết khóa luận tơi trực tếp thực Các số liệu kết công bố khóa luận hồn tồn trung thực, xác chưa công bố công trình khác Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Học viên cao học Nguyễn Thị Minh Thu i http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới GS TS Trương Nam Hải TS Phùng Thu Nguyệt, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn dìu dắt tơi suốt thời gian học tập nghiên cứu Tiếp đến xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy, cô trường Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái Tài Nguyên sinh vật, thầy, Viện Cơng nghệ sinh học nhiệt tình giảng dạy cho suốt thời gian tham gia khóa học Tơi xin chân thành cảm ơn tồn thể cán nghiên cứu, nhân viên phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học Công ty TNHH Vắc xin Sinh phẩm số 1(VABIOTECH) trực thuộc Bộ Y Tế-Việt Nam tận tình bảo động viên cho lời khuyên quý giá công việc sống Và sau cùng, tình cảm chân thành tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè, người hết lòng ủng hộ động viên tơi suốt thời gian học tập công tác Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Học viên cao học Nguyễn Thị Minh Thu ii http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC HÌNH vi BẢNG DANH vii MỤC MỞ .1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ung thư Việt Nam giới 1.2 Các phương pháp điều trị ung thư 1.3 Tổng quan Interleukin-2 1.3.1 Cấu trúc Interleukin-2 1.3.2 Cơ chế hoạt động chức sinh học Interleukin-2 1.3.3 Vai trò Interleukin-2 điều trị ung thư .9 1.4 Hệ biểu E coli 12 1.4.1 Hệ biểu E coli BL21 .13 1.4.2 Vector biểu pET22b(+) 14 1.4 Lên men sản xuất protein tái tổ hợp hệ thống lên men Bioreactor .16 1.4 Tinh protein hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao .17 1.5 Xác định hoạt tính sinh học IL-2 dòng tế bào CTLL2 19 1.6 Phòng thí nghiệm đạt têu chuẩn GMP 20 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.1.1 Chủng giống plasmid 22 2.1.2 Hóa chất 22 2.1.3 Máy móc thiết bị 22 2.1.4 Các môi trường dung dịch 24 2.1.4.1 Môi trường sử dụng biểu protein .24 2.1.4.2 Dung dịch sử dụng tiền tinh chế protein Interleukin-2 24 2.1.4.3 Dung dịch sử dụng chạy hệ thống sắc ký HPLC 24 iii http://www.lrc.tnu.edu.vn CÁC ĐẦU 2.1.4.4 Dung dịch sử dụng điện di SDS - PAGE 24 2.1.4.5 Dung dịch sử dụng để kết điện di SDS – PAGE 25 2.1.4.6 Dung dịch sử dụng phản ứng Western blot 26 2.1.4.7 Dung dịch sử dụng phương pháp ELISA 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Biểu protein Interleukin-2 tái tổ hợp tế bào E coli hệ thống lên men 10 lít .27 2.2.2 Phá tế bào E coli xử lý IL-2 thô (tiền tinh chế) 27 2.2.3 Tinh chế IL-2 sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 28 2.2.4 Xác định hoạt tnh sinh học protein Interleukin-2 dòng tế bào CTLL2 29 2.2.5 Kiểm tra tính đặc hiệu protein phương pháp Western blot 32 2.2.6 Kiểm tra độ phần mềm Quantity One 33 2.2.7 Kiểm tra nội độc tố LAL kit 33 2.2.8 Xác định hàm lượng protein mẫu tinh chế phương pháp ELISA 34 2.2.9 Điện di SDS-PAGE 35 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Tối ưu lên men chủng E coli BL21 IL-2 quy mô nồi lên men 10 lít 38 3.1.1 Lên men chủng E coli BL21-IL2 hệ thống lên men lít .38 3.1.2 Khảo sát thành phần dinh dưỡng nồng độ chất cảm ứng 39 3.1.3 Lên men chủng E coli BL21-IL2 quy mô hệ thống lên men 10 lít đợt .42 3.1.4 Lên men chủng E coli BL21-IL2 hệ thống lên men 10 lít đợt 46 3.2 Xử lý tền tnh chế thu hồi IL-2 từ sinh khối tế bào lên men .49 3.3 Tinh chế IL-2 sắc ký lỏng hiệu cao HPLC .50 3.4 Xác định hoạt tính sinh học IL-2 dòng tế bào CTLL2 53 3.5 Xác định độ tinh protein IL-2 tái tổ hợp sau tnh chế bằngphần mềm Quantty One .55 3.6 Xác định hàm lượng nội độc tố sản phẩm IL-2 sau tnh chế 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO .59 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN .65 iv http://www.lrc.tnu.edu.vn PHỤ LỤC 66 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amp APS Ampicillin Ammoniumpersulfate AU Absorbance unit BSA Bovine serum albumin (Albumin huyết thanhbò) CSE Control standard endotoxin (Nội độc tốchuẩn) CTL Cytoxic T lymphocyte (Tế bào gây độc) dH2O Distlled water (nước khử trùng) DMSO Dimethylsulfoxide DNA Deoxyribonucleicacid dOT Dissolved oxygene tension E coli Escherichia coli ELISA Enzyme linked immunosorbent assay (Kĩ thuật chất hấp phụ FBS miễn dịch gắnenzym) Fetal Bovine Serum (Huyết thai bò) HIV Human Immunodeficiency Virus IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside IL-2R Interleukin-2 Receptor (Thụ thể củaIL-2) kDa KiloDalton LAL Limulus AmebocyteLysate MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium PBS Phosphate buferedsaline PVDF PolyvinylidineDifloride PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride rhIL-2 Recombinant human Interleukin-2 (IL-2 người tái tổhợp) SDS Sodium dodecylsulfate SDS –PAGE Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gelelectrophoresis TBS Tris bufersaline TEMED N, N, N’, N’ – TetramethylEthylenediamin TFA Trifluoroacetc acid TMB Tetramethylbenzidine v http://www.lrc.tnu.edu.vn TTBS TweenTris bufer saline VABIOTECH Công ty TNHH Một thành viên Vắc xin Sinh phẩm số DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Tế bào NK tiêu diệt tế bào ung thư Hình 2: Cấu trúc không gian Interleukin-2 .7 Hình 3: Sự kích thích tăng sinh biệt hóa Interleukin-2 lên tế bào T [38] Hình 4: Cơ chế hoạt động Interleukin-2 .9 Hình 5: Sự phát triển tế bào ung thư biểu mơ thận 10 Hình 6: Ung thư hắc tố ác tính 11 Hình 7: Sơ đồ cấu trúc vector pET22b+ 15 Hình 8: Cơ chế kiểm soát biểu gene nhờ chất cảm ứng IPTG 16 Hình 9: Lên men hệ thống Bioreactor phòng đạt têu chuẩn GMP 17 Hình 10: Hệ thống tinh protein HPLC 18 Hình 1: Sự biểu protein IL-2 tái tổ hợp hệ thống lên men lít .38 Hình 2: Khảo sát bổ sung thành phần chất dinh dưỡng nồng độ IPTG trình lên men 42 Hình 3: Đường cong sinh trưởng chủng tái tổ hợp E coli BL21-IL2 đợt .43 Hình 4: Điện di Protein tổng số biểu chủng E coli BL21-IL2 hệ thống lên men 10 lít đợt 45 Hình 5: Đường cong sinh trưởng chủng tái tổ hợp E coli BL21-IL2 đợt .47 Hình 6: Điện di Protein tổng số biểu chủng E coli BL21-IL2 hệ thống lên men 10 lít đợt 48 Hình 7: Kiểm tra sản phẩm tền tnh chế đợt lên men hệ thống 10 lít 49 Hình 8: Sắc ký đồ tinh chế IL-2 hệ thống HPLC 51 Hình 9: Kết kiểm tra protein IL-2 sau tnh hệ thống HPLC 52 Hình 10: Biểu đồ thể kích thích tăng sinh tế bào CTLL-2 mẫu IL-2 tái tổ hợp 53 Hình 11: So sánh hoạt tính sinh học riêng mẫu IL-2 55 Hình 12: Kiểm tra độ tnh protein IL-2 Quantty One .56 Hình 13: Kết độ tnh IL-2 xác định phần mềm Quantty One 56 vi http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 14: Hình ảnh kết sau dừng phản ứng đông gel 57 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Giá trị OD mẫu thu sau trình lên men 40 Bảng 2: Giá trị EC50 hoạt tính riêng mẫu IL-2 .54 vii http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Sức khỏe cộng đồng ung thư vấn đề ngày quan tâmở hầu hết quốc gia giới Trong đó, ung thư nguyên nhân chủ yếu gây tử vong cho người bệnh có xu hướng ngày gia tăng Theo ghi nhận tổ chức Y tế Thế giới (năm 2012), giới có 14,1 triệu ca ung thư mớiđược phát 8,2 triệu người chết ung thư Ước tính tới năm 2030, năm có thêm 25 triệu ca mắc bệnh Tại Việt Nam, theo thống kê Bộ Y tế, năm 2010 số ca mắc ung thư tăng lên tới 126.307, ước tính đến năm 2020 số ca mắc ung thư 190.000 ca Ngun nhân gây ung thư mơi trường bên với chế độ sinh hoạt ngày chiếm tới 90% Hiện phương pháp phẫu thuật, hóa trị, xạ trị…vẫn phương pháp phổ biến điều trị ung thư giới Tuy nhiên, chúng số nhược điểm gây tổn thương cho tế bào lành, ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe người bệnh Ngồi phương pháp điều trị liệu pháp miễn dịch phương pháp chữa trị hứa hẹn mang lại hiệu cao Liệu pháp têu diệt tế bào ung thư, khống chế khả phát triển nhanh chóng khối u khơng làm tổn thương tế bào khỏe mạnh, tăng cường khả miễn dịch cho bệnh nhân, kéo dài tuổi thọ nâng cao chất lượng sống Do đó,liệu pháp miễn dịch coi liệu pháp xanh có hiệu điều trị rõ rệt, khơng có tác dụng phụ, an tồn dung nạp tốt, mở hình thức điều trị hoàn toàn cho bệnh nhân ung thư Liệu pháp miễn dịch sử dụng cytokine để kích hoạt hệ thống miễn dịch nhằm nhận biết têu diệt tác nhân gây bệnh.Interleukin-2 (IL-2) cytokineđược tết tế bào lympho T đóng vai trò quan trọng đáp ứng miễn dịch thể Cytokine tham gia vào q trình kích thích hệ thống miễn dịch sản sinh dòng tế bào T, đồng thời kích thích tăng sinh biệt hóa dòng tế bào NK đại thực bào nhằm tăng cường khả miễn dịch thể IL2 sử dụng điều trị hiệu hai loại ung thư biểu mơ thận ung thư da Ngồi ra, IL-2 sử dụng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư khác ung thư http://www.lrc.tnu.edu.vn phổi, ung thư bạch cầu, ung thư buồng trứng,… có khả kích hoạt hệ thống miễn dịch để chống bệnh nhiễm HIV Năm 1992, Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho phép sử dụng IL-2 tái tổ hợp điều trị ung thư Hiện nay, chế phẩm IL-2 với tên thương phẩm Proleukin® (Aldesleukin) sản xuất hãng Chiron thương mại hóa tồn giới, nhiên giá thành Proleukin® cao (khoảng 2,5 nghìn USD/ống 1,3 mg) Tại Việt Nam, việc sử dụng IL-2 tái tổ hợp nói riêng sản phẩm protein tái tổ hợp điều trị nói chung bị bỏ ngỏ chưa có sản phẩm protein tái tổ hợp triển khai áp dụng hồn tồn từ q trình nghiên cứu đến trình sản xuất Để chủ động việc sản xuất IL -2 tái tổ hợp nước giảm giá thành sản xuất với chi phí thấp phục vụ cho việc điều trị bệnh ung thư tai Viêt Nam , việc nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ sản xuất IL-2 tái tổ hợp chuyển giao sang công ty để sản xuất thử nghiệm cần thiết Trong trình nghiên cứusản xuất IL-2 người tái tổ hợp, trình tự amino acid IL2 cải biến nhằm tạo sản phẩm Interleukin-2 có trình tự giống với sản phẩm Proleukin FDA cơng nhận Ngồi ra, việc cải biến trình tự amino acid sẽlàm tăng hoạt tính tăng tính an tồn cho sản phẩm Sản phẩm Proleukin có tên hóa học desalanyl-1, serein-125 human interleukin-2 tương ứng đột biến alanine vị trí amino acid số 1, thay cysteine vị trí 125 serine Để chuyển giao công nghệ sản xuất IL-2 tái tổ hợp từ quy mơ phòng thí nghiệm sang phòng sản xuất đạt têu chuẩn GMP, tiến hành tối ưu biểu protein IL-2 hệ thống lên men 10 lít Viện Cơng nghệ sinh học cơng ty VABIOTECH Sau đó, sản phẩm lên men tến hành tền xử lý tnh chế phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, sản phẩm Interleukin-2 sau tnh chế tến hành xác định hoạt tính sinh học kiểm tra số têu độ độ an toàn, để đáp ứng yêu cầu sản phẩm tái tổ hợp sử dụng điều trị người với giá thành thấp thương phẩm Proleukin Trên sở chúng tơi tến hành thực đề tài: “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 người tái tổ hợp dạng cải biến dòng tế bào Escherichia coli điều kiện GMP” Đề tài thực Công ty Vacxin Sinh phẩm số http://www.lrc.tnu.edu.vn 1, Bộ Y tế phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam http://www.lrc.tnu.edu.vn hiệu rhIL2), trình tự axit amin sản phẩm khác (ít hơn) axit amin Alanine đầu N phân tử, nhiên hoạt tính sản 55 http://www.lrc.tnu.edu.vn phẩm (14,19 x 10 ) cao gấp khoảng 14 lần so với sản phẩm đề tài KC.04.21/06-10 (0,89 x 10 ) (Hình 3.11) Bên cạnh đó, so sánh với IL-2 chuẩn hãng Roche sản phẩm thương mại Proleukin, sản phẩm IL-2 tái tổ hợp Việt Nam có hoạt tính sinh học riêng tương đương với IL-2 chuẩn hãng Roche gần sản phẩm thương mại Proleukin (16,36 x 10 IU/mg)[12][51], tất thể Hình3.11 Hình 11: So sánh hoạt tính sinh học riêng mẫu IL-2 3.5 Xác định độ tinh sạchcủa protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế phần mềm Quantity One Phần mềm Quantity One BioRad phần mềm thông dụng sử dụng nhiều giới để xác định độ đậm nhạt băng protein điện di đồ Để xác định xác độ tinh khiết protein IL-2, chúng tơi sử dụng ảnh điện di gel polyacrylamide kỹ thuật SDS – PAGE nhuộm Coomassie xử lý phần mềm chuyên dụng Quantity One Cách thao tác phần mềm trình bày phần phương pháp Kết thu thể Hình 3.12 55 http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 12:Kiểm tra độ tnh protein IL-2 QuanttyOne Hình3.12cho thấy xuất đỉnh hấp phụ tương ứng với vị trí băng protein gel điện di Mẫu IL-2 sau tnh chế quét phát băng ứng với băng protein IL-2 chứng tỏ mẫu có độ cao Hình 13: Kết độ tnh sạchcủa IL-2 xác định phần mềm Quantty One Từ kết phần mềm đưa cho thấy, sản phẩm IL-2 tái tổ hợp có độ 99,3% Như IL-2 sau tnh chế đạt têu chuẩn độ tinh khiết cho sản phẩmdạng 56 http://www.lrc.tnu.edu.vn thuốc têm truyền tĩnh mạch theo quan quản lý Dược phẩm Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) 3.6 Xác định hàm lượng nội độc tố sản phẩm IL-2 sau tinh chế Để kiểm tra tính an tồn sản phẩm IL-2 tến hành xác định hàm lượng nội độc tố mẫu protein IL-2 tái tổ hợp sau tnh chế LAL kit Để tăng độ tn cậy cho phép thử tến hành lặp lại lần kết thu thể Hình 3.14 Hình 14: Hình ảnh kết sau dừng phản ứng đông gel Độ nhạy dung dịch LAL cung cấp 0,25 EU/ml, có nghĩa với mẫu có nồng độ nội độc tố lớn 0,25 EU/ml cho kết dương tính (tạo gel) Ở mẫu đối chứng dương (nội độc tố chuẩn CSE + LAL), sau ủ 37ºC cho kết dương tính, dịch ống eppendorf chuyển sang trạng thái gel dốc ngược 180º đọng lại đáy ống thể rõ ràng Hình 3.14 Ở mẫu đối chứng âm (dH20 cơng ty VABIOTECH + LAL) mẫu cần kiểm tra nội độc tố (sản phẩm IL-2 sau tnh chế + LAL) cho kết âm tính, saukhi dừng phản ứng toàn dịch trạng thái lỏng dốc ngược 180º chảy hồn tồn xuống miệng ống, chứng tỏ dịch IL-2 sau tinh chế có nồng độ nội độc tố nhỏ 0,25 EU/ml Cả lần thí nghiệm cho kết cho thấy tính ổn định đảm bảo xác mẫu protein thu đáp ứng têu chuẩn sản phẩm tiêm nồng độ nội độc tố không 0,5 EU/ml 57 http://www.lrc.tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau q trình thực đề tài, chúng tơi hồn thiện quy trình sản xuất protein IL-2, đáp ứng yêu cầu chất lượng điều kiện phòng sản xuất đạt têu chuẩn GMP Cơng ty VABIOTECH.Một số kết cụ thể sau: Đ ã biểu thành công protein IL-2 tái tổ hợp dạng cải biếntrong hệ thống lên men 10 lít,với điều kiện nhiệt độ 47°C, bổ sung hai lần dinh dưỡng (glucose 1% cao nấm men 0,5%), cảm ứng IPTG 0,1 mM thu mẫu sau cảm ứng Hàm lượng protein IL-2 thu sau trình lên men đạt 0,86 mg/ml Đ ã tnh chế thành công sản phẩm IL-2 cột bán điều chế hệ thống sắc ký HPLC với hàm lượng protein IL-2 thu sau trình tnh chế đạt 0,667 mg/ml Đ ã xác định hoạt tính sinh học sản phẩm IL-2 đạt 14,19 x 10 IU/mg Đ ã xác định độ sản phẩm IL-2 99,3% đánh giá hàm lượng nội độc tố IL-2 nhỏ 0,25 EU/ml, đáp ứng têu chuẩn độ độ an toàn sản phẩm têm sử dụng điều trị ung thư Kiến nghị Từ kết đạt xin đưa số kiến nghị sau: X ây dựng công thức bán thành phẩm để pha chế IL-2 dạng thương phẩm K iểm tra têu chí an tồn sản phẩm IL-2 tế bào động vật chuột thỏ 58 http://www.lrc.tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Anh LTL, Anh LPH, Khoa ĐT, Hong LTT, Nguyet PT, Thuy ĐT, Chien LA, & Hai TN (2013) "Nghiên cứu tối ưu biểu gen mã hóa Interleukin-2 Escherichia coli.", pp.19–23 Đặng Trần Hoàng, Đức, V M., Phùng Thu Nguyệt, & Trương Nam Hải (2005) "Biểu gen Interleukin-2 người bị đột biến điểm glycosyl hóa gốc cystein 125 Escherichia coli", 3(2), pp.149–154 Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương, Vũ Minh Đức, Đặng Trần Hồng, & Trương Nam Hải (2007) "Xác định hoạt tính sinh học interleukin-2 tái tổ hợp phép thử sinh học tế bào CTLL2", 5(2), pp.157–161 Tiếng Anh Asgarpanah J (2010) "Bioassay Methods useful to select the natural product cancer chemopreventve agents" Iranian Journal of Pharmaceutcal Research, 0(0), pp.71– 71 Bhagwat A S., Sohail A., & Roberts R J (1986) "Cloning and characterizaton of the dcm locus of Escherichia coli K-12." Journal of Bacteriology, 166(3), pp.751– 755 Boyman O., & Sprent J (2012) "The role of interleukin-2 during homeostasis and actvation of the immune system" Nature Reviews Immunology, 12(3), pp.180– 190 Caligiuri M A., Murray C., Robertson M J., Wang E., Cochran K., Cameron C., Schow P., Ross M E., Klumpp T R., & Soiffer R J (1993) "Selective modulation of human natural killer cells in vivo after prolonged infusion of low dose recombinant interleukin 2" The Journal of Clinical Investgaton, 91(1), pp.123– 132 Chu M B., Fesler M J., Armbrecht E S., Fosko S W., Hsueh E., Richart J M., Chu M B., Fesler M J., Armbrecht E S., Fosko S W., Hsueh E., & Richart J M (2013) "High-Dose Interleukin-2 (HD IL-2) Therapy Should Be Considered for 59 http://www.lrc.tnu.edu.vn Treatment of Patents with Melanoma Brain Metastases, High-Dose Interleukin-2 (HD IL-2) Therapy Should Be Considered for Treatment of Patents with Melanoma Brain Metastases" Chemotherapy Research and Practce, Chemotherapy Research and Practce, 2013, 2013, pp.e726925 Cockshott A R., & Bogle I D L (1999) "Modelling the effects of glucose feeding on a recombinant E coli fermentation" Bioprocess Engineering, 20(1), pp.83–90 10 Devos R., Plaetnck G., Cheroutre H., Simons G., Degrave W., Tavernier J., Remaut E., & Fiers W (1983) "Molecular cloning of human interleukin cDNA and its expression in E coli" Nucleic Acids Research, 11(13), pp.4307–4323 11 Eckenberg, R., Moreau, J.L., Melnyk, O., & Thèze, J (2000) "IL-2R beta agonist P1-30 acts in synergy with IL-2, IL-4, IL-9, and IL-15: biological and molecular effects.", 1950(165), pp.4312–4318 12 Eton O., Rosenblum M G., Legha S S., Zhang W., Jo East M., Bedikian A., Papadopoulos N., Buzaid A., & Benjamin R S (2002) "Phase I trial of subcutaneous recombinant human interleukin-2 in patents with metastatc melanoma" Cancer, 95(1), pp.127–134 13 Ferlay J., Soerjomataram I., Dikshit R., Eser S., Mathers C., Rebelo M., Parkin D M., Forman D., & Bray F (2013) "Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012: Globocan 2012" Internatonal Journal of Cancer, 136(5), pp.E359–E386 14 Ferlay, J., Shin, H.-R., Bray F, Forman, D., Mathers, C., & Parkin, D.M (2010) "Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008", 127, pp.2893–2917 15 Francis D M., & Page R (2010) "Strategies to optimize protein expression in E coli" Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E Coligan [et Al.], Chapter 5, pp.Unit 5.24.1–29 16 Gafen S L., & Liu K D (2004) "Overview of interleukin-2 functon, production and clinical applications" Cytokine, 28(3), pp.109–123 60 http://www.lrc.tnu.edu.vn 17 Grodberg J., & Dunn J J (1988) "ompT encodes the Escherichia coli outer membrane protease that cleaves T7 RNA polymerase during purificaton" Journal of Bacteriology, 170(3), pp.1245–1253 18 Haacke A., Fendrich G., Ramage P., & Geiser M (2009) "Chaperone over- expression in Escherichia coli: apparent increased yields of soluble recombinant protein kinases are due mainly to soluble aggregates" Protein Expression and Purificaton, 64(2), pp.185–193 19 Hammerling U., Henningsson A C., & Sjödin L (1992) "Development and validaton of a bioassay for interleukin-2" Journal of Pharmaceutcal and Biomedical Analysis, 10(8), pp.547–553 20 Janice P Dutcher (2002, November 1) "Current Status of Interleukin-2 Therapy for Metastatc Renal Cell Carcinoma and Metastatc Melanoma: Page of | Cancer Network" 21 Ju G., Collins L., Kaffka K L., Tsien W H., Chizzonite R., Crowl R., Bhatt R., & Kilian P L (1987) "Structure-functon analysis of human interleukin-2 Identficaton of amino acid residues required for biological actvity" The Journal of Biological Chemistry, 262(12), pp.5723–5731 22 Keilholz U., Conradt C., Legha S S., Khayat D., Scheibenbogen C., Thatcher N., Goey S H., Gore M., Dorval T., Hancock B., Punt C J., Dummer R., Avril M F., Bröcker E B., Benhammouda A., Eggermont A M., & Pritsch M (1998) "Results of interleukin-2-based treatment in advanced melanoma: a case record-based analysis of 631 patents" Journal of Clinical Oncology: Oficial Journal of the American Society of Clinical Oncology, 16(9), pp.2921–2929 23 Kush Sachdeva, Brendan Curt, & Bagi RP Jana (2015) "Renal Cell Carcinoma: Practce Essentals, Background, Pathophysiology" 24 Liang S M., Thatcher D R., Liang C M., & Allet B (1986) "Studies of structure- actvity relationships of human interleukin-2" The Journal of Biological Chemistry, 261(1), pp.334–337 61 http://www.lrc.tnu.edu.vn 25 Losen M., Frölich B., Pohl M., & Büchs J (2004) "Efect of oxygen limitaton and medium composition on Escherichia coli fermentaton in shake-flask cultures" Biotechnology Progress, 20(4), pp.1062–1068 26 MacWilliams M P., & Bickle T A (1996) "Generaton of new DNA binding specificity by truncation of the type IC EcoDXXI hsdS gene." The EMBO Journal, 15(17), pp.4775–4783 27 Mofatt BA, Dunn JJ, & Studier FW (1984) "Nucleotde sequence of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase", 173(2), pp.265–269 28 Monod J (1949) "The Growth of Bacterial Cultures" Annual Review of Microbiology, 3(1), pp.371–394 29 Morgan D A., Ruscetti F W., & Gallo R (1976) "Selective in vitro growth of T lymphocytes from normal human bone marrows" Science (New York, N.Y.), 193(4257), pp.1007–1008 30 Oona Mcpolin (2009) "Preview - An Introducton to HPLC for Pharmaceutcal Analysis - Preview_book_introducton_HPLC.pdf" 31 Peter Boyle B L (2008) World Cancer Report 32 R J Robb R M K (1984) "Amino acid sequence and post-translatonal modificaton of human interleukin 2" Proceedings of the Natonal Academy of Sciences of the United States of America, 81(20), pp.6486–90 33 Roche S (2010, December) Interleukin-2, human (hIL-2) recombinant (E coli) 34 Rosenberg S A., Yang J C., Topalian S L., Schwartzentruber D J., Weber J S., Parkinson D R., Seipp C A., Einhorn J H., & White D E (1994) "Treatment of 283 consecutve patents with metastatc melanoma or renal cell cancer using high- dose bolus interleukin 2" JAMA, 271(12), pp.907–913 35 Safar M., & Junghans R P (2000) "Interleukin maintains biologic stability and sterility over prolonged time" Immunopharmacology, 49(3), pp.419–423 36 Schnaitman C A., & Austn E A (1990) "Eficient incorporaton of galactose into lipopolysaccharide by Escherichia coli K-12 mutatons." Journal of Bacteriology, 172(9), pp.5511–5513 62 http://www.lrc.tnu.edu.vn strains with polar galE 37 Sim M., Seok H.-S., & Kim J (2013) "A Next-generaton Sequence Clustering Method for E Coli through Proteomics-genomics Data Mapping" Procedia Computer Science, 23, pp.96–101 38 Swinehart D F (1962) "The Beer-Lambert Law" Journal of Chemical Educaton, 39(7), pp.333 39 Taniguchi T., Matsui H., Fujita T., Takaoka C., Kashima N., Yoshimoto R., & Hamuro J (1992) "Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2 1983" Biotechnology (Reading, Mass.), 24, pp.304–309 40 Tincat C., d’Arminio Monforte A., & Marchetti G (2009) "Immunological mechanisms of interleukin-2 (IL-2) treatment in HIV/AIDS disease" Current Molecular Pharmacology, 2(1), pp.40–45 41 Titov K S., Kiselevskii M V., Demidov L V., Mikhailova I N., Shubina I Z., Rodionova L M., Sinel’nikov I E., Topol’ K Y., & Gritsai A N (2009) "Use of recombinant interleukin-2 for intrapleural therapy of tumor-associated pleurisy" Bulletn of Experimental Biology and Medicine, 148(5), pp.794–796 42 Ulrik Mouritzen, Christance Voit (2012) "Neoadjuvant treatment of cancer with proleukin" 43 WHO (2004, May 28) 1st Standard for INTERLEUKIN (Human, Jurkat derived) NIBSC code: 86/504 44 William Bowers (2001) "CELL-MEDIATED IMMUNITY: Cell interactons in specific immune responses" 45 Yin J., Li G., Ren X., & Herrler G (2007) "Select what you need: a comparatve evaluaton of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes" Journal of Biotechnology, 127(3), pp.335–347 46 DrugBank (Ed.) (2013) "Aldesleukin" In DrugBank 47 "Renal Cell Cancer Treatment" (2015) Natonal Cancer Insttute 48 "Melanoma Treatment" (2015) Natonal Cancer Institute 49 "World Health Organizaton, World Cancer Report 2014" (2014) SEARO 50 "Melanoma - Cancer Council Australia" (2015) 51 DrugBank (Ed.) (2015, November 28) "Aldesleukin" In DrugBank 63 http://www.lrc.tnu.edu.vn Internet 52 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/ 53 http://www.cancer.gov/about-cancer/what-is-cancer 54 http://www.cancerresearch.org/cancer-immunotherapy/ 55 http://vietbao.vn/Suc-khoe/Canh-giac-voi-benh-ung-thu-than/40127601/248/ 56 http://www.newhealthadvisor.com/Renal-Cell-Carcinoma-Staging.html 57 http://www.melanomacenter.org/basics/statstcs.html 58 http://www.atcc.org/products/all/TIB-214.aspx 59 http://www.ispe.org/gmp-resources/what-is-gmp 60 http://www.isovietnam.com.vn/tu-van-quan-ly-doanh-nghiep/dao-tao-tu-van-gdpgpp/95-teu-chuan-gmp-glp-gsp-gdp-gpp.html 61 http://vesinhantoanthucpham.com.vn/lich-su-hinh-thanh-san-xuat-tot-gmp 62 http://www.vinmec.com/tn-tuc-hoat-dong/so-luoc-tong-quan-tinh-hinh-ung-thu- tai- viet-nam-a404.html 63.http://www.nihbt.org.vn/tn-trong-nuoc/sung-sot-vi-benh-nhan-ung-thu-tangnhanh/p124i6718.html 64.http://www.nhandan.com.vn/mobile/_mobile_suckhoe/_mobile_tntucsk/item/2820 1702.html 65.http://info.ebioscience.com/bid/78957/What-does-ED50-Mean 66 http://www.cancer.gov/types/skin/hp/skin-genetcs-pdq 67 http://sbc-vietnam.com/Tin-tuc/YEAST-EXTRACT-MUA-O-%C4%90AU.aspx 64 http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌCLIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Le Phuong Hoang Anh, Dao Trong Khoa, Nguyen Thi Minh Thu, Phung Thu Nguyet, Phan Thi Thanh Huyen, Truong Nam Hai (2015) Purificaton of recombinant human interleukin-2 National Conference Vietnam Associaton of Biochemistry 74 Lê Phương Hoàng Anh, Nguyễn Thị Minh Thu, Đào Trọng Khoa, Phùng Thu Nguyệt, Trần Ngọc Tân, Lưu Anh Chiến, Đoàn Thị Thủy, Trương Nam Hải (2015) Tinh chế xác định hoạt tính sinh học interleukin-2 người tái tổ hợp dạng cải biến Hội nghị khoa học kỷ niệm 40 năm (1975-2015) thành lập Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam 13 Nguyễn Thị Minh Thu, Lê Phương Hoàng Anh, Đào Trọng Khoa, Trần Ngọc Tân, Nguyễn Minh Nga, Lưu Anh Chiến, Đoàn Thị Thủy, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2015) Nghiên cứu tổng hợp interleukin-2 người tái tổ hợp hệ thống lên men 10 (lít) theo têu chuẩn GMP Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(3): 1-10 65 http://www.lrc.tnu.edu.vn PHỤ LỤC P hụ lục I.Trình tự vector pET22b(+) mang gen il-2 cải biến loại alanine đầu N (ký hiệu pET22_IL-2_desAla) 66 http://www.lrc.tnu.edu.vn P hụ lục II.Hướng dẫn thực hành tốt sản xuất sinh phẩm 67 http://www.lrc.tnu.edu.vn 68 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ... nghệ sản xuất IL -2 tái tổ hợp chuyển giao sang công ty để sản xuất thử nghiệm cần thiết Trong trình nghiên cứusản xuất IL -2 người tái tổ hợp, trình tự amino acid IL2 cải biến nhằm tạo sản phẩm Interleukin- 2. .. thấp thương phẩm Proleukin Trên sở chúng tơi tến hành thực đề tài: Nghiên cứu sản xuất Interleukin- 2 người tái tổ hợp dạng cải biến dòng tế bào Escherichia coli điều kiện GMP Đề tài thực Công ty... tái tổ hợp tế bào E coli hệ thống lên men 10 lít .27 2. 2 .2 Phá tế bào E coli xử lý IL -2 thô (tiền tinh chế) 27 2. 2.3 Tinh chế IL -2 sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 28 2. 2.4 Xác