Nghiên cứu nhân giống lan long tu bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro

Cây phân loại dựa trên chỉ thị trnL của mẫu lan nghiên cứu TTP11 với các loài đã được công bố trên Genbank .... Cây phân loại dựa trên chỉ thị matK của mẫu lan nghiên cứu TTP9 với các

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

ĐÀO VĂN KIÊN

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN LONG

TU BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số : 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Chu Hoàng Hà

HÀ NỘI, 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

ĐÀO VĂN KIÊN

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN LONG TU

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số : 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Chu Hoàng Hà

HÀ NỘI, 2016

Sinh-Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS La Việt giảng viên trường ĐHSP Hà Nội 2; TS Phạm Bích Ngọc, Th.S Hoàng Đăng Hiếu - phòng Công nghệ tế bào thực vật đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Hồng-Xin cảm ơn sinh viên Nguyễn Nguyệt Quỳnh đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thí nghiệm tại Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật trường ĐHSP

Hà Nội 2

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, các bạn bè, những người đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng 11 năm 2016

Học viên

Đào Văn Kiên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu nhân giống lan Long tu bằng

kỹ thuật nuôi cấy in vitro” là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả

cùng cộng tác với cộng sự khác Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 11 năm 2016

Tác giả

Đào Văn Kiên

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Giới thiệu về chi lan Dendrobium 6

1.1.1 Hệ thống phân loại 6

1.1.2 Đặc điểm hình thái 7

1.1.3 Phân bố vùng sinh thái 9

1.1.4 Giá trị của lan Dendrobium 11

1.2 Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam 13

1.3 Nhân giống in vitro 14

1.3.1 Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro 14

1.3.2 Ý nghĩa của nhân giống in vitro 15

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro 17

1.3.5 Quy trình sản xuất cây cấy mô 22

1.3.6 Thành tựu nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam 24

1.4 Ứng dụng DNA barcode vào việc xác định loài 25

1.4.1 Giới thiệu DNA barcode 25

1.4.2 Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode 26

1.4.3 Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở thực vật 27

1.4.4 Tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật 30

Chương 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Vật liệu 32

2.2 Dụng cụ hóa chất 32

2.3 Phương pháp nghiên cứu 32

2.3.1 Nhận dạng loài Dendrobium sp bằng kỹ thuật DNA Barcode 32

2.3.2 Nhân giống lan Dendrobium sp bằng kỹ thuật nuôi cấy mô 33

2.3.3 Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 36

2.3.4 Phương pháp phân tích thống kê 36

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

3.1 Kết quả nhận dạng loài bằng chỉ thị DNA 37

3.1.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 37

3.1.2 Kết quả nhận dạng loài dựa trên các trình tự trnL, matK và ITS 38

3.2 Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro 42

3.2.1 Nhân nhanh protocorm và tạo chồi từ protocorm 42

3.2.2 Nhân chồi 46

3.2.3 Tạo rễ - hình thành cây 50

3.2.4 Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

NCBI National Center for Biotechnology Information

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thông tin các mồi sử dụng trong nghiên cứu 33 Bảng 3.1 Hệ số tương đồng của mẫu nghiên cứu và của các loài đã được

công bố trên ngân hàng Genbank dựa trên chỉ thị trnL 38

Bảng 3.2 Hệ số tương đồng của mẫu nghiên cứu và của các loài đã được

công bố trên ngân hàng Genbank dựa trên chỉ thị matK 39

Bảng 3.3 Hệ số tương đồng của mẫu nghiên cứu và của các loài đã được

công bố trên ngân hàng Genbank dựa trên chỉ thị ITS 41

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh protocorm

của loài D transparens 43

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tạo chồi từ protocorm

của D transparens 44

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của KIN lên khả năng nhân chồi của D transparens

sau 8 tuần nuôi cấy 47

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân chồi của lan Long tu

sau 8 tuần nuôi cấy 48

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi

của D transparens sau 8 tuần nuôi cấy 49

Bảng 3.9 Ảnh hưởng NAA đến khả năng tạo rễ in vitro của lan Long tu

sau 6 tuần nuôi cấy 51

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ in vitro D

transparens sau 6 tuần nuôi cấy 52

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Một số loài Phong lan thuộc chi Dendrobium 12

Hình 3.1 Điện di kiểm tra 37

Hình 3.2 Cây phân loại dựa trên chỉ thị trnL của mẫu lan nghiên cứu

(TTP11) với các loài đã được công bố trên Genbank 39

Hình 3.3 Cây phân loại dựa trên chỉ thị matK của mẫu lan nghiên cứu

(TTP9) với các loài đã được công bố trên Genbank 40

Hình 3.4 Cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS của mẫu lan nghiên cứu (TTP12)

với các loài đã được công bố trên Genbank 41

Hình 3.5 Protocorm phát sinh từ protocorm của D transparens 44

Hình 3.6 Chồi phát sinh từ protocorm của D transparens trên môi

trường MS +10% ND 45

Hình 3.7 Chồi in vitro của D transparens sau 8 tuần nuôi cấy trên môi

trường MS + 0,5 mg/l KIN 47

Hình 3.8 Chồi in vitro của D transparens sau 8 tuần nuôi cấy trên môi

trường MS (a) + 2,0 mg/l BAP, (b) + 0,5 mg/l BAP 49

Hình 3.9 Chồi in vitro của D transparens sau 8 tuần nuôi cấy trên môi

trường MS + 1,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA 50

Hình 3.10 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro D

transparens sau 6 tuần nuôi cấy 51

Hình 3.11 Ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ in vitro D

transparens sau 6 tuần nuôi cấy 53

Hình 3.12 D transparens in vitro rèn luyện ngoài tự nhiên 54

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Từ xưa tới nay, Phong lan được biết đến như một thứ hoa đại diện cho

sự cao quý Hoa Phong lan vô cùng đa dạng về chủng loại, mỗi loài đều mang những vẻ đẹp khác nhau, muôn hình vạn sắc nhưng tất cả trong chúng đều ánh lên một vẻ đẹp của sự trong sáng, vẻ đẹp hoàn hảo, tinh tế và vô cùng thanh cao Từ những loài Phong lan ẩn mình dưới tán lá cây rừng, cho đến các giò Phong lan treo mình trên vách núi đá cao vời vợi đều mang đến hơi thở của núi rừng hoang dại, vẻ mộc mạc hoang sơ nhưng lại gần gũi thiết tha Đối với những người chơi Phong lan bằng tâm hồn thì đây là một thú chơi tao nhã

và lành mạnh, sẽ khiến tâm trạng con người được thư thái, hay đơn giản hơn

ta có thể bắt gặp ở bất cứ nơi đâu nếu cần một không gian đẹp và sang trọng,

ở đó có sự xuất hiện của hoa Phong lan [14]

Ngoài giá trị về vẻ đẹp thẩm mỹ, Phong lan còn được biết đến như là một trong những vị thuốc Đông y khá phổ biến trong nhiều bài thuốc chữa bệnh Có thể kể đến như: Phong lan Thạch hộc có tác dụng chữa ho, đầy hơi, gầy còm [10]; Phong lan Kim tuyến được coi là “vua của thuốc” hoặc “cỏ vàng” thường được sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường, cao huyết áp, bệnh tim, viêm phổi, viêm gan cấp và mãn tính, viêm thận và các bệnh khác

Với giá trị như vậy, Phong lan hứa hẹn mang lại nguồn doanh thu khổng lồ cho ngành sản xuất, kinh doanh loại mặt hàng này Cùng với sự phát triển của ngành trồng lan trong thời gian qua, loài hoa quý này không chỉ làm giàu cho người nông dân mà còn làm đẹp hơn hình ảnh của Việt Nam trong con mắt du khách quốc tế Trong những loài Phong lan mang lại giá trị kinh tế

cao ở nước ta có thể kể đến các loài thuộc chi Dendrobium, đây là một trong

những chi thực vật phổ biến nhất trên thế giới, chi này có khoảng 1200-1500 loài phân bố rộng khắp ở Châu Á, Bắc Australia và New Zealand Các loài

thuộc chi này sinh trưởng nhanh, dễ dàng tái sinh thế hệ mới, hoa đẹp, ra hoa quanh năm [19] Ngoài giá trị thương mại, một số loài lan thuộc chi

Dendrobium còn là thành phần của các bài thuốc truyền thống ở Trung Quốc

và Ấn Độ [48]

Cũng chính vì những lợi ích to lớn mà Phong lan nói chung, các loài

Phong lan thuộc chi Dendrobium nói riêng mang lại đã làm cho loài hoa này

trong tự nhiên bị con người săn lùng và khai thác một cách triệt để, rất nhiều giống Phong lan rừng quý hiếm đang đến gần nguy cơ của sự tuyệt chủng Trong tự nhiên, các loài lan sinh trưởng chậm, tái sinh chủ yếu bằng hạt Tuy nhiên, khả năng nảy mầm tự nhiên của hạt lan là cực kì thấp Do đó, sự phục hồi của các quần thể lan ở rừng tự nhiên là rất khó [6], [7] Đứng trước thực trạng này, việc nhân giống cung cấp cho sản xuất và bảo tồn vốn gen của những loài lan quý hiếm càng trở nên cấp thiết Để giải quyết vấn đề này, việc áp dụng nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô là một giải pháp hữu ích, đây là phương pháp nhằm cung cấp số lượng lớn cây lan giống sạch bệnh trong một thời gian ngắn cho nghiên cứu và sản xuất

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua hơn một trăm năm hình thành và phát triển, đem lại giá trị to lớn cho loài người Hiện nay, hầu hết các cơ sở nghiên cứu giống cây trồng trên thế giới đều áp dụng công nghệ này với các mục đích khác nhau Ở Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng từ giữa những năm 70 của thế kỷ XX Trong bước đầu nghiên cứu và ứng dụng đã đạt kết quả khả quan đối với một số đối tượng cây trồng như chuối, khoai tây, mía, lúa…, đặc biệt

là Phong lan

Trong quá trình nghiên cứu nhân giống Phong lan, đặc biệt là áp dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thì việc xác định rõ nguồn gốc loài nghiên cứu nuôi cấy là việc làm rất quan trọng bởi nếu nhầm lẫn sẽ định hướng áp

dụng sai các kỹ thuật nuôi cấy và kết quả cuối cùng sẽ không nhân được giống loài Phong lan mong muốn Việc phân loại các loài trong chi

Dendrobium thường rất khó khăn do chúng có đặc điểm cơ quan sinh dưỡng

tương đồng, số lượng loài trong chi lớn, nhiều đặc điểm hình thái giữa các loài chồng lấn Trong những năm gần đây, với sự ra đời của các nghiên cứu

về hệ thống học phân tử , nhiều phương pháp phân tích đã cho kết quả nhanh

và chính xác Để phân loại sinh vật, phương pháp phân loại truyền thống chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái Hiện nay, công cụ phân tử dựa trên trình

tự DNA của các phân đoạn gen chuẩn hay còn gọi là DNA barcode được phát triển mạnh mẽ để phân loại sinh vật ở mức độ loài [18]

Nhằm mục đích nhận dạng loài Phong lan có tên địa phương là Long tu

(Dendrobium sp.) và tiến hành nhân giống in vitro loài Phong lan này chúng

tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân giống lan Long tu bằng kỹ thuật

nuôi cấy in vitro” Công trình này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh

lý thực vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2 Mục đích nghiên cứu

- Nhận dạng mẫu lan Long tu nghiên cứu bằng kỹ thuật DNA Barcording

- Xác định nồng độ Kinetin (KIN) bổ sung vào môi trường nuôi cấy MS

có ảnh hưởng tốt nhất đến khả năng nhân nhanh protocorm của lan Long tu

- Xác định tỉ lệ thể tích nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy MS

có ảnh hưởng tốt nhất đến khả năng tạo chồi từ protocorm của lan Long tu

- Xác định nồng độ của KIN, BAP và tổ hợp BAP kết hợp NAA bổ sung lần lượt từng loại vào môi trường nuôi cấy MS có ảnh hưởng tốt nhất

đến khả năng nhân chồi in vitro của lan Long tu

- Xác định nồng độ của NAA và IAA bổ sung lần lượt từng loại vào

môi trường nuôi cấy MS có ảnh hưởng tốt nhất đến khả năng tạo rễ in vitro

của lan Long tu

- Đánh giá sự sinh trưởng của lan Long tu sau giai đoạn in vitro trên giá

thể xơ dừa khô ngoài điều kiện tự nhiên

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Sử dụng kỹ thuật DNA Barcording nhận dạng mẫu Phong lan nghiên cứu

- Khảo sát sự sinh trưởng của mẫu Phong lan nghiên cứu trên các môi

trường nuôi cấy in vitro có bổ sung liều lượng và các loại chất điều hòa sinh

trưởng khác nhau

- Khảo sát sự sinh trưởng của mẫu Phong lan nghiên cứu trên giá thể xơ dừa khô

4 Đối tượng nghiên cứu

Quả Phong lan có tên địa phương là Long tu (Dendrobium sp.) do

Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật (Khoa Sinh - KTNN, ĐHSP Hà Nội 2) thu tại Trạm Đa dạng sinh học Mê Linh

5 Phạm vi nghiên cứu

5 1 Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

- Thực hiện các thí nghiệm nhận dạng loài bằng chỉ thị phân tử tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Thực hiện các thí nghiệm nuôi cấy in vitro tại Phòng thí nghiệm Sinh

lý thực vật, khoa Sinh - KTNN ,trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

5.2 Nghiên cứu ngoài điều kiện tự nhiên

Đánh giá sự sinh trưởng của lan Long tu (Dendrobium sp.) giai đoạn ex vitro trên giá thể xơ dừa khô ngoài điều kiện tự nhiên tại vườn ươm của Khoa

Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

6 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp nhận dạng loài bằng kỹ thuật DNA Barcode

- Phương pháp nhân giống thực vật lan bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

- Phươn pháp rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên

- Phương pháp phân tích thống kê

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về chi lan Dendrobium

Dendrobium có tên từ chữ Hy Lạp ghép lại: Dendro (cây) và bios (cuộc sống) để chỉ dòng lan sinh sống trên các cành cây cao Tên gọi Dendrobium

đã được nhà thực vật người Thụy Điển Swartz đưa ra lần đầu tiên vào năm

1799 trong “Nova Acta Regiae Societatis Scientiarum Upsaliensis 6” Từ đó đến nay hầu hết các nhà nghiên cứu hoa lan đều dùng tên gọi này, chi lan

Dendrobium theo danh pháp tiếng Việt có tên gọi là chi lan Hoàng Thảo [8]

Tuy nhiên, từ trước đó Loureiro đã công bố hai loài có tên gọi là

Ceraia simplicissima và Callista amabilis trong “Flora Cochinchinensis" (1970) mà các nhà nghiên cứu sau này xếp vào chi Dendrobium Tên gọi Ceraia và Callista ít được quan tâm nên sau này nó trở thành tên đồng nghĩa của Dendrobium [43]

Đại đa số các nhà phân loại như Lindley (1830), Reichenbach (1861), Bentham và Hooker (1883), Pfitzer (1890), Holttum (1953), Seidenfaden

(1985) đều chia Dendrobium thành các nhóm khác nhau (section) Song cũng

có vài tác giả chọn cách phân chia chi Dendrobium thành các phân chi

(subgennus) như Kraenzlin [42], [43]

Nghiên cứu phân loại chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) ở Việt Nam

thường dựa trên hệ thống của Seidenfaden (1985) Hệ thống này rõ ràng, không phức tạp, có độ tin cậy cao và phù hợp với các đại diện của chi lan

Dendrobium ở Việt Nam [7], [8]

Với khoảng 1200-1500 loài khác nhau đòi hỏi nhiều cách chăm sóc khác nhau, nguyên do là vì chúng du nhập từ nhiều địa danh khác nhau: Nhật Bản, Triều Tiên và Newzealand, đặc biệt là Guinea là nơi sản sinh ra nhiều

loài Dendrobium nhất [1]

Ở Việt Nam, Dendrobium có khoảng hơn 100 loài, xếp trong 14 tông

được phân biệt bằng thân , lá và hoa [12]

1.1.2 Đặc điểm hình thái

a Thân

Là các cây thân thảo, mọc nhóm, đứng thẳng hoặc rủ thõng phân đốt, sống phụ sinh trên các cây gỗ hoặc ít gặp các loài sống bám trên đá, trong

rừng ẩm Thân của các đại diện chi lan Dendrobium đều phân đốt, hình trụ,

hình chùy, hình trứng, có chiều dài thay đổi từ 3cm đến 120cm hoặc đôi khi hơn, kích thước phổ biến là 20 - 50 cm [7]

Thân có thể mảnh, đôi khi dẹp bên hoặc là dày mập lên Phần dày mập lên của thân gồm một vài lóng ở sát gốc hoặc sát ở đỉnh Đôi khi phần dày lên

có hình con suốt có 4 gờ sắc Ở cá biệt vài loài chỉ có các mấu dày lên, còn

lóng thì hầu như không, làm thân có dạng tràng hạt (D pendulum) hoặc sự dày lên là dần dần độc lập ở mỗi lóng làm thành dạng đùi gà nối tiếp (D nobile, D wardianum) Phần tận cùng là gốc, nơi xuất phát của rễ, thường là

nhỏ mảnh nhưng cũng không ít trường hợp phình to ra [2], [8]

b Lá

Lá mọc thành hai dãy so le nhau, không có cuống mà chỉ có bẹ ôm thân, ít khi không có bẹ Lá phân bố suốt dọc thân nhưng ở nhiều đại diện lá tập trung 2 - 5 chiếc ở đỉnh thân, cũng có khi phần đỉnh thân chỉ có hoa mà

không có lá (D acinaciforme, D dalatense) Tùy loài mà lá có thể còn tồn tại

hoặc rụng đi trước khi hoa nở Số lượng lá thay đổi từ rất nhiều đến khi chỉ còn 3 - 5, hiếm khi 2 hoặc 1

Lá thường cứng, dạng da, bóng, ít khi nạc và mềm, bề mặt thường nhẵn, đôi khi bề mặt bẹ và lá (thường là khi lá còn non) có phủ lông cứng ngắn màu đen sớm rụng Lá nguyên, mép nhẵn, màu xanh có các gân hình cung Lá thường hình mác, bầu dục, đôi khi hình kiếm, hình thuôn hoặc ít khi

lá hình thoi dài Đỉnh lá nhọn hoặc tù, rất nhiều trường họp lá xẻ 2 thùy nhọn,

tù hoặc là tròn lệch nhau Chiều dài của lá thay đổi từ l - 19cm và chiều rộng

lá từ 0,3 - 3,5 cm Lá hình trụ thường có bề dày (đường kính) từ 0,2 - 0,4cm [2], [7]

c Hoa

Hoa thường là nhiều hoa, đôi khi ít hoa hoặc hoa đơn độc Nhóm hoa dài thường rủ thõng xuống, nhiều loài mang nhóm hoa đẹp có giá trị làm cảnh rất cao [7]

Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên Màu sắc hoa đa dạng, sặc sỡ Hoa đa

số các loài có hương thơm Bao hoa chia hai vòng, vòng ngoài gồm 1 lá đài giữa và 2 lá đài bên, vòng trong gồm có 2 cánh hoa và 1 cánh môi

d Quả

Quả nang thường là hình chùy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều hạt nằm xen lẫn những sợi lông mảnh Khi quả già, gặp trời ẩm sợi này sẽ hút nước và trương lên, phá vỡ vỏ quả giải phóng hạt ra ngoài Hạt rất nhỏ, hầu như không trọng lượng, bao quanh hạt là lớp màng, dạng mắt võng, trong

suốt, chứa đầy không khí, dễ dàng bay cùng hạt trong không khí nhờ gió

So với những chi gần cận là Flickingeria, Epigenium, Eria thì Dendrobium có những đặc điểm phân biệt căn bản sau đây:

- Các đại diện của chi Dendrobium luôn mọc nhóm và có thân phân đốt

chứ không mọc đơn độc trên thân rễ và chỉ có 1 lóng như các đại diện của

Rễ của các đại diện chi lan Dendrobium là rễ khí sinh, thường mảnh,

hình trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thường ôm lấy giá thể hoặc buông thõng xuống Độ dày của rễ từ 0,1- 0,3cm Rễ thường mọc ra từ

phần gốc của thân hoặc đôi khi có thể ở mấu thân một vài loài (D Bilobulatum; D parcum…) [7], [8].

1.1.3 Phân bố vùng sinh thái

Chi Dendrobium trên thế giới phân bố chủ yếu ở lục địa Đông Nam Á

và các đảo thuộc Philippin, Malaixia, Inđônêxia, Đông Bắc Ôxtrâylia

(Dressler, 1981) Riêng ở Việt Nam, chi lan Dendrobium đã phát hiện gồm

hơn 100 loài phân bố chủ yếu ở vùng nói suốt từ Bắc, Trung, Nam và ở trên một số đảo ven biển nước ta [7], [20] Có thể kể đến một số loài điển hình là đại diện của các vùng miền trên khắp đất nước như:

Vùng Đông Bắc: Hoàng Thảo Ri vơ (D rivesti), Hoàng Thảo Mỡ gà (D haveyanum), Hoàng Thảo Tuyết mai (D crumenatum Sw)

Vùng Tây Bắc: Hoàng Thảo Sợi (D tenellum Ldl), Hoàng Thảo Mỹ dung (D devodianum Paxt), Hoàng Thảo Thủy tiên (D.farmeri Paxt), Hoàng

Thảo Gai dài (D longicornu Ldl), Hoàng Thảo Ý ngọc (D transparens)

Vùng Trung du Bắc Bộ: Hoàng Thào Vảy rồng (D lindleyi), Hoàng Thảo Giả hạc (D Superbuni Rchb.f), Hoàng Thảo Hợp (D.fimbriatum Hook), Hoàng Thảo Xoắn(D tortile Ldl), Hoàng Thảo Tam Đảo (D dơoense)

Vùng Đồng bằng Bắc Bộ: Hoàng Thảo Lệch (D aduncum Wall),

Hoàng Thảo Dẹt (D nobile Ldl), Hoàng Thảo Trúc (D hancockii), Hoàng

Thảo Thái Bình (D moschatum)

Vùng Bắc Trung Bộ: Hoàng Thảo Xoắn (D tortile Ldl), Hoàng Thảo Long nhãn (D fimbriatum), Hoàng Thảo Tím huế (D hercoglossum Rchb.f), Hoàng Thảo Tiểu hộc (D podagraria Hook.f), Hoàng Thảo Nanh sấu (D terminale Par et Rchb.f)

Vùng duyên hải Trung Bộ: Hoàng Thảo Bạch nhạn (D oxyanthum Gagn), Hoàng Thảo Phong tuyết lan (.D tenellum Lindl)

Vùng Tây Nguyên: Hoàng Thảo Tua (D hadveyanum Reichb.f), Hoàng Thảo Bạch hỏa hoàng (D hadveyanum Reichb.f), Hoàng Thảo Bạch nhạn (D formosum Roxb), Hoàng Thảo Long nhãn (D fimbriatum Hook), Hoàng Thảo Ngọc lan (D pierardii), Hoàng Thảo Ý thảo (D gratiosissimum Reichb.f), Hoàng Thảo Xươg cá (D kentrophylium Hook.f), Hoàng Thảo Môi tơ (D delacourii Guill), Hoàng Thào Vani (D aduncum), Hoàng Thảo Đại bạch hạc (D christyanum)

Vùng Đông Nam Bộ: Hoàng Thảo Móng rùa (D anceps Sw), Hoàng Thảo Thạch hộc vôi (D cretaceum Lindl), Hoàng Thào Trụ cứng (D caryaecoium Guill), Hoàng Thào Trúc lan (D cathcartii Hook.f)

Vùng đồng bằng Nam Bộ: Hoàng Thảo Lá cong (D.acinaciforme

Roxb)

Các đại diện của chi Hoàng Thảo chủ yếu sống phụ sinh trên thân hoặc cành cây ở trong rừng hoặc trên các hốc mùn trên đá, thường ở nơi ẩm, mọc ở

độ cao 500 - 1500m so với mực nước biển, nhưng có khi gặp chúng mọc ở độ cao từ 200m - 2000m [7], [20], [42]

1.1.4 Giá trị của lan Dendrobium

Lan Hoàng Thảo là một chi có ý nghĩa kinh tế lớn bởi rất nhiều loài trong chi có dáng cây đa dạng, hoa đẹp để trồng làm cảnh Lan Hoàng Thảo

có khả năng thích nghi rộng với điều kiện sống, phân bố rất rộng nên có ý nghĩa thương mại lớn Đặc biệt có nhiều loài là đặc hữu, được đưa vào Sách

đỏ Việt Nam rất quý hiếm như Ngọc vạn vàng (D chrysanthum), Thạch hộc môi răng (D devonianum) (Hình 1.1a,b) [20] Ngoài ý nghĩa làm cảnh, một số loài Hoàng Thảo cũng là một vị thuốc dân tộc cổ truyền Các loài D nobile,

D gratiosissimum, D crumenatum (Hình 1.1d,e) được dùng để chữa sốt

nóng, khô cổ, bứt rứt, kém ăn, giảm thị lực Các vị thuốc từ Hoàng Thảo có tên Shih-Hu hay Shiliu có vị ngọt, tính hàn có tác dụng bồi bổ cơ thể, tăng lực, bồi bổ dạ dày, gây tiết nước bọt, tăng sự ngon miệng Đó cũng là bài thuốc dùng khi sốt cao, khát nước và đổ mồ hôi trộm, đuối sức [3], [24] Nhiều nghiên cứu cho thấy những loại canh mọi người thuờng dùng như canh hành tây, canh cà chua, canh cà rốt nếu cho thêm một số vị thuốc Đông y trong đó có lan Hoàng Thảo sẽ có tác dụng phòng chống ung thư rất tốt Lan

D primulinum (Hình 1.1c) ngoài được trồng làm cảnh vì dáng cây mềm mại,

hoa dày đặc trên giả hành không có lá, nở nhiều vào dịp Tết Nguyên Đán thì giả hành của loài này có tính mát nên được dùng để làm thuốc trị bỏng lửa, tê liệt nửa người, bệnh mẩn ngứa Thân của Hoàng Thảo Thạch hộc môi răng có

vị ngọt, nhạt, hơi mặn, tính hàn, có tác dụng tư âm tích vị, sinh tân chỉ khát nên thường dùng để chữa bệnh sốt cao, tổn thương bên trong cơ thể, miệng khô [24], [29], [34]

Hình 1.1 Một số loài Phong lan thuộc chi Dendrobium

(a): D devonianum, (b): D chrysanthum, (c): D primulinum,

(d): D crumenatum, (e): D nobile

Trước đây “Vua chơi lan, quan chơi trà” thể hiện thú chơi lan chỉ dành cho các bậc Đế vương Ngày nay, nhu cầu tiêu thụ cũng như thưởng thức loài hoa vương giả này ngày càng trở nên phổ biến Lan Hoàng Thảo cũng không nằm ngoài nhu cầu chung của người tiêu dùng, đặc biệt vào các dịp lễ, Tết…

Nước ta là nước có điều kiện thuận lợi cho các loài lan sinh trưởng và phát triển, cho nên hoa lan đã được nhân dân ta thuần hoá và trồng từ lâu đời Càng ngày các loài lan càng trờ nên phong phú và đa dạng nhờ được bổ sung các giống lai mới do lai tạo và nhập nội Đối với người Việt Nam, hoa lan là hình ảnh gần gũi và thân thiết vì nó là loài hoa vừa đẹp vừa dễ trồng Trồng lan không những là thú vui tiêu khiển bồ ích giúp con người hòa hợp với thiên

nhiên mà còn là nghề đưa lại nguồn thu nhập kinh tế khá cao Nó phù hợp với

tình hình kinh tế của nước ta hiện nay, tạo điều kiện để mở rộng các mặt hàng

xuất khẩu và giải quyết công ăn việc làm cho mọi người ở mọi lứa tuổi Ngoài

ra trồng lan tốn ít đất, không phải sử dụng đất của nông nghiệp Trồng lan còn tạo vùng cây xanh cho gia đình, làm không khí thêm trong lành, góp phần tích cực báo vệ môi truờng, nhất là ờ thành phố Trồng lan còn nâng cao cuộc sống tinh thần cùa chúng ta, giúp ta biết hưởng thụ và cảm nhận cái đẹp, biết yêu và bảo vệ thiên nhiên [14]

1.2 Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam

Cây hoa lan được biết đến đầu tiên ở Phương Đông là loài Kiến lan Theo tác giả Bretchacidor thì từ đời vua Thần Nông 2800 trước công nguyên,

ở Trung Quốc loài lan này đã được dùng làm thuốc chữa bệnh Sau đó, cùng với vẻ đẹp và hương thơm của nó kết hợp với công dụng chữa bệnh nên loài hoa này đã có mặt ờ châu Âu Tại đây, người ta đã tiến hành nhiều nghiên cứu khá công phu và tỉ mỉ về hoa lan [45]

Các thế kỷ XVI - XVII, những người châu Âu đặc biệt là người Anh đã

đi khắp thế giới nghiên cứu, sưu tập cây cỏ Trong thời kỳ này, nhiều loài lan nhiệt đới đã được đưa về nước Anh Năm 1794 ở Anh, người ta đã biết được

15 loài lan nhiệt đới Đầu thế kỳ XX, kỹ thuật gieo trồng hoa lan từ hạt bằng nhiều nấm cộng sinh có từ cây lan mẹ bắt đầu một giai đoạn mới đối với nghề nuôi trồng lan Đặc biệt là đưa kỹ thuật lai tạo áp dụng vào giống lan, tạo ra những cây lan lai có vẻ đẹp về màu sắc và hình dạng duyên dáng hơn hẳn cây

bố mẹ Năm 1856, nhà làm vườn người Anh tên là Fohn Domini đã lai tạo

thành công loài hoa lan Calanthe dominii bằng cách lai C masutra và C furcata Năm 1960, lần đầu tiên Morel đã thực hiện thành công nhân giống vô

tính bằng phương pháp nuôi cấy mô trên đối tượng lan Kiếm thuộc nhóm lan

đa thân [31] Ngày nay, các loài lan đã xếp thành hệ thống phân loại chung gọi là Orchidaceace, lan rừng đã xác định được 750 chi và hơn 25.000 loài tự

nhiên và có hơn 30.000 loài lan lai [30]

Trước đây, các nghiên cứu về hình thái học chù yếu tập trung vào các nghiên cứu nhằm thống kê toàn bộ họ của phong lan như công trình nghiên cứu của Dressier, 1993 Sau này các nghiên cứu tiến hành nghiên cứu về đa dạng di truyền dựa trên sự kết họp giữa hình thái và chi thị phân tử như

RAPD, RFLP, AFLP, SSR , giải trình tự các vùng ITS, matK Đây là một

phương pháp rất phổ biến để xác định mối quan hệ di truyền cùa các giống loài lan phục vụ cho công tác phân loại, bảo tồn, chọn và lai tạo giống mới [51], [55], [59]

1.3 Nhân giống in vitro

1.3.1 Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro

Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật Theo ông, mỗi tế bào được lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa

bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả năng giống như một hợp tử ban đầu

Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào Khả năng biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ quan của cơ thể Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các

tế bào chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh

ra nó - tế bào phôi Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra Đối với thực vật, khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc [46]

Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì được kiểu gen của mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa Nhưng ngay từ khi ra đời, công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích

nhân giống của con người Vậy tại sao lại phải tiến hành nhân giống in vitro?

Chúng ta hãy xem xét những ý nghĩa to lớn mà nó mang lại cho nhân loại

1.3.2 Ý nghĩa của nhân giống in vitro

Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống

vô tính Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa

sinh học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống

vô tính in vitro là công cụ vô cùng hữu ích

Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính, ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ, nên

có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp Hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém

Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế

giới cũng như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương

pháp này có nhiều ưu điểm nổi trội như:

- Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong

phạm vi 36 đến 1012 / năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào [5]

- Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống hệt với cây bố mẹ ban đầu Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc

ưu việt nào đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế

- Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh Trong công tác nhân giống, vấn

đề được quan tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn toàn sạch virus

- Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt

kém trong những điều kiện sinh thái nhất định Như ở cây cọ dầu, phải mất 10

- 15 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống

mới rất khó khăn Nhưng bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có

thể cung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm

- Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và chiếu sáng, nhiệt độ… nên có thể sản xuất quanh năm trong một dây truyền sản xuất liên tục

- Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội

- Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen Bên cạnh những ưu điểm

trên, nhân giống in vitro vẫn không tránh khỏi một số nhược điểm như:

- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Nhiều loài thực vật quý hiếm chưa thể tiến hành nhân giống do gặp khó khăn liên quan tới lý thuyết nuôi cấy và tái sinh thực vật

- Chi phí sản xuất cao do nhân giống in vitro đòi hỏi trang thiết bị hiện

đại và lao động có tay nghề

- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình mà nguyên nhân là do biến

dị soma, đã làm cho các cây con không giữ được kiểu hình của bố mẹ (đặc biệt là khi nuôi cấy từ callus) Trong quá trình nuôi cấy, các mô tế bào thực vật thực hiện quá trình phản biệt hóa rồi lại biệt hóa để cho ra cây hoàn chỉnh Mỗi đối tượng thực vật có đặc tính khác nhau, do đó có những cách thức biến đổi khác nhau, mặc dù kết quả cuối cùng là tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một phương thức chung cho tất cả các thực vật

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro

1.3.3.1 Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy

Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một ấn đề cần thiết,

vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn, nấm… Nhưng, do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nhiên liệu ban đầu

Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy

Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy Với hypoclorite, người ta thường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm

Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ

đây giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu Thành phần của môi trường nuôi cấy

có ảnh hưởng quyết định tới nuôi cấy

1.3.3.2 Ảnh hưởng của các thành phần hóa học

Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây

trong các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ Môi trường dinh dưỡng phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó là nước Các nhân tố vật lý như nhiệt độ,

pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann… Trong đó môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng, bao gồm cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm Thông thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa học sau:

Các nguyên tố khoáng

Tùy theo nồng độ sử dụng, các nguyên tố khoáng được chia vào hai nhóm là nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng

Chất hữu cơ bổ sung

• Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa

• Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái, amino acid, aLanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết

Nguồn cacbon

Saccharose thường được sử dụng làm nguồn cacbon do đó những đặc tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định Ngoài ra, các loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được

sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường saccharose

Đường đóng góp khoảng 50-70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường [52] Thông thường đường saccharose được sử dụng ở nồng độ 0,2-0,3

%, nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dòng), có khi tăng lên đến 12 % (gây cảm ứng stress nước) Tỷ lệ sống 95-100 % sau một tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không có đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương pháp truyền thống [15]

Chất điều tiết sinh trưởng

• Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử

Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hóa sự

phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi…[32]

• Cytokinin kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của tế bào, cảm ứng hình thành chồi phụ và loại bỏ ưu thế ngọn Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin được dùng để kích thích sựn phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ [5]

Than hoạt tính

Than hoạt tính ban đẫu được bỏ sung vào môi trường nuôi cấy để cố gắng mô phỏng điều kiện trồng trọt, sau đó nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng của than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy mô thực vật Đó là: sự hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, ảnh hưởng tới pH, xúc tác

bẻ gãy đường saccharose trong khử trùng Ngoài ra than cũng hút các chất hữu cơ như phytohormone, vitamin, sắt, kẽm,…[53]

Điều tra tác dụng của than hoạt tính, sự khử trùng, và môi trường nuôi cấy trong thủy phân đường cho thấy, sự thủy phân của đường trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào cả ion H+ và sự khử trùng và thành phần than hoạt tính Sau khử trùng, ở môi trường MS + 5 % saccharose bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ đường thủy phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 %, còn ở môi trường không có than hoạt tính là 20 % [47]

Như vậy than hoạt tính có ảnh hưởng rõ ràng tới môi trường nuôi cấy,

nhiều nghiên cứu đã cho thấy tác dụng kích thích của mô in vitro như kích

thích tạo củ của hoa Lili, tác dụng hình thành rễ ở Pawlownia [4]

Các chất hữu cơ bổ sung

Nước dừa là thành phần khá phổ biến trong nhiều môi trường nuôi cấy Tất cả phân tích thành phần của nước dừa từ non tới già cho thấy trong nước dừa có: amino acid, acid hữu cơ, đường, RNA, DNA, Inositol, auxin, cytokinin,… Hàm lượng sử dụng của nước dừa từ 10-20 % [16]

1.3.3.3 Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý

Các yếu tố vật lý chính là ánh sáng, nhiệt độ, độ pH, trạng thái môi trường,…

Ánh sáng

Trong môi trường nuôi cấy, quang tổng hợp không phải là một hoạt động cần thiết do sự có mặt của đường trong môi trường, nhưng ánh sáng cần thiết để điều hòa một số quá trình liên quan tới phát sinh hình thái của cây Tùy từng loại nuôi cấy, yêu cầu cường độ cũng như thời gian chiếu sáng khác nhau, ví dụ như khi nuôi cấy mô sẹo, thường không cần ánh sáng Ánh sáng còn ảnh hưởng tới sinh trưởng của mô nuôi cấy thông qua tác động nên trạng thái và cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng cũng như dinh dưỡng khoáng Thông thường trong phòng nuôi cấy người ta sử dụng ánh sáng huỳnh quang chiếu sáng 14-15 giờ/ngày với cường độ 2000 lux

Nhiệt độ

Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy mô thường được điều chỉnh ổn định từ 22-25 oC Tuy nhiên tùy từng loại nuôi cấy và đối tượng nuôi cấy mà có sự điều chỉnh nhiệt độ phù hợp Theo nhiều nghiên cứu trong nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào với mục đích sản xuất các hợp chất thứ sinh thì sự điều chỉnh nhiệt độ rất có ý nghĩa, cảm ứng cho tế bào sinh trưởng, phân chia và tiết các hợp chất thứ sinh Nhiệt độ còn ảnh hưởng tới nuôi cấy thông qua tác đông tới cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng như IAA, GA3,…

pH môi trường

pH của môi trường cũng là một yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng tới trạng thái lý hóa của các chất trong môi trường, do đó ảnh hưởng tới khả năng điện ly của các muối, sự thủy phân hóa các chất… Thông thường pH được điều chỉnh ở mức 5,5 - 5,8

Trạng thái môi trường

Sự phát triển của mô có thể bị thay đổi hoàn toàn nếu chúng nuôi cấy trên một môi trường đặc, lỏng hoặc nửa lỏng Các mô nuôi cấy thường sinh trưởng tốt hơn trong môi trường lỏng, tuy nhiên môi trường lỏng cũng gây ra hiện tượng thủy tinh hóa, các mô nuôi cấy bị mọng nước gây khó khăn cho cấy chuyển và ra cây

1.3.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện ra cây

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình sản xuất một cây giống in vitro Mục đích của giai đoạn này nhằm đưa cây giống in vitro trong phòng

nuôi ra ngoài tự nhiên; huấn luyện cây thích nghi với các điều kiện nhiệt độ,

độ ẩm, ánh sáng tự nhiên và chuyển từ chế độ dị dưỡng sang chế độ tự dưỡng

Mỗi loài cây có đặc điểm khác nhau, do đó để đạt tỷ lệ cây sống cao cần nghiên cứu để tìm giá thể phù hợp cho cây Giá thể trồng cây có thể là cát, đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo chứa đất, mùn cưa và bọt biển…

Cây nuôi cấy in vitro có đặc điểm là các khí khổng luôn mở Vì vậy,

khi chuyển cây ra vườn ươm, cây thường bị mất nước rất nhanh, do đó cần phải che phủ cẩn thận và cung cấp đủ độ ẩm cho cây bằng cách phun sương Cần cung cấp cho cây lượng nước vừa đủ, lượng nước quá ít hoặc quá nhiều đều có ảnh hưởng không tốt cho cây

Ngoài ra, ở giai đoạn đầu đưa ra ngoài vườn ươm, bộ rễ của cây nuôi

cấy in vitro thường chưa có khả năng hấp thụ các chất ding dưỡng từ giá thể

Để tăng chất lượng của cây giống, có thể sử dụng các dung dịch dinh dưỡng

để tưới cho cây

1.3.4 Quy trình sản xuất cây cấy mô

Cho đến nay, việc nhân giống in vitro đã được áp dụng cho nhiều loại

đối tượng nuôi cấy (khoảng 400 loài) Quy trình nuôi cấy trải qua 4 giai đoạn chính như sau [5], [46]:

Tạo vật liệu nuôi cấy khởi đầu in vitro;

Nhân nhanh và tái sinh chồi, cụm chồi in vitro;

Tạo cây hoàn chỉnh, huấn luyện cây non;

Chuyển cây ra trồng ngoài điều kiện tự nhiên

1.3.4.1 Tạo vật liệu nuôi cấy khởi đầu in vitro

Đây là giai đoạn đầu tiên trong quy trình, cần đặc biệt chú ý vì những đặc tính của mẫu cấy sẽ được duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này Cần chọn lọc cây mẹ ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao; trên cây mẹ tiến hành chọn cơ quan, mô để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non…

Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu

và điều kiện khử trùng Mỗi loài cây có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu Với các cây cận nhiệt đới và nhiệt đới thì nhiệt độ

25oC, độ ẩm 75 % là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp

1.3.4.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc vào trạng thái tuổi của tế bào mẫu nuôi cấy, càng gần trạng thái phôi sinh thì khả năng tái sinh càng lớn Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính

có đặc tính gần như phôi hữu tính

1.3.4.3 Nhân nhanh chồi và cụm chồi

Cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy, vì vậy thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh Môi trường ở giai đoạn này cần bổ sung các hormone sinh trưởng (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên từ 16 giờ/ ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux, nhiệt độ thích hợp là từ 20 - 30oC

Quy trình cấy chuyển nhân nhanh chồi thông thường diễn ra trong khoảng 1-2 tháng tùy từng loại cây Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển đạt khoảng 2 - 8 lần/ 1 lần cấy chuyển Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma Ví dụ từ một chồi cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên khoảng 2000 –

3000 chồi cây sau 7 - 8 lần cấy chuyển, đối với các cây khác như mía, cúc, hoa phong Lan sau một năm có thể nhân được trên 1 triệu chồi từ một cây mẹ ban đầu

1.3.4.4 Tái sinh rễ và tạo cây hoàn chỉnh

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ Môi trường tái sinh rễ thường được bổ sung auxin (NAA, IBA, 2,4-D) ở liều lượng thích hợp Tuy nhiên, một số cây như chuối thì sự hình thành rễ tốt hơn ở môi trường không có chất sinh trưởng

1.3.4.5 Chuyển cây ra vườn ươm

Các cây nuôi cấy in vitro sau khi đã tái sinh hoàn chỉnh sẽ được chuyển

ra ngoài vườn ươm Cây chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng Vì vậy, cần huấn luyện cho cây thích nghi với sự thay đổi của môi trường

1.3.5 Thành tựu nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam

Nuôi cấy mô trên thế giới đã có từ rất lâu đời và đến nay đã có các thành tựu rất đáng kể như: vào năm 1978, Melchers lai tạo thành công cây lai giữa Khoai tây và Cà chua bằng dung hợp tế bào chất; năm 1990, Vasil và cộng sự tái sinh cây lúa mì hoàn chỉnh từ nuôi cấy tế bào trần Vasil và cộng

sự (1991) báo cáo về tạo cây lúa mì chuyển gen bằng súng bắn gen vào các phôi non; hay như năm 1994, cây cà chua Favr-savr chuyển gen được chấp nhận cho buôn bán ở Hoa Kỳ,

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật được phát triển ở Việt Nam ngay sau khi chiến tranh kết thúc (1975) Phòng nuôi cấy mô và tế bào thực vật đầu tiên được xây dựng tại viện sinh học, Viện khoa học Việt Nam do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu Bước đầu chỉ nghiên cứu sự phát triển của túi phấn, mô sẹo và protoplast, nhưng sự thành công thì chỉ có ở 2 cây là lúa và khoai tây Tiến đến những năm 80 trở lại đây thì nuôi cấy mô phát triển khá mạnh mẽ và kết quả khích lệ đã đạt được ở các giống: chuối, dứa, mía, hồng, cúc, phong lan,…

Như kỹ thuật tạo cây lan Cymbidium giống sạch bệnh bằng xử lý nhiệt

và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của Nguyễn Văn Uyển và ctv (1984) Bước đầu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống lan Hồ điệp của Cung Hoàng Phi Phượng và ctv Tiến xa hơn là tạo ra giống lan mới bằng

kỹ thuật gây đột biến nhân tạo hoa lan cắt cành Dendrobium bằng tia gamma

của Lê văn Hòa và ctv Chuyển gen phát sáng GFP (Green Flourescent

Protein) vào cây Lilium oriental hybrid “siberia” nhờ vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens của Nguyễn Thị Lý Anh và ctv…khối lớn có hoạt chất sinh học

được tạo ra vẫn giữ nguyên được hoạt tính của mình

1.4 Ứng dụng DNA barcode vào việc xác định loài

1.4.1 Giới thiệu DNA barcode

Kỹ thuật DNA barcode hay “DNA mã vạch” là kỹ thuật dựa vào việc

sử dụng một khu vực DNA (400-800 bp) như là một tiêu chuẩn để nhận dạng các loài một cách nhanh chóng và chính xác Kỹ thuật DNA mã vạch giúp các nhà phân loại học trong công tác phân loại và xác định loài, nâng cao năng lực kiểm soát, hiểu biết và tận dụng sự đa dạng sinh học

Trong vài thập kỷ gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp

và kỹ thuật sinh học phân tử đã tạo ra các công cụ hữu hiệu cho các nghiên

cứu sự sống ở mức độ phân tử Các kỹ thuật sinh học phân từ cũng nhanh

chóng được ứng dụng trong nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học, nhận dạng loài, tạo ra các lĩnh vực khoa học mới như tiến hóa phân tử, di truyền và bảo tồn loài Đặc biệt, đối với lĩnh vực phân loại học, việc sử dụng các DNA chỉ thị để nhận dạng loài đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những đóng góp đáng kể trong việc phân loại loài Nhận dạng loài bằng chỉ thị DNA hay “DNA barcode” là một khái niệm tương đối mới mẻ Đó là công cụ phục vụ nhận dạng loài một cách chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng DNA chuẩn hay còn gọi là

chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode ) Xác định loài bằng DNA chỉ

thị sẽ cho mức độ chính xác cao và đặc biệt hữu dụng với các loài gần gũi và những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để nhận dạng hoặc phân biệt loài [27]

Trong nghiên cứu này, việc thu thập mẫu lan Long tu ngoài tự nhiên

làm nguyên liệu cho nuôi cấy là một việc cần thiết Tuy nhiên nguồn nguyên liệu ngoài tự nhiên nếu chỉ dựa vào hình thái và kinh nghiệm dân gian đôi khi

dễ nhầm lẫn với những đối tượng cây có hình thái tương tự sống tại cùng một khu vực Điều này có ảnh hưởng không nhỏ đến nghiên cứu Do đó việc nhận dạng các mẫu cây ngoài tự nhiên bằng phương pháp sinh học phân tử sẽ mang ý nghĩa rất quan trọng

1.4.2 Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode

Đặc điểm quan trọng nhất của DNA barcode là phải phổ biến và đặc hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng Điều này có nghĩa là các đoạn gen được sử dụng như một barcode nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có

sự biến đổi giữa các loài nhưng ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi không đáng kể Do đó, DNA barcode lý tưởng là một đoạn DNA có trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp được với cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để

dễ dàng khuếch đại bằng PCR

Quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực vật gặp nhiều khó khăn Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối với chỉ thị DNA và hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi

ITS (Internal Transcribed Spacer) thường được sử dụng làm DNA chỉ thị

trong một số nghiên cứu [23] Tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để định danh loài đối với thực vật [26]

Theo Taberlet P và cs (2007), hệ thống mã vạch DNA lý tưởng phải đáp ứng các yêu cầu sau đây:

- Thứ nhất, đoạn DNA chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt giữa các loài nhưng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong cùng loài

- Thứ hai, hệ thống định danh bằng DNA phải được chuẩn hóa, với cùng một vùng DNA có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau

- Thứ ba, đoạn DNA chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có thể dễ dàng định danh loài vào các nhóm phân loại (chi, họ,…)

- Thứ tư, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mồi nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự DNA

- Đoạn DNA nghiên cứu nên có kích thước ngắn để quá trình nhân bản DNA không bị sai lệch Thông thường, đoạn DNA nghiên cứu có kích thước

150 bp trở lại, nếu dài hơn sẽ dễ bị sai lầm trong quá trình nhân bản DNA

1.4.3 Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở thực vật

1.4.3.1 Trình tự gen nhân

Các trình tự barcode được nhân bản từ DNA hệ gen của bố mẹ dự kiến

sẽ cung cấp nhiều hơn thông tin về các loài cần xác định Tuy nhiên khó khăn trong việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc

có bản sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lượng DNA genome và khả năng phân biệt dưới loài do bảo toàn gen chức năng có thể chính là lý do tại sao hạn chế số lượng các gen nhân được thử nghiệm trong xác định loài bằng phương pháp DNA barcode [54]

1.4.3.2 Vùng gen mã hóa ribosome

Gen rDNA là hệ thống đa gen mã hóa phần RNA của ribosome Các gen DNA ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome

18S, 5,8S, 28S và xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal

transcribed spacers) nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S Vùng mã hóa của ba

gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS Nhìn chung các đơn vị rDNA

được lặp lại hàng nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm

sắc thể Một trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống đa gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khác biệt giữa các loài khác nhau

Hiện tại, nrITS vùng ITS của gen nhân được xem là một trong những

công cụ hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì

nó phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chức năng Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản

vô tính cho thấy một số mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 do nhiều nguyên nhân như lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao

và hình thành gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó Trên

cơ sở này nrDNA có thể được sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả thực vật trong cùng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm, lâu năm, trên cạn, dưới nước) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [54]

1.4.3.3 Trình tự gen lục lạp

Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử DNA mạch vòng có kích thước 120 - 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large single-copy region) và bản sao đơn nhỏ (small single-copy region) Hai bản sao được phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau (IRa và IRb) có độ dài trung bình 20

- 30 kb Hệ gen lục lạp chứa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao), các gen tRNA (35 gen) và các gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp trong lục lạp (khoảng 100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng

Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng loài

do vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật được các nhà khoa học rất quan tâm Dựa trên những thông tin có sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu gần đây, một số locus là đoạn gen hay các gen được chọn để nghiên cứu làm

chỉ thị barcode tiềm năng cho các loài thực vật trên trái đất Có khoảng 20 gen lục lạp có độ dài phù hợp (khoảng 1 kb) được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài Các gen này chứa đựng nhiều mức độ tiến hoá và vì vậy phù hợp cho nhiều mức độ phân loại [54]

1.4.3.4 Trình tự gen matK

Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hoá nhanh

nhất, có kích thước khoảng 1550 bp và mã hóa cho enzyme maturase liên quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA

Do matK tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã được sử

dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh

loài ở thực vật CBOL đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy

rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng

một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng matK là một trong những locus barcode

chuẩn cho thực vật [54]

1.4.3.5 Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA)

Locus trnL (UAA) - trnF (FAA) chứa gen trnL (UAA), vùng intron và vùng nằm giữa hai gen trnL (UAA) và trnF (GAA) Taberlet và đtg là nhóm nghiên cứu đầu tiên sử dụng trnL trong các nghiên cứu hệ thống học thực vật Vùng không mã hoá trnL(UAA) và trnF (GAA) không phải là vùng có sự

biến đổi lớn nhất của DNA lục lạp nhưng có ưu thế như cấu trúc bậc 2 với vùng biến đổi và vùng bảo thủ xen kẽ nhau Điều này tạo thuận lợi cho các nghiên cứu tìm kiếm trình tự nucleotide ở các vùng bảo thủ để thiết kế mồi và

sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại các đoạn gen ở vùng biến đổi Trong

nghiên cứu để xác định trnL (UAA) intron có nên được sử dụng làm vùng DNA barcode, Taberlet (2007) đã sử dụng 100 loài thực vật và kết luận rằng trnL intron có thể sử dụng như là một barcode của thực vật, trnL-trnF là một

barcode tiềm năng cho phân tích, xác định các loài thực vật [54], [60]

1.4.4 Tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật

Trọng tâm nghiên cứu barcode ở thực vật chủ yếu là về đánh giá hiệu quả tương đối của của các đoạn gen chỉ thị đã được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực vật gặp nhiều khó khăn Hệ gen ty thể ở thực vật thường quá bảo thủ nên không được dùng cho chỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang nhiều đặc điểm mong muốn đối với chỉ thị DNA như ở hệ gen ty thể ở động vật Ở hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal Transcribed Spacer) cũng được sử dụng làm DNA chỉ thị trong một

số nghiên cứu [23]

Mặc dù một vài locus trong hệ gen lục lạp và gen nhân đã được nghiên cứu làm chỉ thị trong nghiên cứu DNA barcode song kết quả thu được vẫn có những hạn chế Điều này cho thấy việc cần thiết sử dụng kết hợp các locus để

bổ sung cho nhau đem lại hiệu quả cao hơn trong đánh giá, phân loại các loài

thực vật Trên thực tế từ lâu rbcL đã được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài, bên cạnh đó trình tự gen matK có tỷ lệ tiến hóa cao nhất trong các gen

lạp thể cũng có khả năng phân biệt loài cao Trên cơ sở đó CBOL đã kết hợp

hai locus của rbcL và matK mang lại hiệu quả cao (70% sự phân biệt loài) và

giảm nhiều chi phí cho các điều tra về xây dựng mối quan hệ cũng như phân loại đánh giá các loài thực vật Hiệu quả kết hợp giữa hai gen này thích hợp cho các nghiên cứu như là điều tra tương tác thực vật - động vật, xác định các loài cây được bảo vệ, các cuộc khảo sát đa dạng sinh học quy mô lớn và phân biệt cây giống trong các chương trình tái sinh rừng phân biệt và cho mục đích xác định loài và phân loại [54]

Spooner sau khi xem xét hiệu quả của psbA - trnH, matK, nrITS trên 63 loài khoai tây dại đã chỉ ra rằng trình tự của psbA - trnH, matK và nrITS không cung cấp đầy đủ các thông tin về loài cụ thể Gen lạp thể không cho