Nghiên cứu nhân giống in vitro lan phi điệp từ hạt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN NGUYỄN THỊ HỒNG HUẾ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN PHI ĐIỆP TỪ HẠT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Hà Nội, 2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN NGUYỄN THỊ HỒNG HUẾ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN PHI ĐIỆP TỪ HẠT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dẫn khoa học : TS LA VIỆT HỒNG Hà Nội, 2016 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS La Việt Hồng – Khoa Sinh KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tận tình hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn tới Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện để hoàn thành khóa luận Trong thời gian thực đề tài nhận giúp đỡ tận tình cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật giúp đỡ, đóng góp ý kiến để hoàn thành đề tài khóa luận, nhân xin gửi lời cảm ơn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, Phòng thí nghiệm Thực vật- trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi thiết bị, phương tiện để hoàn thành khóa luận Cảm ơn gia đình bạn bè động viên, góp ý cho qua trình học tập hoàn thành đề tài Hà Nội, 20 tháng 04 năm 2016 Sinh viên NGUYỄN THỊ HỒNG HUẾ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa công bố Hà Nội, 20 tháng 04 năm 2016 Sinh viên NGUYỄN THỊ HỒNG HUẾ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Mục đích nhiệm vụ nghiên cứu Ý nghĩa lí luận ý nghĩa thực tiễn: Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chi Hoàng Thảo (Dendrobium) 1.1.1 Giới thiệu chung chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Điều kiện sinh thái 1.2 Giá trị kinh tế hoa lan 1.3 Giới thiệu loài lan Phi điệp (Dendrobium anosmum Lindl.(1845)) 1.4.Tình hình sản xuất hoa lan giới Việt Nam 10 1.4.1 Tình hình sản xuất hoa lan giới 10 1.4.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ lan Việt Nam 12 1.5 Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium giới Việt Nam 15 1.5.1 Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium giới 15 1.5.2 Tình hình nghiên cứu chi Dendrobium Việt Nam 17 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 19 2.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 19 2.3.1 Thiết bị 19 2.3.2 Dụng cụ 19 2.4 Môi trường nuôi cấy 19 2.6 Phương pháp nghiên cứu 20 2.6.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 20 2.6.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.7 Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm 23 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Tạo vật liệu khởi đầu - khử trùng bề mặt 24 3.2 Nhân nhanh chồi in vitro 26 3.2.1 Ảnh hưởng KI đến trình nhân nhanh chồi lan Phi điệp in vitro 26 3.2.2 Ảnh hưởng BAP đến trình nhân nhanh chồi lan Phi điệp in vitro 28 3.2.3 Ảnh hưởng BAP kết hợp NAA đến trình nhân nhanh chồi lan Phi điệp in vitro 30 3.3 Tạo rễ - hình thành in vitro hoàn chỉnh 31 3.4 Rèn luyện in vitro thích nghi điều kiện tự nhiên 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 42 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Công thức thí nghiệm tạo vật liệu khởi đầu Bảng 2.2 Công thức ảnh hưởng KI đến trình nhân nhanh chồi in vitro Bảng 2.3 Công thức ảnh hưởng BAP đến trình nhân nhanh chồi in vitro Bảng 2.4 Công thức ảnh hưởng BAP kết hợp NAA đến trình nhân nhanh chồi in vitro Bảng 2.5 Công thức ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả hình thành rễ Bảng 3.1 Hiệu dung dịch Javen khử trùng bề mặt Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ KI đến trình nhân chồi lan Phi điệp Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến trình nhân chồi lan Phi điệp Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP kết hợp NAA đến trình nhân chồi lan Phi điệp Bảng 3.5 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ chồi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Lan Phi điệp - Dendrobium anosmum Lindl Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu Hình 3.1 Vật liệu khởi đầu Hình 3.2 Tái sinh chồi lan Phi điệp in vitro Hình 3.3 Mẫu cấy môi trường bổ sung BAP (5ml/l) bị dị hình, vàng Hình 3.4 Rễ chồi lan Phi điệp in vitro Hình 3.5 Rèn luyện môi trường tự nhiên DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NAA: α- Napthlacetic acid KI: Kinetin IBA: Indol 3- butyric acid IAA: - Indole - acetic acid BAP: 6- Benzyl amino purin MS: Murashige Skoog Nxb: Nhà xuất Tp.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Họ Phong lan họ lớn thực vật có hoa với 800 chi 25.000 loài Hoa lan đánh giá cao vẻ đẹp lôi cuốn, quyến rũ đa dạng kích thước, hình dạng, màu sắc Hiện nay, hoa lan chiếm 8% thị phần ngành thương mại hoa giới có tiềm thay đổi tình hình kinh tế quốc gia [32] Tuy nhiên, nhiều loài lan tự nhiên có xu hướng giảm ảnh hưởng bất lợi điều kiện môi trường nạn khai thácquá mức Hiện sở nhân giống nước đa phần nhân giống tự nhiên tách chồi cắt giâm đoạn thân với hệ số thấp nhập giống in vitro từ nước Với kỹ thuật nhân giống nuôi cấy mô tế bào thực vật, có ưu điểm khả nhân giống nhanh với hệ số nhân cao thời gian ngắn, nhân từ nhiều phận khác thực vật, tạo giống bệnh Ưu điểm nuôi cấy mô giúp cho việc nảy mầm hạt lan Một lan chứa hàng triệu hạt có vài hạt nảy mầm tự nhiên hạt nội nhũ nảy mầm phụ thuộc vào cộng sinh với loài nấm cụ thể [45] Phương pháp nuôi cấy không cộng sinh phát triển sau nghiên cứu Knudson [36], hạt lan nảy mầm môi trường muối khoáng đơn giản có chứa đường Phương pháp trở thành kỹ thuật chuẩn cho nảy mầm hạt lan [41, 45] nhiều công trình nghiên cứu nhân giống loài lan sử dụng Cymbidium aloifolium, Dendrobium hookerianum… [42, 53, 54] Với công nghệ nhân giống in vitro hệ số nhân giống từ lan lớn, từ vài nghìn đến triệu [18] Lan Phi điệp có tên gọi khác như: Hoàng thảo đùi gà, Hoàng thảo cẳng gà, Hoàng thảo dẹt, Huỳnh thảo, Co vàng sào (Thái), lan Giả Hạc…hiện nghệ nhân Việt Nam giới ưa chuộng Do loài lan có hoa to, đẹp, lại có hương thơm [14, 63] Hiện thị trường nước lan Phi điệp với đơn vị nhỏ phải giá trăm ngàn, đơn Bảng 3.2 Ảnh hưởng KI đến trình nhân nhanh chồi lan Phi điệp Công thức Số chồi/mẫu Số lá/chồi K1 1,55 ± 0,28d 5,44 ± 0,28a K2 1,67 ± 0,25d 4,34 ± 0,25b K3 2,33 ± 0,25bc 4,22 ± 0,45b K4 3,44 ± 0,28a 4,11 ± 0,11b K5 3,55 ± 0,28a 3,89 ± 0,36bc K6 2,33 ± 0,22bc 3,78 ± 0,45bc K7 2,00 ± 0,51cd 3,34 ± 0,25c LSD0,05 0,58 0,59 Trong cột, chữ theo sau khác a, b, c… thể sai khác có ý nghĩa thống kê với α=0,05 3.2.2 Ảnh hưởng BAP đến trình nhân nhanh chồi lan Phi điệp in vitro KI có ảnh hưởng tích cực đến khả tái sinh chồi từ mẫu nuôi cấy chưa cao Vì vậy, tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng loại cytokinin khác đến khả tái sinh chồi BAP Kết sau 12 tuần nuôi cấy trình bày bảng 3.3 hình 3.2 BAP chất điều hòa sử dụng phổ biến nhân nhanh chồi Kết sau 12 tuần nuôi cấy trình bày bảng hình Phân tích bảng cho thấy sau 12 tuần nuôi cấy, mẫu nuôi cấy môi trường B4, B5 môi trường có số chồi xuất nhiều đạt 4,11 chồi/mẫu (hình 3.2D), môi trường B1 môi trường có số chồi thấp (1,56 chồi/mẫu) (hình 3.2C) Về số lá, mẫu nuôi cấy môi trường B1 công thức cho số nhiều (5,44 lá/chồi), môi trường B7 cho số (2,56 lá/chồi) 28 Bảng 3.3 Ảnh hưởng BAP đến trình nhân nhanh chồi lan Phi điệp Công thức Số chồi/mẫu Số lá/chồi B1(ĐC) 1,55 ± 0,28c 5,44 ± 0,28a B2 1,67 ± 0,25c 4,44 ± 0,28b B3 2,78 ± 0,45b 4,34 ± 0,25b B4 4,11 ± 0,11a 4,22 ± 0,19b B5 3,67 ± 0,25a 4,00 ± 0,25b B6 2,67 ± 0,52b 2,78 ± 0,19c B7 1,89 ± 0,11c 2,56 ± 0,28c LSD0,05 0,56 0,53 Trong cột, chữ theo sau khác a, b, c… thể sai khác có ý nghĩa thống kê với α=0,05 Hình 3.3 Mẫu cấy môi trường bổ sung BAP (5ml/l) bị dị hình, vàng Như vậy, mẫu nuôi cấy môi trường MS có BAP nồng độ mg/l 1,5mg/l cho khả nhân chồi tốt Hiệu ĐC ngược lại BAP nồng độ cao không cho kết tốt có tượng di hình, cụ thể công thức B6, B7 với BAP tương ứng mg/l mg/l Kết nghiên cứu tương tự nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lan D lamellatum Lindl Fangmuang & Kongbangkerd (2012) [35] nghiên cứu ảnh hưởng BAP tới trình nhân nhanh chồi 29 D anosmumtừ chồi bất định Ngô Thị Nguyệt (2013) [7] Tuy nhiên kết nhân chồi in vitro có hệ số nhân cao hẳn, điều hoàn toàn hợp lý với nghiên cứu S Tuhuteru cs tìm môi trường tối ưu cho nhân nhanh Dendrobium anosmum bổ sung 10% nước dừa vào môi trường nuôi cấy [59] 3.2.3 Ảnh hưởng BAP kết hợp NAA đến trình nhân nhanh chồi lan Phi điệp in vitro Trong giai đoạn này, vai trò chất kích thích sinh trưởng quan trọng, hai nhóm chất kích thích sinh trưởng auxin cytokinin Một số công trình báo cáo giảm cảm ứng tái sinh môi trường có bổ sung NAA (Arditti & Ernst, 1993) [25] nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy kết hợp hai nhóm chất nồng độ thích hợp có tác dụng tốt việc nhân nhanh chồi tăng chất lượng chồi nhiều loài lan như: giống lan Paphiopedilum (Long et al., 2010) [32], Cymbidium aloifolium (L.) (Rajkarnikar et al., 2011) [54], D primulinum Lindl (Pant & Thapa, 2012) [52], D longicornu (Stadwelson et al., 2012) [58] Kết sau 12 tuần nuôi cấy mẫu lan Phi điệp ảnh hưởng BAP kết hợp NAA bảng 3.4 hình 3.2 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP kết hợp NAA đến trình nhân chồi lan Phi điệp Công thức Số chồi/mẫu Số lá/chồi BN1 2,36 ± 0,23c 4,14 ± 0,14 a BN2 4,14 ± 0,14b 3,43 ± 0,29b BN3 4,71 ± 0,24a 3,29 ± 0,24 b BN4 2,71 ± 0,24c 2,43 ± 0,29 c LSD0,05 0,58 0,54 Trong cột, chữ theo sau khác a, b, c… thể sai khác có ý nghĩa thống kê với α=0,05 Kết bảng cho thấy sau 12 tuần nuôi cấy, BN3 môi trường cho hệ 30 số nhân chồi cao 4,71chồi/mẫu (hình 2F) Trong môi trường BN1 có số chồi thấp 2,36 chồi/mẫu (hình 2E) lại có số cao 4,14 Như vậy, kết hợp NAA với BAP cho hiệu nhân chồi tốt Số chồi hình thành cao 4,71 chồi môi trường có 1,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA Kết thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ kinetin, BAP bổ sung NAA cho thấy chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP, Kinetin quan trọng cho việc tạo số lượng lớn chồi, điển hình công thức công thức đối chứng không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cho kết tạo chồi thấp Tuy nhiên, tượng công thức cho kết tạo chồi, điều có khả loài lan có chứa lượng cytokinin nội sinh cao nên tự tạo lượng chồi tương đối dù bổ sung BAP, KI vào môi trường 3.3 Tạo rễ - hình thành in vitro hoàn chỉnh Đối với nuôi cấy mô tế bào thực vật, auxin sử dụng để kích thích phân chia tế bào phân hóa rễ Những auxin thường dùng rộng rãi nuôi cấy mô tế bào thực vật NAA, IAA… NAA auxin hay sử dụng nông nghiệp nhân giống thực vật in vitro lẽ NAA có độ bền vững hóa học cao, có tác dụng kích thích sinh trưởng mạnh, kích thích hình thành rễ đặc biệt rễ bất định cành giâm, cành chiết mô nuôi cấy Để tăng khả rễ cho chồi giống Lan Phi điệp, tiến hành thí nghiệm với công thức môi trường MS có bổ sung nồng độ NAA khác Sau tuần nuôi cấy theo dõi thu kết bảng 3.5 hình 3.4 Bảng 3.5 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ chồi Công thức Số rễ/chồi Chiều dài rễ CT1 1,14d 0,42e CT2 1,43d 1,86c CT3 2,86c 0,86d 31 CT4 3,43b 0,63de CT5 5,29a 3,71a CT6 3,71b 3,28b LSD0,05 0,45 0,38 Trong cột, chữ theo sau khác a, b, c… thể sai khác có ý nghĩa thống kê với α=0,05 Hình 3.4 Rễ chồi in vitro lan Phi điệp a: Mẫu nuôi cấy môi trường bổ sung NAA 0,0 mg/l; b: Mẫu nuôi cấy môi trường bổ sung NAA 0,1 mg/l; c: Mẫu nuôi cấy môi trường bổ sung NAA 0,3 mg/l; d: Mẫu nuôi cấy môi trường bổ sung NAA 0,5 mg/l; e: Mẫu nuôi cấy môi trường bổ sung NAA 0,7 mg/l; f: Mẫu nuôi cấy môi trường bổ sung NAA 1,0 mg/l Kết cho thấy, môi trường có bổ sung NAA thúc đẩy trình hình thành phát triển rễ từ chồi in vitro Tuy nhiên mức nồng độ khác khả cảm ứng tạo rễ in vitro khác Đặc biệt, môi trường bổ sung NAA (0,7 mg/l) tỷ lệ khả hình thành rễ tốt đạt 5,29 rễ/chồi (hình 3E) Khi tăng nồng độ NAA bổ sung môi trường lên 1,0 mg/l số rễ/chồi lại giảm xuỗng, đạt 3,71 rễ/chồi tương tự mẫu cấy môi trường nuôi cấy có bổ sung NAA (0,5 mg/l) (hình 3D, F) 3.4 Rèn luyện in vitro thích nghi điều kiện tự nhiên Các bình Lan Phi điệp tái sinh hoàn chỉnh (cao 2,0 - 3,5 cm, có - rễ) chuyển từ phòng nuôi cấy điều kiện tự nhiên, có ánh sáng đầy đủ, nhiệt độ phòng khoảng 10 ngày để thích nghi dần Sau đó, 32 chuyển khỏi bình nuôi cấy, rửa môi trường, cắt ngắn rễ Cây trồng giá thể xơ dừa chế độ che sáng 50 % tưới nước phun sương Sau tuần, bắt đầu hình thành rễ hình thành Kết sau tuần theo dõi, cứng, xanh tỷ lệ sống sót đạt 89,8 % giá thể xơ dừa (hình 4) Hình 3.5 Rèn luyện môi trường tự nhiên Như vậy, sau thời gian tháng từ hạt lan gieo cấy cho lan hoàn chỉnh đưa vườn trồng 33 Quy trình nhân giống in vitro Lan Phi điệp từ hạt Etanol 70%+ Javen 20%/10 phút Ảnh Mẫu vô trùng Ảnh Quả lan tự nhiên MS tuần 12 tuần MS + 10% nước dừa + 1,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA Ảnh Chồi in vitro tuần tuổi Ảnh Nhân nhanh chồi in vitro tuần MS + 15% nước dừa + 0,7 mg/l NAA tuần Đưa tự nhiên Ảnh Tạo rễ - hình thành in vitro hoàn chỉnh Ảnh Rèn luyện in vitro tự nhiên 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Dựa vào kết thu từ thí nghiệm trên, rút số kết luận sau: 1.1 Sử dụng javen 20% 10 phút để khử trùng lan tạo vật liệu in vitro cho trình nhân giống lan Phi điệp Phương pháp đạt hiệu khử trùng cao với tỷ lệ mẫu sống vô trùng 81,25% 1.2 Môi trường MS có 30g/l saccarose, 7g agar/l, 10% nước dừa bổ sung BAP (1,5 mg/l) 0,2mg/l NAA thích hợp cho trình nhân nhanh chồi in vitro Số chồi hình thành đạt 4,71 chồi sau tuần nuôi cấy 1.3 Môi trường MS có 30g/l saccarose, 7g agar/l, 15% nước dừa bổ sung NAA (0,7 mg/l) thích hợp cho tạo rễ in vitro, đạt 5,29 rễ/chồi sau tuần nuôi cấy 1.4 Cây trồng giá thể xơ dừa chế độ che sáng 50% tưới nước phun sương sau tuần theo dõi, cứng, xanh tỷ lệ sống sót đạt 89,8% giá thể xơ dừa Kiến nghị 2.1 Tiếp tục nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu với hóa chất khác nhiều phận khác 2.2 Tiếp tục nghiên cứu môi trường nuôi cấy khác đến khả nhân nhanh chồi in vitro 2.3 Nghiên cứu thêm môi trường nảy mầm phát sinh protocorm hạt 2.4 Nghiên cứu thêm môi trường nhân nhanh protocorm 2.5 Nghiên cứu giai đoạn sau nuôi cấy in vitro giai đoạn vườn ươm với giá thể khác để biết khả sinh trưởng loại giá thể 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO *Tài liệu tiếng Việt Dương Công Kiên (2006), Nuôi cấy mô thực vật III, Nxb Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Đào Thanh Vân, Đặng Thị Tố Nga (2008), Giáo trình hoa lan, NXB Nông Nghiệp Đặng Văn Đông, Nguyễn Khê (2007), "Tương lai nghề sản xuất hoa, cảnh", Báo Nông nghiệp Việt Nam, tr 10, Nxb Tp HCM Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Hà Thị Thúy (2011), “Quy trình nuôi cấy tế bào lớp mỏng tái sinh giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) địa”, Báo cáo Đề tài khoa học công nghệ, Viện Di truyền Nông nghiệp Ngô Quang Vũ (2002), “Những số hấp dẫn thịtrường lan cắt cành giới”, tr 10, Tạp chí Hoa cảnh Ngô Thị Nguyệt, Hoàng Thị Thế, Tô Phương Thảo, Đinh Thu Huế, Đặng Thị Chinh, Nguyễn Thị Thu Trang, Trần Thùy Dung, Trần Thị Hà (2013), “ Thu thập lưu trữ nguồn gen ứng dụng công nghệ sinh học bảo tồn phát triển số loài lan quý Quảng Ninh”, Chương trình Nghiên cứu Khoa học phát triển Công nghệ năm tỉnh Qunag Ninh, Trung tâm khoa học sản xuất Lâm Nông nghiệp Quảng Ninh Nguyễn Công Nghiệp (2000), Trồng Hoa lan, Nxb Trẻ, Hà Nội, tr 17 268 Nguyễn Thị Kim Lý (2009), Hoa cảnh, Nxb Nông nghiệp Hà Nội 10 Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật, tr 179 -200, NXB Đại học quốc gia, Hà Nội 36 11 Nguyễn Xuân Linh (1998), Hoa kỹ thuật trồng hoa, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 12 Phạm Hoàng Hộ (2001), Cây cỏ Việt Nam, tr 814, NXB Trẻ, Tp HCM 13 Phan Thúc Huân (1989), Hoa lan, Cây cảnh vấn đề phát triển sản xuất, kinh doanh, xuất khẩu, Nxb Tp.HCM 14 Trần Hợp (1993), Phong lan có hương thơm, Nxb Khoa học kỹ thuật 15 Trần Hợp (1998), Phong lan Việt Nam, tr 84, Nxb Nông Nghiệp, Tp HCM 16 Trần Lan Hương, Trần Tuấn Anh, Phạm Thanh Hương (2006), Tìm hiểu giới thực vật, Nxb Giáo dục 17 Trần Văn Bảo (2002), Kỹ thuật nuôi trồng phong lan, Nxb Trẻ 18 Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển (2001), Cây Phong lan Dendrobium sp, Trường đại học Nông Lâm, Tp HCM 19 Viện nghiên cứu Rau (2009), Báo cáo tổng kết, kết thực đề tài “Thu thập đánh giá nguồn gen hoa lan Việt Nam lưu giữ chúng hai vùng Miền núi phía Bắc Đồng Bằng Bắc Bộ”, Hà Nội 20 Viện nghiên cứu Rau (2010), Báo cáo sơ kết, kết thực dựán sản xuất thử nghiệm “Hoàn thiện quy trình nhân giống sản xuất số giống hoa lan hồ điệp theo quy mô công nghiệp”, Hà Nội 21 Viện nghiên cứu Rau (2009), Báo cáo tổng kết, kết quảt hực đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ Đài Loan phát triển Rau Hoa Việt Nam”, Hà Nội 22 Việt Chương – KS Nguyễn Việt Thái (2002), Kỹ thuật trồng kinh doanh phong lan, Nxb Tp.HCM 23 Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Văn Giang (2010), “Ảnh hưởng giá thể trồng đến trình sinh trưởng lan Hoàng Thảo trúc đen (Dendrobium Hancockii Rolfe)”, Tạp chí khoa học phát triển 24 Vũ Quốc Luận, Dương Tuấn Nhựt (2007), “Bước đầu nghiên cứu khả 37 tạo chồi hoa Dendrobium Mild Yumi nuôi cấy in vitro”, Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn tạo giống hoa, Nxb Nông nghiệp, Tp.HCM * Tài liệu tiếng Anh 25 Arditti J, Ernst R (1993), Micropropagation of orchids, New York: John Wiley and Sons 26 Asghar S, Ahmad T, Hafi I.A and Yaseen M (2011), “ In vitro propagation of orchid (Dendrobium nobile) var Emma White”, African Journal of Biotechnology, 10(16): 3097 – 3103 27 Bo Long, Alex X Niemiera, Zhi-ying Cheng, Chun-lin Long, 2010 In vitro propagation (Orchidaceae), of Plant four Cell threatened Tissue Paphiopedilum species and Organ Culture (PCTOC),101(2):151-162 28 CBI (2007), The cut flower and foliage market in the EU, CBI market survey report, 1-20 29 Chen J T and Chang W C (2001), “Effect of auxins and cytokinins on direct somatic embryogenesis on leaf explant of Oncidium”, Plant Growth Reg, 34: 229-232 30 Chen J T and Chang, W C (2000), “Efficient plant regeneration through somaticembry genesis from callus cultures of Oncidium (Orchidaceae)”, Plant Sci, 160: 87-93 31 Chen JT and Chang WC (2002), “Effect of tissue culture conditions and explant characteristics on direct somatic embryogenesis in Oncidium Gower Ramsey”, Plant Cell Tiss Org Cult, 69: 41-44 32 Chugh S, Guha S, Rao I U, (2009) Micropropagation of orchids: A review on the potential of different explants Sci Hortic, 122: 507–520 33 Dai ChuanYun, Liu TengFei, Guan TianBing, Liu WanHong (2011), “Optimization of medium formula for the proliferation of Dendrobium candidum Wall ex Lindl Protocorm”, Medicinal Plant, 1-2 38 34 Ersan B, Mustafa C, Atalay S (2013) “In vitro germination, protocorm formation, and plantlet development of Orchis coriophora (Orchidaceae), a naturally growing orchid species in Turkey”, Turkish Journal of Botany, 37:336-342 35 Fangmuang W and Kongbangkerd A (2012), “Effect of plant growth regulators on development of in vitro shoot culture of Dendrobium lamellatum Lindl”, Phayao research conference, 96 - 102 36 George EF, Hall MA and Jan de Klerk G (2008), Plant propagation by tissue culture, 3rd Edition, Vol 1, The background Spinger the Netherlands 37 Goh C J and Loh, C S (1975), “Furtherobservations on meristem culture of Aranda Deborah”, Malayan Orchid Rev, 12: 10-13 38 Goh C J (1970), “Tissue culture of Vanda Miss Joaquim”, I Natl Acad Sci, 2: 31-33 39 Goh C.J (1973), “Meristem culture of Aranda Deborah”, Malayan Orchid Rev, 11: 10-15 40 He SL; DeZheng K, Qiu YS and QiXiang Z (2003) “Effect of carbon sources and organic compounds on the multiplication of Oncidiumaloha var Iwanaga protocorm-like body”, Lournal of Henan Agricultural University, 37:154-157 41 Hossain MM, Kant R, Van PT, Winarto B, Zeng SJ (2013), The application of biotechnology to orchids, Crit Rev Plant Sci, 32: 69–139 42 Jaime A., Teixeira da, Silva Elena A., Tsavkelova (2015), Asymbiotic in vitro seed propagation of Dendrobium, Plant Cell Reports, 34(10): 1685-1706 43 José Geraldo ZV, Keiko UL, Kaoro JY, Takashi GN, Tadeu F (2009), In vitro propagation and aclimatization of Cattleya Lindl (Orchidaceae) using banana pulp and coconut water, Científica, Jaboticabal, 37(1):4852 39 44 Kalimuthu K, Senthilkumar R, Vijayakumar S, (2007), In vitro micropropagation of orchid, Oncidium sp (Dancing Dolls), AfrJBiotechnol, 6(10): 1171-1174 45 Kauth PJ, Dutra D, Johnson TR, Stewart SL, Kane ME (2008), Techniques and applications of in vitro orchid seed germination, Ornamental and Plant Biotechnology, 1(5): 375–391 46 Loh Goh C J and Rao A N (1978), “Some factors affecting morphogenesis of Aranda orchid tissue culture”, Proc Symp Orchidology, Orchid Soc South East Asia, 43 - 55 47 Morel G (1964), “A new means ofclonal propagation of orchids”, Am Orchid Soc Bull, 33: 473-478 48 Morel G (1960), “Producing virus-free Cymbidiums”, Am Orchid Soc Bull, 29: 495-497 49 Murashige T and Skoog F (1962), “A revised medium for rupid growth and bioassays with tobacco tissue culture”, Physiol Plant 15: 473 - 479 50 Nihar Ranjan Nayak and cs (1997), “In vitro propagation of three epiphytic Orchid, Cybidium aloifolium (L.) Sw., Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisch And Dendrobium moschatum.(Buch - Ham) Sw Through thidiazuron - induced high frequency shoot proliferation”, 243-250 51 Pan-Chi Liou (2005), Marching towward the Market - the Business Potential for Agricultural Biotechnology in Taiwan, Horticultural Division Agricultural Research Institute, Council of Agriculture, Executive Yuan Taichung Hsien, 89 52 Pant B and Thapa D (2012), In vitro mass propagation of an epiphytic orchid, Dendrobium primulinum Lindl.through shoot tip culture, African Journal of Biotechnology, 11(42): 9970-9974 53 Paul S, Kumaria S,Tandon P (2012), An effective nutrient medium for asymbiotic seed germination and large-scale in vitro regeneration of Dendrobium hookerianum, a threatened orchid of northeast India, 40 AoB Plants, DOI: 10.1093/aobpla/plr032 54 Rajkarnikar K M., 2011 Propagation of Cymbidium aloifolium (L.)Sw.In vitro by Seeds, Nepal, 33: 27-30 55 Rezend JC, Ferreira EA, Pasqual M, Santos FC (2009), “Growth regulators and saccarose on the in vitro development of Cattleya loddigesiis”, Revista Agrarian, 2(3): 99-114 56 Sagawa Y and Kunisaki JT (1982), “Clonal propagation of orchid by tissue culture”, Plant tissue culture, 683-684 57 Scully R (1967), “Aspects of meristem culture in the Cattleya alliance, Amer.”, Orchid Soc Bull, 36: 103-108 58 Stadwelson D, Suman K and Pramod T (2012), Multiple shoot induction from axillary bud cultures of the medicinal orchid, Dendrobium longicornu, AoB Plants, DOI: 10.1093/aobpla/pls032 59 Tuhuteru S, Hehanussa ML (2012), “Pertumbuhan dan Perkembangan Anggrek Dendrobium Anosmum Pada Media Kultur In Vitro Dengan Beberapa Konsentrasi Air Kelapa”, Jurnal Ilmu Budidaya Tanaman, Agrologia, 1(1): 1-12 60 USDA (United State Department of Agriculture) (2004), Economic Research Service, Briefing Room- Floriculture crops, 18-26 *Tài liệu Internet 61.http://www.vietnamplus.vn/ 62.http://www.hcmbiotech.com.vn/ 63.http://www.vncreatures.net/ 41 PHỤ LỤC Một số hình ảnh trình nuôi cấy 42 ... trồng lan Phi điệp hạ giá thành tạo nguồn giống bệnh cung cấp cho thị trường Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Phi điệp từ hạt Mục đích nhiệm vụ nghiên cứu. .. mặt lan Phi điệp - Ảnh hưởng Kinetin, - Benzyl amino purine (BAP) BAP + NAA (α - Napththalen eacetic acid) đến khả nhân nhanh in vitro lan Phi điệp - Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ lan Phi điệp. .. 3.2 Nhân nhanh chồi in vitro 26 3.2.1 Ảnh hưởng KI đến trình nhân nhanh chồi lan Phi điệp in vitro 26 3.2.2 Ảnh hưởng BAP đến trình nhân nhanh chồi lan Phi điệp in vitro