nghiên cứu nhân giống in vitro lan hoàng thảo kèn (dendrobium lituiflorum)

DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh protocorm lan Bảng 4.2 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh protocorm lan Hoàng Bảng 4.3 Ảnh hưởng của BA kết h

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BÙI DANH CHUNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HOÀNG THẢO KÈN (DENDROBIUM LITUIFLORUM)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BÙI DANH CHUNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HOÀNG THẢO KÈN (DENDROBIUM LITUIFLORUM)

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Mã số : 60.42.02.01

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Lâm Hải

HÀ NỘI – NĂM 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 26 tháng 11 năm 2015

Tác giả luận văn

Bùi Danh Chung

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn

bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Lâm Hải đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức trường Cao đẳng Nông Lâm Đông Bắc đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện

1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

2.1.1 Vị trí phân bố của chi Hoàng Thảo (Dendrobium) 3

2.1.3 Đặc điểm hình thái của chi lan Hoàng Thảo 4 2.1.4 Đặc điểm sinh thái học của chi lan Hoàng Thảo 6 2.1.5 Một số đặc điểm chính về loài lan Hoàng Thảo Kèn 8 2.1.6 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác lan Hoàng Thảo Kèn 9 2.2 Các nghiên cứu về nhân giống in vitro cây lan hoàng thảo 9 2.2.1 Tình hình nhân giống lan Hoàng Thảo trên thế giới 9 2.2.2 Tình hình nhân giống lan Hoàng Thảo ở trong nước 12 2.3 Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng 13

3.2 Thời gian nghiên cứu 15

3.5.1 Nội dung 1: Gieo hạt trong điều kiện in vitro 15 3.5.2 Nội dung 2: Nhân nhanh protocorm (thể tiền chồi) 16

3.7 Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp đánh giá 20

IAA : Indoleacetic acid

IBA : Indolylbutyrique acid

LSD : Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0,5

(Least Significant Defference)

MS : Murashige & Shoog, 1962

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh protocorm lan

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh protocorm lan Hoàng

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của BA kết hợp với α-NAA đến khả năng nhân nhanh

protocorm lan Hoàng Thảo Kèn (sau 8 tuần nuôi cấy) 26 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của Kinetin kết hợp với α-NAA đến khả năng nhân nhanh

cụm chồi lan Hoàng Thảo Kèn (sau 8 tuần nuôi cấy) 30 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của dịch nghiền chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân

nhanh cụm chồi lan Hoàng Thảo Kèn (sau 8 tuần nuôi cấy) 31 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng tạo rễ lan Hoàng Thảo Kèn (sau

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và chất lượng cây con lan

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của chiều cao, số lá, số rễ cây in vitro đến tỷ lệ sống và

chất lượng cây con lan Hoàng Thảo Kèn ngoài vườn ươm 35

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Hình 4.2 Kết quả nhân nhanh protocorm trên môi trường MS bổ sung Kinetin

với các nồng độ khác nhau (sau 8 tuần nuôi cấy) 24 Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn hệ số nhân protocorm trên môi trường MS bổ sung

BA với các nồng độ khác nhau (sau 8 tuần nuôi cấy) 25 Hình 4.4 Kết quả nhân nhanh protocorm trên môi trường MS bổ sung BA với

các nồng độ khác nhau (sau 8 tuần nuôi cấy) 26 Hình 4.5 Kết quả nhân nhanh protocorm trên môi trường MS bổ sung 0,5mg/l

BA kết hợp với α-NAA đến khả năng nhân nhanh protocorm lan

Hình 4.6 Kết quả nhân nhanh cụm chồi trên môi trường MS bổ sung Kinetin

với các nồng độ khác nhau (sau 8 tuần nuôi cấy) 28 Hình 4.7 Kết quả nhân nhanh cụm chồi trên môi trường MS bổ sung BA với

các nồng độ khác nhau (sau 8 tuần nuôi cấy) 29 Hình 4.8 Kết quả nhân nhanh cụm chồi trên môi trường MS bổ sung 0,5mg/l

Kinetin kết hợp với α-NAA đến khả năng nhân nhanh cụm chồi lan

Hình 4.9 Kết quả nhân nhanh cụm chồi trên môi trường MS bổ sung 0,5mg/l

Kinetin kết hợp dịch nghiền chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng Thảo Kèn (sau 8 tuần nuôi cấy) 31 Hình 4.10 Kết quả ra rễ chồi lan Hoàng Thảo Kèn trên môi trường MS có bổ

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 5.1 Quy trình nhân nhanh in vitro lan Hoàng Thảo Kèn 42

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1 Hệ số nhân cụm chồi trên môi trường MS bổ sung Kinetin với các

nồng độ khác nhau (sau 8 tuần nuôi cấy) 28 Biểu đồ 4.2 Số rễ chồi lan Hoàng Thảo Kèn trên môi trường MS bổ sung α-NAA

với các nồng độ khác nhau (sau 8 tuần nuôi cấy) 32 Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của lan Hoàng Thảo Kèn

Biểu đồ 4.4 Ảnh hưởng của chiều cao, số lá, số rễ cây in vitro đến tỷ lệ sống của

lan Hoàng Thảo Kèn ngoài vườn ươm (sau 30 ngày trồng) 36

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium

Các thí nghiệm thiết kế theo phương pháp khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCB), mỗi công thức tiến hành 3 lần lặp lại Kết quả cho thấy nguyên liệu sử dụng thích hợp là quả lan 5 tháng tuổi; môi trường gieo hạt là MS + (10g saccaroza + 100ml

ND + 7g agar)/lít môi trường Trong nhân in vitro, môi trường nhân nhanh

protocorm tốt nhất là MS + (20g saccaroza + 100ml ND + 7g agar + 0,5mg BA)/lít môi trường; môi trường nhân nhanh cụm chồi tốt nhất là MS + (20g saccaroza + 100ml ND + 7g agar + 0,5mg Kinetin)/lít môi trường Môi trường tối

ưu tạo cây hoàn chỉnh là MS + (20g saccaroza + 100ml ND + 7g agar + 0,5mg NAA)/lít môi trường Giá thể ra cây tối ưu cho lan Hoàng Thảo Kèn là xơ dừa

α-Từ khóa: Dendrobium lituiflorum, quả lan, nhân nhanh, protocorm

THESIS ABSTRACT

Studies of micropropagation of Dendrobium lituiflorum aims to breed this orchid which has highly aesthetic value and is in danger of extinction The

experimental design method is randomized complete block (RCB), each recipe

conducted 3 replicates Results showed that appropriate material for in vitro

propagation establishment was 5 months old fruits; on MS medium supplemented with + 10g/l sucrose + 100ml/l coconut juice; The suitable medium for protocorm multiplication was MS + 20g/l surose + 100ml/l coconut juice + 0.5mg/l BA; The optimal medium for shoot propagation was MS + 20g/l sucrose + 100ml/l coconut juice + 0.5mg/l Kinetin The best medium rood formation was

MS + 20g/l sucrose + 100ml/l coconut juice + 0.5mg α-NAA/l Well - rooted plantlets were successfully transplanted to coir substrate with high rate of plants survival and development

Keywords: Dendrobium lituiflorum, seed capsules, propagation, protocorm

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Họ lan hay phong lan (Orchidaceae) là một trong những họ thực vật lớn

nhất với khoảng trên 35.000 loài phân bố rộng rãi trên toàn thế giới (Dressler, 1993) Đây là họ hoa đẹp và thường có hương thơm nên rất được ưa chuộng Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thích hợp cho sự phát triển của các loài phong lan Theo cuốn Phong lan Việt Nam của Trần Hợp thì Việt Nam có 137 - 140 chi với trên 1000 loài Trong những năm gần đây, đời sống vật chất bớt khó khăn, nhu cầu thưởng thức hoa của người Việt ngày càng được chú trọng và phát triển, chính vì vậy việc cung cấp lan giống cho thị trường càng được quan tâm Tuy nhiên, các giống hoa lan phổ biến trên thị trường nước ta hiện nay chủ yếu là do nhập ngoại từ Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc , việc tự nhân giống để cung cấp cho thị trường trong nước vẫn còn nhiều hạn chế

Lan rừng tuy không rực rỡ sắc màu như những giống lan ngoại nhập nhưng lại có vẻ đẹp tự nhiên thanh thoát và phần lớn có hương thơm vì vậy luôn được ưa chuộng đối với những người chơi lan Thế giới lan rừng rất phong phú với nhiều

chủng loại trong đó lớn nhất phải kể đến chi Dendrobium (còn gọi là Hoàng Thảo), trong đó có Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum) là loại hoa tuyệt đẹp và

quý hiếm Hoàng Thảo Kèn là loại lan biểu sinh trong rừng lá rộng trên thân cây ở

độ cao khoảng 300 - 1600m, phát triển trong nhiệt độ mát đến ấm nóng Tại Việt Nam, cây có mặt ở miền Bắc Hoàng Thảo Kèn rất sai hoa, nở nhiều hoa to 6 - 7

cm, mọc từng chùm 2 - 3 chiếc trên 1 mắt ở các đốt giữa thân đến ngọn

Hiện nay, Hoàng Thảo Kèn rất ít được tìm thấy trong tự nhiên do bị thu mua và khai thác ráo riết Người chơi hoa ai cũng muốn được sở hữu Hoàng Thảo Kèn trong vườn khiến giá thành của Hoàng Thảo Kèn tự nhiên bị đẩy lên rất cao

và trở thành loài ngày càng bị săn lùng khai thác nhiều hơn đến cạn kiệt Việc bảo tồn và nhân giống Hoàng Thảo Kèn hiện nay chưa được thực hiện tại bất cứ nơi nào ở Việt Nam Tuy nhiên với sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại, việc

áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trên chi phong lan nói chung và họ Hoàng Thảo nói riêng đã được thực hiện thành công và thu được nhiều thành tựu

Trên cơ sở các dữ liệu công bố về việc nhân in vito chi lan Hoàng Thảo

Trên cơ sở các dữ liệu công bố về việc nhân in vitro chi lan Hoàng Thảo

nói chung, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân giống in vitro

lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum)” với mục đích nhân giống và

bảo tồn loài lan đặc hữu này một cách hữu hiệu nhất

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Nhân giống được loài lan Hoàng Thảo Kèn bằng phương pháp nuôi cấy mô

1.2.2 Yêu cầu

- Xác định được môi trường tối ưu nhân nhanh protocorm lan Hoàng Thảo Kèn

- Xác định được môi trường tối ưu nhân nhanh cụm chồi phát sinh từ

protocorm của lan Hoàng Thảo Kèn

- Xác định được môi trường tối ưu tạo rễ cho chồi của lan Hoàng Thảo Kèn

- Xác định được giá thể ra cây tối ưu lan Hoàng Thảo Kèn

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Lan Hoàng Thảo Kèn tại Miền Bắc Việt Nam

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài là dẫn liệu khoa học có giá trị về quy trình

nhân giống in vitro lan Hoàng Thảo Kèn

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể được áp dụng tại các phòng thí

nghiệm và các cơ sở có nhu cầu nhân giống in vitro với điều kiện phù hợp

- Góp phần bảo tồn và phát triển loài lan Hoàng Thảo Kèn

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG

2.1.1 Vị trí phân bố của chi Hoàng Thảo (Dendrobium)

Trên thế giới chi lan Hoàng Thảo có khoảng 1400 loài, chủ yếu phân bố ở Đông Nam Á và các đảo thuộc Philippine, Malaysia, Indonesia, Papua New Guinea, Đông Bắc Australia Ở Việt Nam có 107 loài và 1 thứ, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và một số đảo ven biển (Đào Thị Thanh Vân và Đặng Thị Tố Nga, 2008) Các đại diện của chi Hoàng Thảo chủ yếu sống phụ sinh trên thân hoặc các cành cây ở trong rừng hoặc trên các hốc mùn trên đá, chúng thường mọc ở nơi ẩm, với độ cao 500 – 1500m so với mực nước biển, cũng có khi gặp chi lan này mọc ở độ cao 200m hoặc tới 2000m so với mực nước biển

2.1.2 Phân loại chi lan Hoàng Thảo

Do sự đa dạng nên các nhà sưu tập và trồng lan Hoàng Thảo đã tạm phân loại chúng dựa theo một số điểm tương đồng, về cách sống, mùa nghỉ và mùa hoa

Callista: Không rụng lá, đa số có giả hành Có từ 1-6 lá mọc phía trên đỉnh giả hành Cần hoa xuất hiện vào mùa xuân, thường cong vòng và mang

nhiều hoa màu vàng, trắng, tím nhạt Trong nhóm này có những loài như D

chrysotoxum (Hoàng lạp), D densiflorum (Thủy tiên vàng), D farmeri (Thủy tiên trắng), D lendleyi và D thyrsiflorum

Spalutapa: Không rụng lá, giả hành to, cao Ra hoa một lượt với nhiều cành hoa, lâu tàn Nhóm này được xem là nhóm dễ trồng Trong nhóm có các

loài như D antenatum, D canaliculatum, D discuolor, D gouldii, D lineale, D

sratiotes, D strebloceras và D laurinum

cành già không còn lá Cây cần có mùa đông lạnh để trổ hoa Nhóm này có các

loài như D anosnum, D chrysanthum, D falconeri, D fimbriatum,

D findlayanum, D friedricksianum, D heterocarpum, D loddigesti, D monilidorme,

D Nobile, D parishii, D primulinum, D transparent và D wardianum

lông đen nơi nối kết của lá Hoa trắng, lớn đến 10cm, có những đểm vàng, cam,

lục hoặc tím Trong nhóm này có các loài như D bellatulum (Bạch hỏa hoàng),

lowii, D lyonii, D margaritaceum, D sanderae

Latura: Không rụng lá, có giả hành dày, to cỡ trung bình Hoa thường

màu vàng - xanh đến xanh lục Trong nhóm có các loài như D bellwigianum, D

johnsoniae, D macrophylum, D spectabile

Oxyglossum: Nhóm lan rừng, nhỏ, không rụng lá, gặp tại vùng núi cao

Hoa lâu tàn, nhiều màu sắc Trong nhóm có các loài như D bellwigianum, D

cuthbersonii, D laviefolium, D vexillarius

đã rụng lá Hoa có màu sắc rực rỡ, hồng , tím, cam đôi khi trắng và kem Trong

nhóm này có các loài như D amethytoglosum, D myakei, D secundum, D

smilliae và D vitoriae-reginae

Phalaenanthe: Có thể rụng hoặc không rụng lá tùy điều kiện sinh sống Giả hành mỏng nhưng dài và cao Hoa mọc ra từ các mắt ngủ ở ngọn, thường xuất hiện vào mùa thu hoặc 2 lần trong một năm Nhóm này có hoa và cành tròn

và to giống như hoa của giống lan hồ điệp Hoa rất lâu tàn, kéo dài từ 1 đến 3 tháng Phát triển quanh năm trong môi trường ấm áp Trong nhóm này có các loài

như D affine, D bigibbum, D dicuphum, D williamsianum

2.1.3 Đặc điểm hình thái của chi lan Hoàng Thảo

Thân: Chi lan Hoàng Thảo là cây thân thảo mọc cụm, thẳng đứng hoặc

rủ thõng, phân đốt, sống phụ sinh trên các cây gỗ hoặc số ít các loài sống bám trên đá, trong rừng ẩm Chi này thuộc nhóm đa thân với nhiều giả hành, vừa

có thân thật vừa có giả hành Giả hành tuy là thân nhưng lại chứa diệp lục, dự trữ nước và nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển giả hành mới

Đa số các củ giả hành có màu xanh nên nó đã cùng với lá làm nhiệm vụ quang hợp (Trần Hợp, 2000)

Thân của các đại diện chi Hoàng Thảo đều phân đốt, hình trụ, hình con suốt, hình chùy, có chiều dài từ 2-3cm đến 120cm Lát cắt ngang thân có thể là hình tròn, bầu dục, đôi khi hình 4 cạnh thay đổi từ 0,3-1,5cm Phần gốc, nơi xuất phát của

rễ thưởng nhỏ mảnh nhưng cũng có thể phình to (Dương Đức Huyến, 2007)

Rễ: Rễ của các đại diện chi Hoàng Thảo là rễ khí sinh, mảnh, hình trụ,

màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thường ôm lấy giá thể hoặc buông

thõng xuống Ở một số loài được bao bọc bởi lớp mô hút ẩm dày bao gồm cả những lớp tế bào chết chứa đầy không khí do đó có ánh lên màu xám bạc Chiều dài rễ từ 0,1-0,3cm; rễ thường mọc từ phần gốc của thân hoặc có thể ở mấu thân một vài loài

Lá: Lá mọc thành hai dãy so le, không có cuống mà chỉ có bẹ ôm lấy

thân Lá thường cứng, dạng đa bóng, bề mặt thường nhẵn, đôi khi bề mặt và bẹ lá (thường khi lá non) có phủ lông cứng ngắn màu đen sớm rụng (Dương Đức Huyến, 2007)

Cụm hoa: Cụm hoa chùm thường nhiều hoa hoặc ít hoa Cụm hoa dài thường

rũ thõng xuống, nhiều loài hoa có giá trị làm cảnh (Dương Đức Huyến, 2007)

Hoa: Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên Màu sắc hoa đa dạng, sặc sỡ Hoa

đa số có loài có hương thơm Bao hoa chia hai vòng Vòng ngoài gồm một lá đài giữa và hai lá đài bên Vòng trong gồm có hai cánh hoa và một cánh môi (Dương Đức Huyến, 2007)

Cằm: Là một bộ phận được hình thành nhờ mép phần gốc hai lá đài bên

dính nhau và dính với chân cột Cằm có các hình bán cầu, hình túi đến hình cựa, hình trụ cong ít nhiều (Dương Đức Huyến, 2007)

Cánh môi: Cánh môi khác nhiều so với các thành phần còn lại của bao

hoa cả về màu sắc, kích thước và trang trí Trang trí đa dạng trên cánh môi như đốm, vạch, diềm tua, u lồi, đường sống, lông phủ chiếm vị trí khá quan trọng trong phân loại Nhiều loài có gốc cánh môi dính với chân cột tạo thành cựa (Dương Đức Huyến, 2007)

Cột (trụ nhị-nhụy): Cột thường thấp, mặt trước hơi lõm; đỉnh cột lõm để

chứa khối phấn, hai mép đỉnh cột có hai răng cột; phủ lên đỉnh cột là nắp bao phấn Ở gốc cột có mỏ, thường là một phần phụ dạng màng nhô Chỗ thấp nhất phía dưới cột là chân cột, thường hình tam giác thuôn và có tuyến mật Bao phấn hình mũ, bề mặt thường nhẵn hoặc có nhũ mịn, đôi khi có lông nạc bao phủ Khối phấn hình chùy, không có chuôi, số lượng là 4, xếp thành 2 cặp (Dương Đức Huyến, 2007)

Quả: Quả nang thường hình chùy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều hạt

nằm xen lẫn những sợi lông mảnh Hạt rất nhỏ, hầu như không trọng lượng, bao quanh hạt là lớp màng dạng mắt võng, trong suốt chứa đầy không khí dễ dàng bay cùng hạt trong không khí nhờ gió (Dương Đức Huyến, 2007)

2.1.4 Đặc điểm sinh thái học của chi lan Hoàng Thảo

Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến sự tăng trưởng phát triển của lan

Hoàng thảo thông qua con đường quang hợp và hoạt động trao đổi chất Lan

Hoàng Thảo thuộc loại cây ưa nóng, sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 24-330C Dưới

120C và trên 370C đều làm chậm và ảnh hưởng đến sự ra hoa của cây

Độ ẩm: Độ ẩm thích hợp giúp cho cây được phát triển nhanh hơn hoa tươi

và lâu tàn Chi Dendrobium cũng như đa số các giống lan khác chỉ phát triển tốt

trong điều kiện không khí ẩm nhưng thoáng khí, vào ban ngày cây cần độ ẩm khoảng từ 40-60%, vào ban đêm độ ẩm thích hợp từ 60-90% thì cây sẽ phát triển tốt hơn Loại giá thể quá ẩm và úng sẽ là điều kiện bất lợi cho sự sinh trưởng của

chi Dendrobium vì có thể bị thối toàn bộ rễ và biểu hiện là cây con mọc từ phần

ngọn của thân (Bùi Thị Thu Hiền, 2009)

Ánh sáng: Ánh sáng rất cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển và ra hoa

của cây trồng nói chung và cây hoa lan nói riêng trong đó có lan Hoàng Thảo

Ánh sáng rất quan trọng cho cây lan vì nó trực tiếp giúp cho cây tạo ra chất nuôi dưỡng cho cây tăng trưởng nhanh Vì vậy đây là yếu tố quyết định sự

ra hoa của cây lan Nếu thiếu ánh sáng cây sẽ yếu mềm và chậm phát triển, không những thế mà có thể làm cho cây không ra hoa được Nhưng nếu nhiều ánh nắng sẽ làm cho cây bị cháy lá hoặc chết cây non

hay khuếch tán Ánh sáng hữu hiệu cho cây thuộc chi Dendrobium là 70%, vì thế

giàn che với độ che sáng 30% dưới đất và 40% ở trên cao với cường độ ánh sáng

từ 15.000-30.000lux rất thích hợp cho sự phát triển của chi lan Hoàng Thảo

Dinh dưỡng: Lan Hoàng Thảo yêu cầu một lượng dinh dưỡng nhất định

để sinh trưởng và phát triển Tuy không đòi hỏi số lượng lớn nhưng phải đầy đủ các thành phần dinh dưỡng N, P, K và các nguyên tố trung, vi lượng Tùy từng giai đoạn sinh trưởng mà nhu cầu đối với các thành phần dinh dưỡng có khác nhau (Đào Thanh Vân và Đặng Thị Tố Nga, 2008)

Trong các công bố về nhân nhanh in vitro lan Hoàng Thảo, một lượng lớn những chất hữu cơ tự nhiên được bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro hoa

lan như peptone, nước ép carot, khoai tây, táo, dịch chiết chuối, nước dừa Những hợp chất tự nhiên này hỗ trợ rất tốt quá trình hình thành phát triển của cây nuôi cấy mô Nước dừa với thành phần phức tạp chứa nhiều chất dinh dưỡng và

hormone Nó có tác dụng thúc đẩy sử tăng trưởng rõ rệt đối với nhiều loại mô cây thực vật khác nhau Nó dễ dàng phối hợp với các thành phần trong môi trường nuôi cấy, không mất hoạt tính khi hấp khử trùng hay khi tiếp xúc với các điều kiện nuôi cấy trong khoảng thời gian ngắn Nó thường được thêm vào môi trường nuôi cấy mô hoa lan để kích thích tạo mô sẹo, protocorm và thường được

sử dụng ở dãy nồng độ từ 10-25% về thể tích Ngoài ra, nước dừa cũng giữ được vai trò quan trọng trong sự điều hòa biệt hóa của PLB, gia tăng tỷ lệ sống sót của những mẫu mô mỏng, giúp hình thành PLB từ đỉnh phát hoa của những cây lan đơn thân (Trần Văn Minh, 1999)

Trong nhiều công trình của mình, Steward and Simmonds (1954) đã chứng minh vai trò kích thích sự phân bào của tế bào lan khi bổ sung nước ép chuối Nước ép trái chuối chứa nhiều cytokinin, auxin cũng như gibberelins, do vậy nhiều nghiên cứu đã cho thấy nó hỗ trợ và kích thích sự ra rễ của hạt nảy mầm và chồi nuôi cấy Dịch chiết khoai tây chứa nhiều tinh bột, đường, Kali, vitamin và axit amin cũng đã được sử dụng phổ biến làm tăng sự phát triển của

mô sẹo hay các cơ quan nuôi cấy

Giá thể: Giá thể là từ dùng để chỉ tất cả các vật chất bao quanh bộ rễ của

cây trồng, các loại giá thể khác nhau có ưu nhược điểm khác nhau và tùy theo

mục đích trồng, loại cây trồng mà chọn các loại giá thể thích hợp

Giá thể để trồng lan Hoàng Thảo cần phải thật thoáng và không úng nước

Tuy nhiên do bản năng sinh học và cấu trúc thực vật với giả hành có thân, các

loài thuộc giống Dendrobium cần giá thể hơi ẩm chút ít nhưng không được làm thối căn hành Vì thế một số loài thuộc chi Dendrobium có thể phát triển trên các

giá thể là xơ dừa hay cả quả dừa, dùng như một cái chậu chứa sẵn giá thể Tuy nhiên nếu giá thể là xơ dừa phải hạn chế số lần tưới nước, nếu chậu là quả dừa nguyên phải cưa phần đáy, nếu không cây bị thối vì quá ẩm Ở điều kiện khí hậu khô có thể tăng thêm rêu và rong biển chúng sẽ làm sự thoát ẩm diễn ra chậm lại Nhưng cần sử dụng cẩn thận khi thêm rong (rêu) vì tưới nước thường xuyên sẽ dẫn đến thừa ẩm, úng làm bộ rễ thối rữa, cây dễ bị bệnh và chết Cũng có thể

trồng cây lan thuộc chi Dendrobium với căn hành cách đáy chậu khoảng 3cm, rồi

rải thật thoáng xung quanh căn hành là một số rễ lục bình giặt sạch Tuy nhiên, giá thể than và gạch nung vẫn tỏ ra hiệu quả nhất đối với các loài lan thuộc chi

Dendrobium

2.1.5 Một số đặc điểm chính về loài lan Hoàng Thảo Kèn

Hoàng Thảo Kèn tên khoa học là Dendrobium Lituiflorum Hoàng Thảo

Kèn là một trong những loại lan tuyệt đẹp và quý hiếm Ngoài tự nhiên bây giờ rất khó tìm thấy do bị săn lùng quá nhiều

Hoàng Thảo Kèn phân bố trong rừng lá rộng trên thân cây ở độ cao khoảng 300-1600m, phát triển trong nhiệt độ mát đến ấm nóng, Hoàng Thảo Kèn còn có khả năng chịu lạnh xuống đến 1,2ºC Chúng cần ánh sáng trung bình, không ưa nắng trực tiếp

Thân cây dài 50-80cm rủ xuống mềm mại, thân hình trụ, căng tròn, nhẵn bóng, thon nhọn dần về phía đầu ngọn, đôi khi đốt thân thắt hình thoi rất nhẹ Lá hẹp, thuôn dài, dẻo dai, lá rụng vào mùa thu… Hoa mang sắc tím quyến rũ biến thiên từ nhạt đến sậm, môi loa hình chiếc kèn, vành môi trắng

Hoàng Thảo Kèn cần nhiều ẩm và phân bón trong lúc phát triển thân non, chỉ để khô khi cây đã ngừng phát triển Hoàng Thảo Kèn nở hoa từ cuối mùa đông đến mùa xuân, rất thơm và lâu tàn Hoàng Thảo Kèn rất sai hoa, nở nhiều hoa to 6-7cm, mọc từng chùm 2-3 chiếc trên 1 mắt ở các đốt giữa thân đến ngọn, phát sinh từ thân cây trụi lá cũ

Hoàng Thảo Kèn thuộc loại dễ trồng, nhưng điều đó còn phụ thuộc vào

thời tiết vùng miền Hoàng Thảo Kèn nhìn xa rất giống với D anosmum vì màu

tím trầm na ná nhưng thực tế so sánh nhau thì hình dáng khác biệt hoàn toàn

Hoàng Thảo Kèn là một trong những lan rừng đẹp nhưng ngoài tự nhiên

số lượng còn rất ít Ở một số nơi trên thế giới nó còn được đưa vào diện được bảo

vệ nghiêm ngặt Nước ta may mắn là một trong những vùng đất được tạo hóa ban cho loài Hoàng Thảo Kèn, nếu không có biện pháp bảo vệ kịp thời có thể lâm vào nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên

Hình 2.1 Hoa lan Hoàng Thảo Kèn

2.1.6 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác lan Hoàng Thảo Kèn

Trên thị trường tự do hiện nay đang có 3 loại Hoàng Thảo Kèn: Hoàng Thảo Kèn hoa màu trắng tại thị trường Thái Lan đang bán 2 triệu đồng, còn ở thị trường Việt Nam đang bán với giá từ 1 – 1,5 triệu đồng 1 cành dài 30 cm; Hoàng Thảo Kèn hoa màu hồng tại thị trường Thái Lan không có, còn ở thị trường Việt Nam đang bán với giá khoảng 600 nghìn đồng 1 cành dài 30 cm; Hoàng Thảo Kèn hoa màu tím tại thị trường Thái Lan đang bán 100.000 đồng, còn ở thị trường Việt Nam đang bán với giá 100.000 đồng 1 cành dài 10 - 15 cm và 200.000 đồng 1 cành dài 25 – 35 cm Hoàng Thảo Kèn có hoa màu trắng và màu hồng được tạo ra do đột biến Chỉ bán thân tơ không bán cả cây Chi phí sản xuất

ở thái lan khoảng 2.200 – 2.500 đồng 1 cây in vitro và giá bán dao động từ 3.000

– 7.000 đồng Năm nay điều kiện tự nhiên khô hạn nên quả lép và rụng hết từ sớm, còn ở tự nhiên thì rất khó tìm quả

2.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY LAN

HOÀNG THẢO

2.2.1 Tình hình nhân giống lan Hoàng Thảo trên thế giới

Một số kết quả đạt được trong nhân giống một vài loài Dendrobium bằng

phương pháp nuôi cấy mô (theo George, 1993)

D.bigibbum

Lindl

Các đoạn thân Tái sinh các chồi bên Kulylezanka and

Wojciechowska

sinh nhanh protocorm

Tạo protocorm và tăng sinh nhanh protocorm

Morel (1974)

D lacniosum Đỉnh sinh trưởng

của chồi ngọn và chồi bên

Tạo sự khởi đầu và nhân nhanh tiền củ

D Miss Hawaii Các mắt của cọng

hoa

Tái sinh chồi từ mắt ngủ Nuraini and

Mohd.Shaib (1992)

Dendrobium là loài lan được kinh doanh phổ biến trong thị trường hoa lan trên thế giới Một số phương pháp nuôi cấy phát sinh cụm chồi qua nuôi cấy

đỉnh sinh trưởng và phôi PLB đã được báo cáo (Manorama et al., 1986; Nayak

biệt được quan tâm do là một hệ thống nuôi cấy thích hợp nhân nhanh công nghiệp trong các hệ thống bioreactor (Zimmerman, 1993) Nuôi cấy hạt

Kyoto (Ito, 1966, 1967)

Nhân giống Dendrobium Joannie Ostnhault qua nuôi cấy đỉnh sinh

trưởng: Vasundhara (1990) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tác rời trên môi trường lỏng VW có bổ sung 15% nước dừa, đặt trong tối sau 48h, sau đó đưa ra ánh sáng, tạo PLB PLB được cấy chuyển, nhân sinh khối và tái sinh thành chồi trên môi trường bán rắn VW có bổ sung 15% nước dừa

Parasad et al (2001) đã nuôi cấy chồi đỉnh giống lan Dendrobium Sonia

trên môi trường MS có bổ sung 1mg/l NAA và 1mg/l BA hình thành cụm chồi sau 25 ngày nuôi cấy với 11 chồi/mẫu

Nghiên cứu sự tạo mô sẹo trên Dendrobium cho thấy: Mô sẹo sinh trưởng chậm, dễ bị hoại tử trong quá trình nuôi cấy được ghi nhận (Lin et al., 2000; Roy

and Banerjee, 2001) Hơn nữa môi trường nuôi cấy tạo mô sẹo có bổ sung Auxin, cytokinin, nước dừa cho kết quả khả quan (Chen and Chang, 2000) Tuy nhiên nuôi cấy kéo dài trong môi trường có chất kích thích sinh trưởng dẫn đến biến tính tế bào soma và cần điều khiển Auxin và cytokinin thích hợp trong tái sinh

mô sẹo hình thành chồi và PLB (Roy et al, 2007)

Khi gieo hạt một số loài Dendrobium sp Luan et al (2006) đã bổ sung

0,5mg/l NAA kích thích sự nảy mầm và phát sinh protocorm khi gieo hạt lan trên nền môi trường MS

Anjum S, (2006) nghiên cứu trên lan Dendrobium malones đã tái sinh

protocorm từ mẫu lá trên môi trường MS + 1,0mg/l Kinetin + 0,5mg/l NAA và protocorm sau khi hình thành được cấy chuyển lên môi trường MS cơ bản bổ sung 2,0mg/l BAP để phát sinh hình thái và thu được số lượng protocorm nhiều nhất

Chung và cs (2007) thành công trong nuôi cấy phát sinh phôi vô tính trực

tiếp từ lá của giống lan Dendrobium Chiengmai Pink Nghiên cứu ảnh hưởng của

bốn loại auxin (2,4D; NAA; IBA; IAA) và năm loại cytokinin (Ki, BA, 2ip, TDZ, zeatin) trên môi trường 1/2MS đến sự tạo mô sẹo trực tiếp, ghi nhận auxin không ảnh hưởng đến sự hình thành phôi vô tính trong tối và ngoài sáng sau 60 ngày nuôi cấy; phôi phát sinh tốt với 1mg/l TDZ với 5-25% mẫu nuôi cấy tạo phôi và đạt 33,6 phôi/mẫu; phôi thứ cấp phát sinh trên vết cắt bản lá và có tần suất tạo phôi cao để trong tối; NAA (0-0,1-1mg/l) kết hợp TDZ (0-0,3-3mg/l) nâng cao hiệu suất thành phôi; chồi tái sinh từ phôi dễ dàng trên môi trường 1/2MS không chất kích thích sinh trưởng và có tỷ lệ sống cao khi thuần hóa

Kanjilal et al (1999) đã nuôi cấy giả hành lan Dendrobium moschatum

trên môi trường có bổ sung kết hợp BA và NAA tại các nồng độ (BA = 0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0mg/l) với (NAA = 0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0mg/l) và kết quả thu được cao nhất tại môi trường bổ sung BA = 3,0mg/l và NAA = 2,0mg/l là 8,4 protocorm

Nhân giống vô tính Dendrobium microbulbon qua nuôi cấy giả hành Môi

trường MS có bổ sung 3% sucrose; 7,5mg/l IAA và 20mg/l BAP phù hợp nhất cho việc tái sinh chồi từ giả hành Môi trường MS với 2,0 mg/l BAP thích hợp cho nhân nhanh chồi, tăng trưởng chồi Khi thích ứng cây ở ngoài vườn ươm,

60% cây con sống sót sau khi tách khỏi các điều kiện in vitro (Urvashi Sharma et

al, 2007)

Liu et al (2008) đã tiến hành nghiên cứu đoạn thân loài lan Dendrobium

trưởng là BA (0,2-0,8 mg/l) Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường phù hợp nhất để tạo ra chồi bên là KC + 6-BA 0,2 mg/l + 0,5 mg/l NAA hoặc môi trường

½ MS + KT 1,5 mg/l + 1,0/l NAA Bổ sung dung dịch hữu cơ như dịch chiết chuối là thuận lợi để phát triển chồi bên

Plant and Thapa (2012) đã nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Dendrobium

tiết sinh trưởng (NAA hoặc BAP) Sau 5 tuần nuôi cấy, đỉnh sinh trưởng tạo ra các cá thể chồi trên nền môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/l BAP (4,5 chồi/mẫu cấy) Trong số các thử nghiệm khác nhau, môi trường MS với BAP (1,5mg/l) và NAA (0,5mg/l) là hiệu quả nhất cho việc nhân nhanh chồi Môi trường MS bổ sung các chất kích thích ra rễ (NAA, IAA, IBA) cho thấy phản ứng tích cực trong

sự phát triển của rễ, ngoại trừ 0,5 mg/l NAA Kích thích ra rễ tốt nhất đã được quan sát trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l IAA

Kabir et al (2013) đã sử dụng 3 môi trường Phytamax (Sigma, Hoa Kỳ, PM), MS, VW để gieo hạt lan Dendrobium fimlriatum Hook Trong đó, môi

trường PM là hiệu quả nhất với tỷ lệ nảy mầm của hạt 100% Môi trường MS có

bổ sung 1 mg/l BAP và 0,5 mg/l picloram là tốt nhất cho sự nhân nhanh và sinh trưởng của chồi Môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l 6-BA và 0,1mg/l IBA thích

hợp nhất cho sự cảm ứng và tăng trưởng của rễ cây lan in vitro này

2.2.2 Tình hình nhân giống lan Hoàng Thảo ở trong nước

Ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu trên các giống lan Hoàng Thảo khác nhau Viện Sinh học nông nghiệp – Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu trên nhiều đối tượng lan Hoàng thảo như: Nghiên cứu nhân nhanh

protocorm và chồi lan Dendrobium E.R (Mai Thị Tân và cs., 2000), nghiên cứu nhân giống in vitro giống lan Thạch hộc (D.nobile Lindl.) (Vũ Ngọc Lan và cs, 2011), nhân nhanh lan Dendrobium Hancockii rolfe (Vũ Ngọc Lan và cs., 2010), nhân nhanh lan Dendrobium fimbriatum Hook (Nguyễn Thị Sơn, 2012)

Theo tác giả Trần Văn Minh và Nguyễn Văn Uyển (2001) MS là môi

trường nuôi cấy cơ bản thích hợp cho nhân giống lan Dendrobium in vitro, 1mg/l

BA + 0,1mg/l IBA là tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng thích hợp cho nhân

hiệu nâng cao hiệu quả phát sinh chồi trong quá trình nhân giống hoa lan

chất điều tiết sinh trưởng và chất hữu cơ bổ sung đạt hiệu quả cao trong tái sinh

chồi và chiều cao của chồi lan Dendrobium in vitro

Bùi Thị Tường Thu và Trần Văn Minh (2007) sử dụng môi trường VW bổ sung BA, NAA, kinetin, TDZ, nước dừa, đường sucrose nuôi cấy phát sinh và tăng

sinh tế bào soma, phát sinh và tái sinh phôi giả (PLB) của cây hoa lan Dendrobium

Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2006) đã đưa ra quy trình vi nhân giống lan

Dendrobium anosmum Quả lan 4 tháng khử trùng và gieo hạt vào môi trường sau 3 tháng gieo cấy tỷ lệ nảy mầm ≥ 85% trên môi trường MS + 1mg/l NAA và

môi trường MS + 1mg/l BA + 0,2mg/l NAA Chồi lan D anosmum phát triển tốt

nhất trên môi trường MS + 2 mg/l BA Chồi lan tạo rễ tốt nhất trên môi trường

MS + 1 mg/l IAA Sau 3,5 tháng tạo được cây hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn để đưa

ra vườn ươm

Vũ Ngọc Lan và cs, 2011 đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro giống lan Thạch hộc (D.nobile lindl.) Môi trường nhân cụm protocorm là KC + (10g

sucrose + 60g khoai tây)/lít môi trường, trong 2 tháng cho hệ số nhân đạt 4,2 lần Nhân nhanh cụm chồi trên môi trường MS + (100ml ND + 30g sucrose + 60g chuối chín)/lít môi trường, sau 2 tháng nuôi cấy cho hệ số nhân 3,15 lần và tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường RE + (10g sucrose + 0,5g THT)/lít môi trường

Nguyễn Văn Song và cs, 2011 đề xuất khi nhân in vitro lan D

nảy mầm và phát sinh protocorm là môi trường MS + 20 g/l sucrose +8 g/l agar + 15% ND + 2 mg/l BAP Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là môi trường MS + 20 g/l sucrose +8 g/l agar + 15% ND + 2 mg/l BAP Môi trường

MS + 30 g/l sucrose +8 g/l agar + 1 g/l THT + 15% ND + 2 mg/l BAP + 1 mg/l

NAA thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng của chồi in

thích hợp cho tạo rễ của chồi in vitro

Nguyễn Thị Sơn (2012) đã nhân giống in vitro loài lan Dendrobium

thích hợp cho nảy mầm là môi trường KC + (100ml ND + 10g sucrose + 6g agar)/lít môi trường; môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là môi trường

KC + (100ml ND + 10g sucrose + 60g KT + 6g agar)/lít môi trường; môi trường

MS + (100ml ND + 20g sucrose + 60g chuối chín + 6g agar)/lít môi trường là

thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi in vitro; môi trường tạo cây hoàn chỉnh là

RE + (10g sucrose + 1g THT + 6g agar)/lít môi trường

2.3 VAI TRÒ CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG

Trong đời sống thực vật, ngoài các chất hữu cơ như gluxit, protein, lipit, axit nucleic… để cấu trúc nên tế bào, mô và cung cấp năng lượng cho các hoạt động sống của chúng, thì còn có các chất có hoạt tính sinh lý như vitamin, emzyme

và các hormone, trong đó các hormone có một vai trò rất quan trong trong việc điều hòa quá trình sinh trưởng phát triển và các hoạt động sinh lý của thực vật Các chất điều hòa sinh trưởng và phát triển của thực vật là những chất có bản chất hóa học khác nhau, nhưng đều có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng, phát triển của cây từ lúc tế bào trứng thụ tinh phát triển thành phôi cho đến khi cây ra hoa kết quả, hình thành cơ quan sinh sản, dự trữ và kết thúc chu kỳ sống của mình

Những chất có khả năng điều khiển được sinh trưởng và phát dục của thực

vật được gọi là chất kích thích sinh trưởng hay chất điều hòa sinh trưởng

Đặc điểm của hormone thực vật là được tạo ra ở một nơi nhưng gây ra phản ứng ở một nơi khác trong cây Auxin sinh ra ở đỉnh thân và cành, có nhiều trong các cơ quan đang sinh trưởng mạnh: hạt đang nẩy mầm, lá đang sinh trưởng… Giberelin sinh ra chủ yếu ở lá và rễ, có nhiều trong lá, hạt, củ, chồi đang nẩy mầm, trong hạt, quả đang hình thành, trong các lóng thân, cành đang sinh trưởng

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vào nồng độ và các sự hỗ trợ qua lại của chúng với các chất điều hòa khác Auxin (phối hợp với cytokinin) giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mô phân sinh ngọn chồi Auxin kích thích sự kéo dãn, phân chia tế bào, kích thích sự phát triển của rễ và một số vai trò khác

Cytokinin là những dẫn xuất từ tARN thực vật, chúng được tổng hợp trong hệ rễ, rồi được vận chuyển không phân cực trong xylem lên ngọn Ngoài ra chúng còn được tổng hợp ở chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh… Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các cytokinin tự do cho các cơ quan cơ thể thực vật Từ rễ, cytokinin di chuyển trong mạch gỗ để tới chồi

Tính chất đặc trưng của cytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh

mẽ Vì vậy người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào, nguyên nhân là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp axit nucleic

và protein dẫn đến sự kích thích phân chia tế bào Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt lên

sự hình thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi Người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng giữa tỷ lệ auxin và cytokinin có ý

nghĩa rất quyết định trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro

cũng như trên cây nguyên vẹn

Tóm lại, Lan Hoàng Thảo Kèn là một loài lan rừng có vẻ đẹp rất quyến rũ

và có hương thơm đặc trưng Người chơi hoa ai cũng muốn được sở hữu chúng trong vườn làm giá thành của chúng bị đẩy lên rất cao nên chúng càng bị săn lùng khai thác nhiều hơn đến cạn kiệt Việc bảo tồn và nhân giống Hoàng Thảo

từ lâu đã được chú ý ở một số quốc gia Tuy nhiên việc nhân giống lan Hoàng Thảo Kèn ở Việt Nam là hoàn toàn mới Trước bối cảnh ấy việc thực hiện đề tài này sẽ đáp ứng yêu cầu của thực tiễn cũng như sẽ có nhiều đóng góp mới về mặt

khoa học của lĩnh vực nhân nhanh in vitro nói chung và bảo tồn loài lan Hoàng

Thảo Kèn nói riêng

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Bộ môn Công nghệ sinh học - Khoa Nông học – Trường Cao đẳng Nông Lâm Đông Bắc – Minh Thành – Quảng Yên – Quảng Ninh

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

- Từ tháng 01 năm 2015 đến tháng 10 năm 2015

3.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Quả lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum) 5 tháng tuổi thu thập

tại Lai Châu

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu lựa chọn môi trường tối ưu nhân nhanh đối với loài lan

Hoàng Thảo Kèn

- Nghiên cứu môi trường tối ưu nhân nhanh cụm chồi phát sinh từ

protocorm của loài lan Hoàng Thảo Kèn

- Nghiên cứu môi trường tối ưu tạo rễ cho chồi của loài lan Hoàng Thảo Kèn

- Nghiên cứu giá thể ra cây tối ưu của loài lan Hoàng Thảo Kèn

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp nuôi cấy mô quy chuẩn hiện hành được áp dụng để nghiên cứu nhân giống lưu trữ, bảo quản nguồn gen trong ống nghiệm Các thí nghiệm thiết kế theo phương pháp khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCB), mỗi công thức tiến hành 3 lần lặp lại

Sử dụng phương pháp nhân giống gieo hạt trong ống nghiệm tạo điều kiện cho hạt lan có thể nảy mầm dễ dàng giúp bảo tồn giống, nhân nhanh số lượng cây

mà vẫn đảm bảo được tính ổn định di truyền

3.5.1 Nội dung 1: Gieo hạt trong điều kiện in vitro

Quả lan sau khi thu hái được cắt tỉa chỉ để lại nguyên phần mang quả có chiều dài khoảng 4 cm đến 5 cm Rửa sạch quả dưới vòi nước máy Quả đã rửa sạch được đựng trong bình vô trùng chuyển vào box cấy, tráng quả lại bằng nước cất vô trùng rồi ngâm trong dung dịch H202 5% + Javen 5% 5 phút, sau đó nhúng trong cồn 960 rồi đốt (1 phút), rạch quả, lấy hạt cấy rải đều trên bề mặt môi

trường đã được chuẩn bị

Môi trường gieo hạt: MS + 10g sacaroza/lít môi trường + 7g agar/ lít môi trường + 100ml nước dừa + 0,5g/lít môi trường than hoạt tính, pH=5.8, hấp vô trùng ở điều kiện 1210C/20 phút

Sau 4 tuần nuôi cấy, đánh giá tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu nhiễm và tỷ lệ phát sinh protocorm

3.5.2 Nội dung 2: Nhân nhanh protocorm (thể tiền chồi)

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh

protocorm lan Hoàng Thảo Kèn

CT1: MS + (20g sacaroza + 7g agar + 100ml ND + 0,5g THT)/lít môi trường (ĐC) CT2: ĐC + 0,1mg/L Kinetin

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh protocorm

lan Hoàng Thảo Kèn

CT1: MS + (20g sacaroza + 7g agar + 100ml ND + 0,5g THT)/lít môi trường (ĐC) CT2: Đc + 0,5mg/L BA

dạng hình cầu, đường kính 1-2 mm, có màu xanh)

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BA kết hợp với α-NAA đến khả năng nhân

nhanh protocorm lan Hoàng Thảo Kèn

Nồng độ 0,5mg/l BA là nồng độ tối ưu nhất cho việc nhân nhanh protocorm của cây lan Hoàng Thảo thu được trong thí nghiệm 1 và 2, BA ở nồng

độ tối ưu đó sẽ được chọn để bổ sung kết hợp với α-NAA vào môi trường nhân nhanh protocorm lan Hoàng Thảo Kèn theo các công thức sau:

(ĐC = Công thức tốt nhất của thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2)

Thí nghiệm được tiến hành cấy vào mỗi bình 5 cụm, mỗi cụm 10 protocorm Mỗi công thức cấy vào 5 bình, 3 lần nhắc lại Các chỉ tiêu theo dõi:

Tỷ lệ mẫu sống, số lượng protocorm/cụm, HSN protocorm (proctocorm thường ở dạng hình cầu, đường kính 1-2 mm, có màu xanh)

3.5.3 Nội dung 3: Nhân nhanh cụm chồi

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh cụm

chồi lan Hoàng Thảo Kèn

CT1: MS + (20g sacaroza + 7g agar + 100ml ND + 0,5g THT)/lít môi trường (ĐC)

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh cụm chồi

lan Hoàng Thảo Kèn

CT1: MS + (20g sacaroza + 7g agar + 100ml ND + 0,5g THT)/lít môi trường (ĐC)

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của Kinetin kết hợp với α-NAA đến khả năng

nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng Thảo Kèn

Nồng độ 0,5mg/l Kinetin là nồng độ tối ưu nhất cho việc nhân nhanh cụm chồi của cây lan Hoàng Thảo thu được trong thí nghiệm 4 và 5 Kinetin ở nồng

độ tối ưu đó sẽ được chọn để bổ sung kết hợp với α-NAA vào môi trường nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng Thảo Kèn theo các công thức sau:

(ĐC = Công thức tốt nhất của thí nghiệm 4 và thí nghiệm 5)

Thí nghiệm được tiến hành cấy vào mỗi bình 5 cụm, mỗi cụm 10 protocorm đã phát sinh chồi Mỗi công thức cấy vào 5 bình, 3 lần nhắc lại Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu sống, số lượng chồi/cụm, HSN chồi

Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của dịch nghiền chất hữu cơ tự nhiên đến khả

năng nhân nhanh cụm chồi loài lan Hoàng Thảo Kèn

CT1: ĐC

CT2: ĐC + 60g/L chuối chín

CT3: ĐC + 60g/L khoai tây

CT4: ĐC + 200mL nước dừa

(ĐC = Công thức tốt nhất của thí nghiệm 4, thí nghiệm 5 và thí nghiệm 6) Thí nghiệm được tiến hành cấy vào mỗi bình 5 cụm, mỗi cụm 10 protocorm đã phát sinh chồi Mỗi công thức cấy vào 5 bình, 3 lần nhắc lại Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu sống, số lượng chồi/cụm, HSN chồi

3.5.4 Nội dung 4: Tạo rễ cho chồi

Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng tạo rễ lan Hoàng

số lượng rễ trung bình/chồi, chiều dài rễ trung bình/chồi

3.5.5 Nội dung 5: Ra cây tại vườn ươm

Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây in vitro

lan Hoàng Thảo Kèn ngoài vườn ươm

CT1: Trồng trên xơ dừa

CT2: Trồng trên rong biển

CT3: Trồng trên xơ dừa : Rong biển theo tỉ lệ 1:1

Thí nghiệm được tiến hành 3 công thức, mỗi công thức 3 khay, mỗi khay

30 cây, chiều cao 3cm, 5 lá, 4 rễ, cây cách cây 3cm, hàng cách hàng 4cm Các cây được tưới giữ ẩm hằng ngày, đồng thời sử dụng chế phẩm dinh dưỡng qua lá Komix phun theo khuyến cáo của nhà sản xuất Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết

Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của chiều cao, số lá, số rễ cây in vitro đến tỷ

lệ sống của lan Hoàng Thảo Kèn ngoài vườn ươm

CT1: Cây cao 2 cm, 3 lá, 3 rễ

CT2: Cây cao 3 cm, 4 lá, 3 rễ

CT3: Cây cao 4 cm, 5 lá, 4 rễ

Thí nghiệm được tiến hành 3 công thức, mỗi công thức 3 khay, mỗi khay

30 cây, cây cách cây 3cm, hàng cách hàng 4cm Các cây được tưới giữ ẩm hằng ngày, đồng thời sử dụng chế phẩm dinh dưỡng qua lá Komix phun theo khuyến cáo của nhà sản xuất Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết

3.6 ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM

Nhóm thí nghiệm trong phòng: Các thí nghiệm được thực hiện trong

phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ sinh học - khoa Nông học – Trường Cao đẳng Nông Lâm Đông Bắc – Minh Thành – Quảng Yên – Quảng Ninh với các điều kiện:

- Mẫu cấy trên môi trường khử trùng 1,4atm, 1210C trong thời gian 20 phút

- pH môi trường 5,8

- Thể tích môi trường: 50ml/1 bình

- Cường độ anh sáng: 2000lux

- Thời gian chiếu sáng: 16h/ngày

- Nhiệt độ: 25 ± 20C

Nhóm thí nghiệm ở vườn ươm: Thí nghiệm được tiến hành trong nhà

nuôi trồng lan có mái che của Bộ môn Công nghệ sinh học - khoa Nông học – Trường Cao đẳng Nông Lâm Đông Bắc – Minh Thành – Quảng Yên – Quảng Ninh

3.7 CÁC CHỈ TIÊU THEO DÕI VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ

- Các chỉ tiêu theo dõi trong nuôi cấy in vitro:

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = (Tổng số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu cấy) x 100

Tỷ lệ mẫu sống (%) = (Tổng số mẫu sống/Tổng số mẫu cấy) x 100

Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%) = (Tổng số mẫu hình thành protocorm/Tổng

Chiều cao cây (cm) = Khoảng cách từ đầu mút rễ đến đầu mút lá

Chiều dài rễ (cm) = Khoảng cách từ gốc rễ đến đầu mút rễ

Tổng số lá = Tổng số lá trên cây thí nghiệm

Số rễ = Tổng số rễ trên cây thí nghiệm

- Các chỉ tiêu theo dõi trong vườn ươm:

Tỷ lệ cây sống (%) = (Tổng số cây sống/Tổng số cây đưa ra trồng ngoài vườn ươm) x 100

3.8 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

Xử lý số liệu theo chương trình IRRISTART 5.0 và phần mềm Excel 2010

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 KẾT QUẢ

4.1.1 Gieo hạt trong điều kiện in vitro

Hạt lan được xem là nguồn vật liệu nhân giống rất có ý nghĩa và hiệu quả Bởi hạt là nơi tương đối sạch trên 95% Vì hạt là phôi, là nơi mà các tác nhân gây bệnh hại khó có thể tấn công tới, ngay cả các bệnh hại do vi khuẩn hay virus Do

đó, khi nhân giống từ hạt sẽ tạo ra nguồn cây giống tương đối sạch bệnh Việc

gieo hạt thành công trong điều kiện in vitro góp phần rất lớn cho các nghiên cứu

khác, nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường hiện nay là tạo ra các giống, loài lan mới

có những đặc tính mà người ta mong muốn

Nhiều công trình nghiên cứu trong nước và trên thế giới đã công bố kết quả nghiên cứu khử trùng mẫu quả của các giống lan (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2004) Kế thừa các kết quả đó chúng tôi tiến hành khử trùng quả lan 5 tháng tuổi, lấy hạt cấy rải đều trên bề mặt môi trường đã được chuẩn bị Hạt lan mới gieo sẽ rất mịn và có màu vàng chanh

Sau 4 tuần nuôi cấy thu được kết quả như sau:

Tỷ lệ mẫu sống đạt 100%

Sau 4 tuần nuôi cấy đã thấy phát sinh protocorm và số lượng protocorm đã tăng lên 100% sau 6 tuần nuôi cấy

(Sau 4 tuần nuôi cấy) (Sau 8 tuần nuôi cấy)

Hình 4.1 Kết quả gieo hạt lan Hoàng Thảo Kèn