Nghiên cứu nhân giống in vitro cây khoai lang nhật dòng djf khóa luận tốt nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY KHOAI LANG NHẬT DÒNG DJF GVHD: THS LUYỆN THỊ MINH HIẾU SVTH: TRIỆU VĂN KHÁNH MSSV: 18070027 LỚP: 21SH01 BÌNH DƯƠNG – 2022 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRIỆU VĂN KHÁNH NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY KHOAI LANG NHẬT DÒNG DJF LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH GVHD: THS LUYỆN THỊ MINH HIẾU BÌNH DƯƠNG – 2022 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình Trường Đại học Bình Dương, cán giáo viên hướng dẫn Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu Trường Đại học Bình Dương, qúy thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học tận tình giảng dạy cung cấp kiến thức cần thiết, bổ ích để tơi hồn thành tốt trình học tập thực tập Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Luyện Thị Minh Hiếu ThS Lê Ngọc Phương trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn chân thành đến tất người thân, bạn bè, người bên cạnh động viên, tạo điều kiện cho tơi hồn thành q trình học tập Xin chân thành cảm ơn! Bình Dương, ngày 20 tháng 08 năm 2022 (Sinh viên thực hiện) Triệu Văn Khánh i TÓM TẮT Cây khoai lang (Ipomoea batatas L.) lương thực lấy củ chiếm vị trí quan trọng giới Hiện nay, nhu cầu tiêu thụ củ khoai lang người tiêu dùng nhà máy chế biến tăng Tuy nhiên, suất khoai lang chưa cao, giống bị thoái hoá, tạp lẫn, bị sâu bệnh gây hại Hơn nữa, khoai lang chủ yếu sản xuất phương pháp giâm hom củ, phương pháp tốn nhiều thời gian hệ số nhân khơng cao, giống dễ bị suy thối Trong đó, phương pháp ni cấy mơ cho hiệu cao Nhằm xây dựng quy trình vi nhân giống khoai lang, đề nghị thực đề tài “Nhân giống in vitro khoai lang Nhật đoạn thân mang chồi ngủ” Nội dung đề tài đánh giá khả khử trùng viên khử trùng y tế Presept (hợp chất khử trùng tổng hợp, tuyệt đối an tồn cho người mơi trường xung quanh) để tạo nguồn mẫu khoai lang in vitro Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng, hợp chất tự nhiên thích hợp cho việc tạo chồi, tạo rễ khoai lang in vitro Từ kết thí nghiệm thu kết luận sau: Đối với khả khử trùng Presept để tạo nguồn mẫu nồng độ viên/lít Presept (ứng với 15g/l) thích hợp để khử trùng đoạn thân mang chồi ngủ khoai lang Nhật thời gian 25 phút với tỷ lệ mẫu sống đạt 60,8% Đối với việc tạo chồi, môi trường MS + 0,3 mg/l BA thích hợp nhất, cho số chồi cao 5,56 chồi/cây, chiều cao chồi 1,96 cm Trong việc tạo rễ, môi trường MS + 0,1 mg/l IBA mang lại hiệu cao nhất, với tỷ lệ tạo rễ 100%, số rễ trung bình tạo 3,61 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình 5,48 cm/rễ, rễ to, nhiều lông hút ii SUMMARY Sweet potato (Ipomoea batatas L.) is an important tuber crop in the world Currently, the demand for sweet potato tubers of consumers and processing plants is increasing However, the yield of sweet potatoes is still not high, due to the varieties being degraded, mixed, and damaged by pests and diseases Moreover, sweet potato plants are mainly produced by cuttings or tubers, this method is time consuming and the multiplier is not high, the variety is easily degraded Meanwhile, the tissue culture method is effective higher In order to develop a micropropagation process of sweet potato plants, I was proposed to carry out the project "In vitro propagation of Japanese sweet potato by stem segments bearing dormant buds" The main content of the thesis is to evaluate the sterilization ability of Presept medical disinfectant tablets (synthetic disinfectant compound, absolutely safe for humans and the surrounding environment) to create clean in vitro sweet potato samples Investigate the effects of growth regulators, natural compounds suitable for in vitro shoot and root formation of sweet potato plants From the experimental results, the following conclusions were obtained: For the sterilization ability of Presept to create a clean sample source, the concentration of tablets/liter of Presept (corresponding to 15g/l) is suitable for disinfecting the stem bearing the dormant buds of Japanese sweet potato plants in 25 minutes with a survival rate of 60.8% For shoot formation, MS + 0.3 mg/l BA medium was the most suitable, giving the highest number of shoots was 5.56 buds/plant, and the shoot height was 1.96 cm In rooting, MS + 0.1 mg/l IBA medium gave the highest efficiency, with the rooting rate of 100%, the average number of roots created was 3.61 roots/bud, the average root length average is 5.48 cm/root, big roots, many hairy suckers iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài nghiên cứu 1.3 Mục tiêu nghiên cứu 1.4 Nội dung nghiên cứu Chương 2: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu Khoai lang Nhật 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Nguồn gốc phân bố 2.2 Đặc điểm thực vật học, sinh trưởng phát triển khoai lang 2.2.1 Đặc điểm thực vật học 2.2.2 Đặc điểm sinh trưởng phát triển khoai lang 2.3 Một số giống khoai lang trồng Việt Nam 2.3.1 Giống khoai lang Hoàng Long 2.3.2 Giống khoai lang HL4 2.3.3 Giống khoai lang HL518 2.3.4 Giống khoai lang Nhật dòng DJF .7 2.4 Tình hình nghiên cứu khoai lang nước giới 2.5.Tình hình sản xuất khoai lang tiêu thụ nước giới 2.5.1 Trên giới .8 2.5.2 Ở Việt Nam .9 2.6 Quy trình nhân giống In vitro 10 iv 2.6.1 Khử trùng mẫu cấy 10 2.6.2 Tái sinh mẫu cấy .10 2.6.3 Nhân nhanh mẫu cấy 10 2.6.4 Tạo hoàn chỉnh 10 2.6.5 Đưa vườn ươm 10 2.7 Thành phần hóa học môi trường nuôi cấy tế bào thực vật 11 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Thời gian địa điểm thí nghiệm 19 3.2 Vật liệu thí nghiệm 19 3.2.1 Đối tượng thí nghiệm .19 3.2.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 19 3.2.3 Môi trường nuôi cấy .19 3.2.5 Điều kiện nuôi cấy 19 3.3 Thí nghiệm 1: Đánh giá khả khử trùng viên Presept việc tạo nguồn vật liệu khoai lang Nhật DJF in vitro ban đầu 20 3.3.1 Phương pháp thí nghiệm .20 3.3.3 Bố trí thí nghiệm .20 3.3.4 Chỉ tiêu theo dõi 21 3.4.Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP nước dừa lên khả tạo chồi in vitro khoai lang Nhật DJF 21 3.4.1 Phương pháp thí nghiệm .21 3.4.2 Bố trí thí nghiệm .21 3.4.3 Chỉ tiêu theo dõi .22 3.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng hợp chất Auxin, nước dừa đến khả tạo rễ chồi in vitro khoai lang Nhật DJF 22 3.5.1 Phương pháp thí nghiệm .22 3.5.2 Bố trí thí nghiệm .22 3.5.3 Chỉ tiêu theo dõi .23 3.6 Phương pháp xử lý số liệu 23 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .24 4.1 Hiệu phương thức khử trùng viên Presept lên đoạn thân mang mắt chồi ngủ khoai lang DJF tạo nguồn mẫu ban đầu 24 v 4.2 Ảnh hưởng nước dừa nồng độ BAP lên khả tạo chồi in vitro khoai lang Nhật DJF 25 4.3 Ảnh hưởng hợp chất Auxin đến khả tạo rễ chồi in vitro khoai lang Nhật DJF 29 4.4 Thảo luận 33 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .35 5.1 Kết luận 35 5.2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BAP : 6-Benzylaminopurine IBA : Indole – – butyric acid MS : MS medium (Murashige Skoog, 1962) NAA : α – Naphthaleneacetic acid Đ/C : Đối chứng ND : Nước dừa mg/l : Milligram/lít FAOSTAT : Food and Agriculture Organization of The United Nation vii - Ở nghiệm thức C1 (Đ/C) C2 (MS + 0,5% nước dừa): Ở mơi trường khơng bổ sung chất kích thích sinh trưởng bổ sung 5% nước dừa, rễ khoai lang rễ bình thường tỷ lệ phát sinh rễ sau ngày cấy thấp (33,33%) Số rễ/chồi chiều dài rễ nghiệm thức thấp đạt 1,44 rễ/chồi, chiều dài rễ đạt 3,92 cm/rễ nghiệm thức C1 1,11 rễ/chồi, chiều dài 2,72 cm/rễ nghiệm thức C2 Rễ nghiệm thức có chất lượng kém, rễ ngắn, mảnh lơng hút - Ở nghiệm thức C3 (MS + 0,1 mg/l NAA): Ở môi trường bổ sung 0,1 mg/l NAA, tỷ lệ rễ sau ngày cấy đạt 100%, số rễ trung bình tương đối cao đạt rễ/chồi nhiên chiều dài rễ trung bình tương đối thấp đạt 2,87 cm/rễ Chất lượng rễ tốt, rễ ngắn, đường kính rễ to nhiều lơng hút - Ở nghiệm thức C4 (MS + 0,1 mg/l NAA + 0,3g than): Khi bổ sung thêm than hoạt tính vào mơi trường có 0,1 mg/l NAA tỷ lệ rễ bị giảm (77,78%) so với nghiệm thức C3 có 0,1 mg/l NAA, nhiên chiều dài rễ số rễ/chồi tăng lên Cụ thể, chiều dài rễ trung bình cao số rễ/chồi cao thứ tất nghiệm thức với giá trị đạt 5,85 cm/rễ 3,17 rễ/chồi Chất lượng rễ kém, rễ dài, mảnh, lơng hút - Ở nghiệm thức C5 (MS + 0,1 mg/l IBA): Ở môi trường bổ sung 0,1 mg/l IBA, tỷ lệ rễ sau ngày cấy đạt 100%, số rễ/chồi đạt giá trị cao 3,61 rễ/chồi chiều dài rễ trung bình cao thứ với giá trị 5,48 cm/rễ Chất lượng rễ tốt, rễ dài, đường kính rễ to, nhiều lông hút - Ở nghiệm thức C6 (MS + mg/l IBA): Khi tăng nồng độ IBA lên mg/l IBA tỷ lệ rễ bị giảm mạnh so với nghiệm thức C5 nồng độ 0,1 mg/l IBA (50%) Ngoài ra, số rễ/chồi chiều dài rễ trung bình có xu hướng giảm đi, cụ thể số rễ/chồi đạt 2,61 rễ/chồi chiều dài rễ trung bình 5,05 cm/rễ Chất lượng rễ kém, rễ dài, mảnh lơng hút Từ kết nghiên cứu cho thấy, nghiệm thức C4 C5 cho kết tốt nghiệm thức thí nghiệm tạo rễ Tuy nhiên, chất lượng rễ 31 khoai lang nghiệm thức C5 tốt Vì vậy, tơi kết luận mơi trường để phát triển rễ khoai lang DJF tốt môi trường chứa MS + 0,1 mg/l IBA MS MS + 0,1 NAA + 0,3 than MS + 5% nước dừa MS + 0,1 IBA MS + 0,1 NAA MS + IBA Hình 4.5: Hình thái rễ nghiệm thức tạo rễ sau 14 ngày cấy 32 C1 C2 C3 C4 C5 C6 Hình 4.6: Chiều dài rễ khoai lang Nhật sau 14 ngày cấy nghiệm thức C1: MS; C2: MS + 5% nước dừa; C3: MS + 0,1 mg/l NAA; C4: MS + 0,1 mg/l NAA + 0,3g than hoạt tính; C5: MS + 0,1 mg/l IBA; C6: MS + mg/l IBA 4.4 Thảo luận Trong môi trường bổ sung 0,3 mg/l BA cho kết tạo chồi tốt (2,56 chồi/mẫu) Kết so với nghiên cứu ảnh hưởng BAP lên hệ số nhân chồi khoai lang Nhật Lương Thị Ngọc Tú cộng (2019)[3] cho thấy khả tạo chồi thấp Tuy nhiên, thời gian theo dõi lần cấy nên thí nghiệm cần tiếp tục cấy chuyển lần để có kết xác Với môi trường bổ sung kết hợp cytokinin auxin cho hiệu cao Qua thí nghiệm ta thấy, môi trường bổ sung mg/l BA kết hợp với 0,1 mg/l NAA có xu hướng hình thành mơ sẹo, mơ sẹo có màu vàng xanh thời gian hình thành chồi chiều cao chồi chậm Kết phù hợp với nghiên cứu Skoog Miller (1957)[10] khám phá vai trò tỷ lệ nồng độ chất cytokinin auxin phát sinh chồi: tỷ lệ auxin: cytokinin nhỏ nhỏ mơ có xu hướng tạo chồi BA kết hợp với NAA hay IBA tỷ lệ thấp có xu hướng kích thích phân chia tế bào hình thành mơ sẹo kích 33 thích hình thành chồi Nghiên cứu Sivparsad Gubba[8] chứng minh bổ sung BAP kết hợp với NAA nồng độ từ 0,01 – 0,1 mg/l kích thích khả tạo mô sẹo khoai lang Ở môi trường tạo rễ, cấy chồi vào mơi trường có hay khơng có auxin, mẫu cấy có khả tạo rễ (Bảng 4.3) Sự hình thành rễ tùy thuộc vào kiểu gen, chất nồng độ chất điều hịa tăng trưởng thực vật mơi trường ni cấy Trong thí nghiệm này, mơi trường bổ sung 0,1 mg/l IBA cho kết tạo rễ tốt (3,61 rễ/chồi) Kết phù hợp với nghiên cứu Geleta Dugassa Tileye Feyissa[12] bổ sung 0,1 mg/l NAA cho thấy khả tạo rễ cao Ngoài ra, thí nghiệm bổ sung nồng độ IBA cho hiệu tạo rễ cao so với NAA Kết phù hợp với nghiên cứu LudwigMüller[11] chứng minh IBA chất kích thích tạo rễ tốt nồng độ so với IAA NAA 34 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau tiến hành thí nghiệm đề tài, tơi xin đưa số kết luận quy trình nhân giống khoai lang Nhật DJF kỹ thuật in vitro sau: - Việc khử trùng viên Presept với nồng độ 15g/l (ứng với viên/l) 25 phút mang lại hiệu khử trùng tốt với đoạn thân mang chồi ngủ khoai lang Nhật DJF với tỷ lệ mẫu sống đạt 60,8% gần hiệu HgCl2 0,1% tuyệt đối an toàn cho người môi trường xung quanh - Môi trường tạo chồi khoai lang Nhật in vitro tốt môi trường MS + 0,3 mg/l BA với số chồi/cây 2.56 chồi/cây, chiều cao chồi 1,96 cm MS có tác dụng tốt kích thích tăng trưởng chiều cao chồi phục vụ nhân nhanh cắt mắt ngủ Môi trường bổ sung đồng thời BAP NAA bước đầu hình thành đế callus cần thêm vài lần cấy chuyển, theo dõi để đánh giá khả tạo cụm chồi cho dòng khoai lang - Chồi in vitro dòng khoai lang thể hiệu ứng rễ tốt với tất môi trường thử nghiệm, kể MS đối chứng Trong mơi trường thích hợp để tạo rễ cho chồi khoai lang Nhật môi trường MS + 0,1 mg/l IBA với tỷ lệ tạo rễ 100%, số rễ trung bình tạo 3,61 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình 5,48 cm/rễ, chất lượng rễ tốt sau tuần nuôi tạo rễ 5.2 Kiến nghị Tiếp tục thử nghiệm nhiều hợp chất khử trùng mẫu khác để tăng tỷ lệ mẫu lên mức tối đa Theo dõi phát triển chồi in vitro nghiệm thức nhân nhanh lần cấy chuyển để so sánh hệ số nhân chồi xác chúng sau nhiều lần cấy chuyển Thử nghiệm IBA kết hợp với than hoạt tính thí nghiệm tạo rễ để rút ngắn thời gian tạo rễ hoàn chỉnh xuống tuần 35 Đánh giá hiệu phương thức huấn luyện in vitro vườn ươm để phác thảo quy trình vi nhân giống khoai lang Nhật dịng DJF đầy đủ 36 QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO KHOAI LANG NHẬT DỊNG DJF (Cây mẹ dịng DJF) tuần (Tạo nguồn mẫu sạch) tuần (Nhân chồi) tuần Vườn ươm (Tạo rễ) 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Trần Thị Dung 2009 Bài giảng nuôi cấy mô tế bào thực vật Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh [2] Nguyễn Viết Hưng, Giáo trình Cây khoai lang, NXB Nơng nghiệp Hà Nội – 2010 [3] Lương Thị Ngọc Tú, Trần Đình Hợp, Trần Thị Thanh Phương, Nguyễn Nữ Thanh Linh, Nguyễn Thị Thanh Tâm Nghiên cứu nhân giống khoai lang Nhật phương pháp ni cấy mơ tế bào Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(104)/2019 Tài liệu nước [7] Austin, D F 1977 Another look at the origin of the sweetpotato (Ipomoea batatas) [8] B J Sivparsad and A Gubba Development of an efficient plant regeneration protocol for sweet potato (Ipomoea batatas L.) cv Blesbok [9] N C Onwubiko, C Ijeoma Ihezie and M U Mozie In vitro Regeneration of Sweet Potato (Ipomea batatas (L.) Lam.) from Node Explants [10] Skoog F, Miller CO 1957 Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro Symp Soc Exp Biol 11:118-131 [11] Jutta Ludwig-Müller Indole-3-butyric acid in plant growth and development [12] Geleta Dugassa and Tileye Feyissa In vitro production of virus-free sweet potato [ipomoea batatas (l.) Lam] by meristem culture and thermotherapy Tài liệu Web [4] Khoa học cho nhà nông 2016 Giới thiệu khoai lang [Thông tin từ mạng internet] http://khoahocchonhanong.com.vn/csdl/Gioi-thieu-ve-cay-khoai-lang.html (tham khảo ngày 15/04/2022) 38 [5] 123doc 2016 Nghiên cứu ảnh hưởng mơi trường khống lên sinh trưởng phát triển khoai lang [Thông tin từ mạng internet] https://123docz.net//document/3364703-de-tai-nghien-cuu-anh-huong-cua-moitruong-khoang-len-su-sinh-truong-va-phat-trien-cua-cay-khoai-lang.htm (tham khảo ngày 20/04/2022) [6] Foodcrops 2010 Giống khoai lang Việt Nam [Thông tin từ mạng internet] http://foodcrops.blogspot.com/2010/01/giong-khoai-lang-o-viet-nam.html (tham khảo ngày 17/04/2022) 39 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần mơi trường khống Khốn đa lượng Hàm lượng mg/l KNO3 1900 NH4NO3 1650 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 Khoáng vi lượng Hàm lượng mg/l Na2.EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 MnSO4.4H2O 22,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 More’s vitamin Hàm lượng mg/l Myo-inositol 100 Nicotinic acid (P.P) Pantotate Calci Pirydoxine (B6) Thiamin-HCl (B1) Biotin (H) 0,01 i Phụ lục 2: Xử lý số liệu Chiều cao chồi sau 30 ngày: ii Số chồi sau 30 ngày: iii Số sau 30 ngày: iv Số rễ sau 14 ngày: v Chiều dài rễ sau 14 ngày: vi