Nghiên cứu nhân giống in vitro lan hoàng thảo vạch đỏ (dendrobium ochraceum de wild)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƯỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HOÀNG THẢO VẠCH ĐỎ (DENDROBIUM OCHRACEUM DE WILD) TRẦN THỊ VÂN Đà Nẵng, năm 2020 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƯỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HOÀNG THẢO VẠCH ĐỎ (DENDROBIUM OCHRACEUM DE WILD) Ngành: Cơng nghệ Sinh học Khóa: 2016-2020 Sinh viên: Trần Thị Vân Người hướng dẫn: TS Võ Châu Tuấn Đà Nẵng, năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu chưa công bố cơng trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tác giả Trần Thị Vân i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực khố luận tốt nghiệp này, tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Võ Châu Tuấn – thầy giáo tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình tơi thực đề tài Tơi xin đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Vũ Đức Hồng, người giúp đỡ tơi nhiều việc trau dồi kiến thức kĩ thực hành thí nghiệm Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Sinh – Môi trường giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình tơi thực đề tài khố luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ vật chất lẫn tinh thần để đạt kết tốt Đà Nẵng, tháng 07 năm 2020 Sinh viên thực Trần Thị Vân ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .2 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu lan Hoàng thảo Vạch đỏ 1.1.1 Đặc điểm sinh thái .3 1.1.2 Đặc điểm hình thái .3 1.2 Điều kiện môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến nhân giống in vitro thực vật 1.2.1 Điều kiện nuôi cấy .4 1.2.2 Môi trường nuôi cấy 1.3 Những nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo giới Việt Nam .7 1.3.1 Nghiên cứu giới iii 1.3.2 Nghiên cứu nước CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .11 2.1 Vật liệu 11 2.1 Phương pháp nghiên cứu 11 2.1.1 Phương pháp khử trùng mẫu vật 12 2.1.2 Phương pháp nhân nhanh protocorm .12 2.1.3 Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro 12 2.1.4 Phương pháp tạo rễ in vitro – tạo hoàn chỉnh 12 2.1.5 Phương pháp trồng lan in vitro giá thể buồng sinh trưởng thực vật 13 2.1.6 Phương pháp xử lý thống kê 13 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .14 3.1 Đánh giá hiệu khử trùng mẫu vật 14 3.2 Ảnh hưởng chất Kinetin đến khả nhân nhanh protocorm lan Hoàng thảo Vạch đỏ………………………………………………………………………………… 16 3.3 Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi in vitro lan Hoàng thảo Vạch đỏ…………………………………………………………………………… 18 3.3.1 Ảnh hưởng chất BA đến khả nhân nhanh chồi in vitro lan Hoàng thảo Vạch đỏ………………………………………………………………………………… 18 3.3.2 Ảnh hưởng BA IBA đến khả nhân chồi in vitro lan Hoàng thảo Vạch đỏ………………………………………………………………………………… 21 3.4 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ in vitro lan Hoàng thảo Vạch đỏ 24 3.5 Ảnh hưởng giá thể đến khả sống sinh trưởng lan Hoàng thảo Vạch đỏ in vitro 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 Kết luận………………………………………………………………………………29 2.Kiến nghị …………………………………………………………………………… 29 iv TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC 34 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BA : 6-benzyl adenine BAP : 6-benzylaminopurine Cs : Cộng CW : Coconut water (nước dừa) ĐHST : Điều hòa sinh trưởng IAA : Indole 3-acetic acid IBA : Indole 3-butyric acid Kin : Kinetin L : Lít MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-naphthalen acetic acid NXB : Nhà xuất vi DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến 14 hiệu khử trùng lan Hoàng thảo Vạch đỏ sau tuần nuôi cấy 3.2 Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhanh nhân nhanh 16 protocorm từ hạt sau tuần nuôi cấy 3.3 Ảnh hưởng BA đến khả nhân chồi in vitro 18 lan Hoàng thảo Vạch đỏ sau tuần nuôi cấy 3.4 Ảnh hưởng BA IBA đến khả nhân chồi in 21 vitro lan Hoàng thảo Vạch đỏ sau tuần nuôi cấy 3.5 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ in vitro lan 24 Hoàng thảo Vạch đỏ sau tuần nuôi cấy 3.6 Ảnh hưởng loại giá thể đến khả sống sinh trưởng in vitro lan Hoàng thảo Vạch đỏ trồng buồng sinh trưởng thực vật sau tuần vii 27 DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu hình Tên hình Trang 2.1 Cây lan Hồng thảo Vạch đỏ tự nhiên 11 3.1 Sinh trưởng protocorm môi trường sau 17 tuần nuôi cấy 3.2 Cụm chồi in vitro lan Hoàng thảo Vạch đỏ sau 19 tuần nuôi cấy 3.3 Chồi in vitro lan Hoàng thảo Vạch đỏ sinh trưởng 22 môi trường BA kế hợp với IBA sau tuần nuôi cấy 3.4 Chồi tạo rễ in vitro lan Hồng thảo Vạch đỏ sau 25 tuần ni cấy 3.5 Cây in vitro lan Hàng thảo Vạch đỏ sau tuần ươm trồng buồng sinh trưởng thực vật loại giá thể khác viii 28 A B a a C D Hình 3.3 Chồi in vitro lan Hoàng thảo Vạch đỏ sinh trưởng môi trường BA kế hợp với IBA sau tuần nuôi cấy (A) mg/l BA + 0,25 mg/l IBA; (B) mg/l BA + 0,5 a a IBA; (D) mg/l BA + mg/l IBA mg/l IBA; (C) mg/l BA + 0,75 mg/l Bảng 3.4 cho thấy việc kết hợp BA IBA cho tỷ lệ chồi tương đồng, khả phát sinh chồi mơi trường có khác nhau, theo xử lý thống kê khơng có khác biệt Ở nồng độ IBA 0,25 mg/l, số chồi đạt 2,28 chồi/mẫu, chiều cao 1,82 cm/chồi Số chồi cao đạt 2,44 chồi/mẫu môi trường bổ sung mg/l BA kết hợp 0,5 mg/l IBA 0,75 mg/l IBA với chiều cao 1,62 cm/chồi 1,78 cm/chồi Khi tăng nồng độ IBA lên 1mg/l hệ số nhân chồi giảm xuống 2,38 chồi/ mẫu, chiều cao đạt 1,8 cm/chồi Theo nguyên lý chung nuôi cấy mô tế bào thực vật, sử dụng phối hợp cytokinin auxin với nồng độ tỷ lệ thích hợp khơng nâng cao hệ số nhân chồi mà cịn có tác dụng tốt đến chất lượng chồi in vitro Nhiều kết nghiên cứu khẳng định hiệu phối hợp auxin cytokinin đến hệ số nhân nhanh chồi nhiều đối tượng thực vật khác Năm 2018, Nguyễn Thị Lài cs nghiên cứu nhân giống lan Hoàng thảo Nghệ tâm (D loddigesii Rolfe) phương pháp nuôi cấy 22 lát mỏng tế bào kết luận rằng, bổ sung tổ hợp BA IBA vào môi trường nuôi cấy có tác động rõ rệt đến q trình hình thành chồi từ cụm protocorm sau tuần nuôi cấy Ở nồng độ 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA, tỷ lệ tái sinh chồi cao đạt 6,8 chồi/mẫu với chiều cao chồi đạt 2,86 cm, cao hẳn so với sử dụng 1,5 mg/l BA riêng lẻ (tỷ lệ tái sinh 1,52 chồi/mẫu, chiều cao chồi 1,3 cm) Tuy nhiên nghiên cứu tôi, đối chiếu kết bảng 3.3 bảng 3.4 thấy việc sử dụng BA kết hợp với IBA cho hệ số nhân chồi thấp so với sử dụng BA đơn lẻ Khi sử dụng BA IBA với nồng độ mg/l BA với 0,5 mg/l IBA 0,75 mg/l IBA, hệ số nhân chồi cao đạt 2,44 chồi/mẫu, với chiều cao 1,62 cm/chồi 1,78 cm/chồi Trong việc sử dụng BA riêng lẻ nồng độ mg/l có hệ số nhân chồi cao hẳn, đạt 3,63 chồi/mẫu, chiều cao 2,13 cm Hiện chưa có nghiên cứu việc sử dụng BA riêng lẻ hiệu so với BA kết hợp với IBA nhân nhanh chồi in vitro lan Hoàng thảo có số nghiên cứu lồi thực vật khác Phạm Thị Thu Hằng cs (2013) nghiên cứu nhân nhanh in vitro trầu bà cánh phượng Kết nghiên cứu cho thấy môi trường MS bổ sung mg/l BA môi trường tối ưu nhân nhanh chồi in vitro, với hệ số nhân chồi 5,01, chiều cao đạt 0,95cm sau tuần nuôi cấy Tuy nhiên bổ sung vào môi trường ni cấy 0,5 – 1,0 mg/l IAA hay IBA hệ số nhân chồi thay đổi khơng có ý nghĩa mặt thống kê so với môi trường bổ sung mg/l BA Khi tăng nồng độ IAA hay IBA lên 1,5 – 2,0 mg/l hệ số nhân chồi có xu hướng giảm Kết nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu tơi Có thể thấy việc sử dụng cytokinin auxin nhân nhanh chồi in vitro lúc hiệu so với sử dụng cytokinin riêng lẻ, tùy thuộc vào đối tượng mà tác động khác đến hệ số nhân chồi chúng Như môi trường MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung mg/l BA mơi trường thích hợp để nhân nhanh chồi in vitro lan Hoàng thảo Vạch đỏ, với hệ số nhân chồi cao đạt 3,63 chồi/mẫu, chiều cao đạt 2,13cm sau tuần nuôi cấy 23 3.4 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ in vitro lan Hoàng thảo Vạch đỏ IAA, IBA, NAA auxin có tác dụng kích thích hình thành kéo dài rễ Do chất gây giảm độ pH thành tế bào nên hoạt hóa enzym phân hủy polysaccharide pectin methylesterase liên kết sợi cellulose làm chúng lỏng lẻo Vách tế bào mềm trở nên lỏng lẻo làm tế bào kéo dài Tùy theo loại auxin mà tác dụng kéo dài khác (Đặng Thị Thắm cs, 2018) Ở nghiên cứu này, sử dụng IBA để khảo sát ảnh hưởng đến khả tạo rễ lan Hoàng thảo Vạch đỏ, kết trình bày bảng 3.6 Bảng 3.5 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ in vitro lan Hồng thảo Vạch đỏ sau tuần ni cấy IBA (mg/l) Tỷ lệ rễ (%) Số rễ/cây Chiều dài rễ (cm) 0,25 53,33 1,80b ± 1,91 0,71a ± 0,84 0,5 83,33 3,07a ± 1,74 0,78a ± 0,46 0,75 90,0 3,83a ± 1,80 0,90a ± 0,48 1,0 83,33 3,63a ± 1,83 0,79a ± 0,55 0,93 0,31 LSD Các chữ khác cột sai khác ó ý nghĩa thống kê p