Nghiên cứu nhân giống in vitro lan hoàng thảo phi điệp tím dendrobium anosmum lindl

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THU HƢỜNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HỒNG THẢO PHI ĐIỆP TÍM (DENDROBIUM ASOMUM LINDL.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THU HƢỜNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HOÀNG THẢO PHI ĐIỆP TÍM (DENDROBIUM ASOMUM LINDL.) Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Hải Yến THÁI NGUYÊN - 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thực hướng dẫn TS Nguyễn Thị Hải Yến Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa có cơng bố cơng trình khác Thái Nguyên, tháng 11 năm 2016 Tác giả luận văn Nguyễn Thu Hƣờng ii LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Hải Yến, Giảng viên Khoa Khoa học Sự sống, Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên, người trực tiếp hướng dẫn tận tình chu đáo tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn Đồng thời, xin cảm ơn thầy, cô giáo cán kỹ thuật viên Phịng thí nghiệm Sinh học Khoa Khoa học Sự sống tạo điều kiện thời gian sở vật chất cho tơi suốt q trình học tập làm luận văn thạc sĩ Cuối xin cảm ơn gia đình, bạn bè tất thầy ln ln động viên, khuyến khích giúp đỡ tơi tiến trình tơi học tập làm luận văn Trong q trình làm luận văn khơng tránh khỏi sai sót, tơi mong nhận đóng góp q báu từ phía thầy bạn bè để tơi có kết tốt Thái Nguyên, tháng 11 năm 2016 Tác giả luận văn Nguyễn Thu Hƣờng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung phong lan 1.1.1 Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) 1.1.2 Lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) 1.1.3 Các phương pháp nhân giống lan 1.2 Sơ lược nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 1.2.1 Các hướng nghiên cứu ứng dụng ưu kĩ thuật nuôi cấy mô - tế bào 10 1.2.2 Các phương thức nuôi cấy mơ tế bào nhân giống vơ tính 11 1.2.3 Các giai đoạn nhân giống in vitro 12 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy mơ 13 1.3 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro lan Dendrobium 14 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 15 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 16 Chƣơng 2: 18 2.1 Vật liệu 18 18 2.1.2 Dụng cụ hóa chất 18 iv 2.1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 19 2.2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 20 2.2.3 Chuẩn bị số thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy 21 2.2.4 Chuẩn bị giá thể 21 2.2.5 Điều kiện nuôi cấy in vitro 21 2.2.6 Bố trí thí nghiệm 21 2.2.7 Các tiêu theo dõi 24 2.2.8 Xử lý số liệu 24 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy 25 3.1.1 Kết khử trùng mẫu hạt phong lan 25 3.2 Kết tái sinh chồi 26 3.2.1 Kết tái sinh chồi từ hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím 26 3.2.2 Kết nhân chồi từ protocorm lan Hồng thảo phi điệp tím 28 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng số kích thích sinh trưởng nhóm Cytokinin đến nhân nhanh cụm chồi lan Hồng thảo phi điệp tím 29 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng khoai tây chuối xanh đến nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium Anosmum Lindl.) 33 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng α - NAA đến khả rễ Hồng thảo phi điệp tím 35 3.6 Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng đến sinh trưởng phát triển lan sau chai trồng bầu 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 Kết luận 40 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đủ ABA Abscisic acid ADN Acid deoxyribonucleic APG III Angiosperm Phylogeny Group III B1 Thiamine B2 Riboflavin BAP - Benzyl adenin purine ĐC Đối chứng EAC Ehrlich ascites cells GA3 Gibberellic acid IAA Indol - - acetic acid IBA Indol - - butyric acid Kinetin - furfurryl - aminopurin KTST Kích thích sinh trưởng MS Murashige and Skoog PM Phytamax RE Robert Ernst THT Than hoạt tính VW Vacin Went USA United States of America 2,4 - D α - NAA 2,4 - Dichlorophenoxy acetic acid α - Naphthalene acetic acid CT Công thức TG Thời gian KT Khử trùng vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết khử trùng hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím HgCl2 0,1% 25 Bảng 3.2 Kết protocorm phát sinh từ hạt Hồng thảo phi điệp tím 27 Bảng 3.3 Kết nhân chồi từ protocorm lồi lan Hồng thảo phi điệp tím sau 50 ngày cấy chuyển 29 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhóm Cytokinin đến nhân nhanh chồi lan Hồng thảo phi điệp tím 30 Bảng 3.5 Ảnh hưởng hàm lượng chuối xanh khoai tây nghiền đến nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 30 ngày 34 Bảng 3.6 Ảnh hưởng α - NAA đến khả tạo rễ lan Hồng thảo phi điệp tím 36 Bảng 3.7 Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng đến sinh trưởng phát triển 38 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hoa phong lan Hồng thảo phi điệp tím Hình 2.1 Quả lồi lan Hồng thảo phi điệp tím 20 Hình 3.1 Hạt Hồng thảo phi điệp tím nảy mầm mơi trường MS chứa 2,0 mg/l BAP sau 30 ngày nuôi cấy 26 Hình 3.2 Protocorm lan Hồng thảo phi điệp tím tạo thành từ hạt mơi trường MS chứa 2,0 mg/l BAP 27 Hình 3.3 Chồi phát sinh từ protocorm mơi trường MS chứa 1,5 mg/l BAP 29 Hình 3.4 Ảnh hưởng BAP kinetin tới nhân nhanh cụm chồi lan Hồng thảo phi điệp tím sau 60 ngày 33 Hình 3.5 Ảnh hưởng chuối xanh khoai tây lên nhân nhanh cụm chồi lan Hồng thảo phi điệp tím sau 60 ngày 35 Hình 3.6 Ảnh hưởng α - NAA đến khả tạo rễ lan sau 30 ngày 37 Hình 3.7 So sánh ảnh hưởng từ chế độ tưới ½ MS tới sinh trưởng phát triển lan so với đối chứng sau 60 ngày 38 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngày nay, hoa cảnh đóng vai trị quan trọng đời sống tinh thần mà ảnh hưởng sâu sắc đến tâm hồn người làm đẹp cho cảnh quan môi trường Do đó, quan tâm phát triển hoa cảnh vấn đề cần thiết Hoa lan loại hoa ưa chuộng hình dáng, màu sắc, kích thước phong phú, đa dạng nên chúng trồng, sản xuất phổ biến trở thành mặt hàng có giá trị kinh doanh, xuất giới Các nước có ngành ni trồng hoa lan phát triển, hàng năm kim ngạch xuất lên đến hàng trăm triệu USD [15] Việt Nam quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thích hợp cho phát triển loài phong lan Theo Phong lan Việt Nam Trần Hợp nước ta có 137 - 140 chi với 1000 lồi phong lan, lồi lan đẹp riêng Lan rừng không rực rỡ màu sắc giống lan ngoại nhập lại đẹp tự nhiên phần lớn có hương thơm ln người chơi lan ưa chuộng Thế giới lan rừng phong phú với nhiều chủng loại, chi phổ biến chi Hoàng thảo (Dendrobium) Hiện nay, Dendrobium trồng nhiều có giá trị kinh tế cao bên cạnh giá trị thẩm mỹ mà Dendrobium đem lại Dendrobium cịn tách chiết để phục vụ cho số ngành công nghiệp mỹ phẩm, y học Với giá trị hoa lan Dendrobium hứa hẹn mang lại nguồn doanh thu to lớn cho ngành sản xuất, kinh doanh mặt hàng Trên thị trường nay, phong lan chủ yếu cung cấp dạng giống khai thác từ rừng, cịn hạt lan khó nảy mầm điều kiện tự nhiên số lượng mọc không nhiều Ngày nay, với công nghệ nhân giống in vitro, người ta tạo từ vài nghìn đến hàng triệu ổn định mặt di truyền từ lan, từ góp phần bảo tồn phát triển nguồn gen loài lan Việt Nam Nhờ ứng dụng nhân giống in vitro vào chi Dendrobium làm cho trở thành loài hoa cắt cành hiệu 28 môi trường bổ sung NAA 0,2 mg/l BAP 1,0 mg/l đạt 83,3%; môi trường bổ sung NAA 0,2 mg/l BAP 1,5 mg/l đạt 83,3%; môi trường bổ sung NAA 0,2 mg/l BAP 2,0 mg/l đạt 100% Như vậy, BAP có ảnh hưởng tới nảy mầm hạt lan Hồng thảo phi điệp tím Mức độ phát sinh protocorm môi trường bổ sung BAP 2,0 mg/l cao (đạt 83,3% thời gian khử trùng 10 phút 100% thời gian khử trùng 15 phút) Dựa vào kết bảng 3.2, nhận thấy thời gian khử trùng không ảnh hưởng đến khả nảy mầm hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím Tỷ lệ nảy mầm hạt khử trùng HgCl2 thời gian 15 phút cao so với thời gian 10 phút 3.2.2 Kết nhân chồi từ protocorm lan Hồng thảo phi điệp tím Do protocorm phát sinh mạnh với mật độ dày đặc sau 90 ngày gieo hạt nên tiến hành tách cụm cấy chuyển protocorm bình sang mơi trường ni cấy có thành phần tương tự Số bình nuôi cấy môi trường lặp lại lần, ngun liệu ni cấy thuộc bình mơi trường gốc Sau 50 ngày nuôi cấy cho thấy, protocorm tiếp tục tạo thành phát triển mạnh, cịn có tượng tạo chồi gần hồn tồn số bình chứa mơi trường Theo dõi trình tạo chồi từ protocorm 50 ngày (Bảng 3.3) cho thấy mơi trường MS có chứa NAA 0,2 mg/l bổ sung BAP 2,0 mg/l có tỷ lệ phát sinh chồi 97,87% cao so với công thức môi trường nhân chồi MS chứa NAA 0,2 mg/l bổ sung BAP 1,0 mg/l (tỷ lệ phát sinh chồi 50,57%) BAP 1,5 mg/l (tỷ lệ phát sinh chồi 78,79%) Như vậy, cho bổ sung BAP với nồng độ 2,0 mg/l tốt cho nhân chồi từ protocorm Kết phù hợp so sánh với kết nhân chồi từ protocorm lan Kim điệp (Dendrobium Chrysotoxum) tác giả Nguyễn 29 Văn Song cộng Các tác giả nhận thấy nhân chồi lan Kim điệp môi trường bổ sung NAA 0,1 mg/l BAP 2,0 mg/l với nước dừa 150 ml/l tốt [6] Bảng 3.3 Kết nhân chồi từ protocorm lồi lan Hồng thảo phi điệp tím sau 50 ngày cấy chuyển Môi trƣờng nhân chồi NAA BAP (mg/l) (mg/l) 1,0 0,2 1,5 2,0 A Số lô thí nghiệm Số cụm protocorm đƣa vào Số cụm protocorm phát sinh chồi Tỷ lệ phát sinh chồi (%) Tổng Tổng Tổng 15 17 30 25 87 30 27 35 40 132 25 20 26 23 94 10 15 12 44 24 20 30 30 104 25 20 25 22 92 66,7 41,2 50,0 48,0 50,57 80,0 74,1 85,7 75,0 78,79 100 100 96,15 95,7 97,87 B Hình 3.3 Chồi phát sinh từ protocorm mơi trường MS chứa BAP 1,5 mg/l (Hình A) BAP 2,0 mg/l (Hình B) sau 50 ngày cấy chuyển 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng số kích thích sinh trƣởng nhóm Cytokinin đến nhân nhanh cụm chồi lan Hồng thảo phi điệp tím 30 Cytokinin có vai trị lớn việc tạo quan thực vật, chúng kích thích mạnh tạo chồi non hoạt động chúng đối kháng với tạo rễ Để nghiên cứu ảnh hưởng cytokinin đến nhân nhanh lan Hồng thảo phi điệp tím, sử dụng môi trường MS + sucrose 30 g/l + agar g/l + nước dừa 100 ml/l + THT g/l bổ sung BAP (nồng độ từ 0,5 mg/l đến 1,5 mg/l ) kinetin (nồng độ từ 0,5 mg/l đến 1,5 mg/l) Thí nghiệm tiến hành cơng thức, cơng thức cấy bình, cụm chồi/bình Thí nghiệm lần nhắc lại Kết theo dõi sau tuần thể bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nhóm Cytokinin đến nhân nhanh chồi lan Hồng thảo phi điệp tím Nồng Nồng Môi độ độ Hệ số nhân Chiều cao trƣờng BAP kinetin chồi chồi (mm) (mg/l) (mg/l) ĐC 0 6,72 ± 0,29 6,3 ± 0,1 ± 0,03 CT1 0,5 7,25 ± 0,06 8,3 ± 0,2 1,1 ± 0,23 CT2 1,0 8,12 ± 0,16 11,1 ± 0,16 1,67 ± 0,17 CT3 1,5 9,75 ± 0,32 11,5 ± 0,24 2,1 ± 0,23 CT4 0,5 6,34 ± 0,16 6,4 ± 0,1 1,2 ± 0,01 CT5 1,0 8,34 ± 0,14 9,2 ± 0,1 1,9 ± 0,13 CT6 1,5 7,56 ± 0,26 8,6 ± 0,02 1,6 ± 0,14 Số lá/chồi Hình thái chồi Chồi nhỏ, xanh nhạt Chồi nhỏ, xanh Chồi nhỏ, xanh đậm Chồi mập, xanh đậm Chồi nhỏ, xanh nhạt Chồi mập, xanh Chồi nhỏ, xanh nhạt BAP (6 - benzyl amino purin) hormone sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có vai trị chủ yếu kích thích phân chia tế bào BAP ảnh hưởng 31 rõ rệt lên hình thành phân hóa quan thực vật, đặc biệt phân hóa chồi Thông qua chế di truyền BAP tác động lên q trình sinh tổng hợp protein, từ ảnh hưởng đến tổng hợp protein, enzyme cần thiết cho phân chia sinh trưởng tế bào Ngoài ra, BAP cịn có tác dụng ngăn chặn già hóa tế bào thực vật, ngăn chặn phân hủy protein, axit nucleic chlorophyll Kinetin hormone sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có cấu trúc phân tử - - furfuryl - aminopurin Tác dụng kinetin kích thích phân chia tế bào, làm chậm q trình già hóa tế bào Thơng qua chế di truyền kinetin tác động lên tổng hợp protein, từ ảnh hưởng đến tổng hợp protein, enzyme cần thiết cho phân chia sinh trưởng tế bào Ở mức thể, kinetin có ảnh hưởng thúc tạo chồi tạo protocorm đối tượng thực vật [1] Kết bảng 3.4 cho thấy tất môi trường có nhân chồi bổ sung BAP Tuy nhiên, có chênh lệch lớn hệ số nhân chồi khả phát triển chồi thay đổi nồng độ BAP Trong đó, mơi trường ĐC không bổ sung BAP, mẫu thu cho hệ số nhân chồi thấp đạt 6,72 Chiều cao chồi, số chồi với chiều cao trung bình chồi 6,3 mm số chồi 1, chồi nhỏ, xanh nhạt Khi bổ sung BAP vào môi trường, tiêu theo dõi có thay đổi Với nồng độ BAP 0,5 mg/l, kết ghi nhận sau: Hệ số nhân chồi đạt 7,25; chiều cao trung bình đạt 8,3 mm số lá/chồi 1,1; chồi nhỏ, xanh Tiếp tục tăng nồng độ BAP lên mg/l thu kết tất tiêu tiếp tục tăng cao hệ số nhân chồi đạt 8,12; chồi cao 11,1 mm có 1,67 lá/chồi; chồi phát triển xanh tốt Chúng tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 1,5 mg/l Qua q trình theo dõi, chúng tơi nhận thấy môi trường cho hệ số nhân chồi cao với hệ số nhân chồi đạt 9,75; chiều cao chồi đạt 11,5 mm số 2,1 lá/chồi, chồi phát triển khỏe mạnh, đồng có màu xanh đậm 32 Kết cho thấy mơi trường ni cấy có bổ sung kinetin nồng độ khác thu kết khác Với nồng độ kinetin 0,5 mg/l, hệ số nhân chồi đạt 6,34; chiều cao trung bình đạt 6,4 mm số lá/chồi 1,2; kinetin nồng độ 1,0 mg/l khả tạo chồi đạt tỷ lệ cao hệ số nhân chồi đạt 8,3; chiều cao chồi đạt 9,2 mm số 1,9 lá/chồi, chồi phát triển khỏe mạnh có màu xanh đậm Khi tiếp tục tăng nồng độ kinetin lên 1,5 mg/l khả tạo chồi lại giảm, hệ số nhân chồi 7,56; chiều cao chồi đạt 8,6 mm số 1,6 lá/chồi Như vậy, kết luận môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar g/l; nước dừa 100 ml/l; THT g/l BAP 1,5 mg/l MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar g/l; nước dừa 100 ml/l; THT g/l kinetin 1,0 mg/l phù hợp để nhân chồi giống lan Hoàng thảo phi điệp tím Tuy nhiên so sánh tác dụng BAP kinetin đến khả nhân chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím chúng tơi nhận thấy với cơng thức mơi trường bổ sung BAP 1,5 mg/l khả sinh trưởng phát triển lan tốt so với công thức môi trường bổ sung kinetin 1,0 mg/l Như vậy, kết luận môi trường thích hợp cho nhân nhanh lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) mơi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar g/l; nước dừa 100 ml/l; THT g/l BAP 1,5 mg/l Khi xét đến chất lượng chồi nhận thấy cytokinin có tác dụng quan trọng đến việc tạo chồi q trình ni cấy lan Hồng thảo phi điệp tím Điển hình với nồng độ cytokinin thấp cho kết tạo chồi thấp Tuy nhiên, tượng khơng bổ sung chất kích thích sinh trưởng cytokinin cho kết tạo chồi, lồi lan có chứa lượng cytokinin nội sinh cao nên tự tạo lượng chồi tương đối dù khơng có bổ sung cytokinin vào mơi trường Đây ưu chi Dendrobium Do nhân giống đối tượng ta không cần phải tiêu tốn lượng chất điều hòa sinh trưởng nhiều, điều vừa kinh tế lại vừa hạn chế 33 tượng đột biến cho mẫu cấy tác dụng phụ chất kích thích sinh trưởng BAP 1,5 mg/l Kinetin 1,0 mg/l Hình 3.4 Ảnh hưởng BAP kinetin tới nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 60 ngày 3.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng hàm lƣợng khoai tây chuối xanh đến nhân nhanh lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium Anosmum Lindl.) Ngoài chất điều tiết sinh trưởng để thúc đẩy q trình ni cấy giúp sinh trưởng nhanh có chất lượng tốt người ta thường bổ sung khoai tây, chuối xanh thành phần khơng xác định có tác dụng kích thích sinh trưởng mô tế bào Khoai tây chuối xanh nhiều tác giả sử dụng đạt kết tốt tác giả Nguyễn Thị Sơn (2011) nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Hoàng thảo long nhãn (Dendrobium fibriatum) [7] Tác giả thu kết tốt bổ sung vào môi trường nuôi cấy hàm lượng định khoai tây chuối xanh Do thí nghiệm chúng tơi sử dụng dịch khoai tây nghiền chuối xanh nghiền để nghiên cứu tác dụng chúng sinh trưởng phát triển lan Hoàng thảo phi điệp tím in vitro Các cụm lan từ thí nghiệm tách chuyển sang môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar g/l; nước dừa 100 ml/l; THT g/l; BAP 1,5 mg/l chuối xanh nghiền, khoai tây nghiền với hàm lượng khác (Bảng 3.5) Thí nghiệm tiến hành cơng thức, cơng thức cấy bình, cụm 34 chồi/bình số chồi đưa vào trung bình chồi/cụm Kết theo dõi sau tuần nuôi cấy Bảng 3.5 Ảnh hƣởng hàm lƣợng chuối xanh khoai tây nghiền đến nhân nhanh cụm chồi lan Hồng thảo phi điệp tím sau 30 ngày Chiều cao Môi trƣờng Số chồi/cụm ĐC 12,6 ± 0,06 15,1 ± 0,16 2,37 ± 0,17 Chồi mập, xanh 15,8 ± 0,12 18,5 ± 0,24 2,8 ± 0,02 Chồi mập, xanh 10,1 ± 0,01 14,8 ± 0,32 2,1 ± 0,01 Chồi nhỏ, xanh 17,6 ± 0,04 21,2 ± 0,04 2,4 ± 0,34 Chồi mập, xanh 19,2 ± 0,06 25,2 ± 2,28 3,1 ± 0,13 Chồi mập, xanh đậm ĐC + 30 g/l chuối xanh) ĐC + 50 g/l chuối xanh) ĐC + 30 g/l khoai tây ĐC + 50 g/l khoai tây chồi (mm) Số lá/chồi Hình thái chồi Kết bảng 3.5 cho thấy môi trường nuôi cấy bổ sung khoai tây nghiền chuối xanh nghiền có ảnh hưởng tốt đến nhân nhanh sinh trưởng lan Hồng thảo phi điệp tím Ở mơi trường ĐC nhân lên thấp so với môi trường khác bổ sung khoai tây nghiền chuối xanh nghiền Môi trường ĐC bổ sung chất KTST chồi tiếp tục phát triển nhiên số theo dõi thấp Số chồi trung bình đạt 12,6 chồi/cụm, chiều cao chồi trung bình 15,1 mm số lá/chồi 2,37 Chồi nhỏ xanh nhạt so với chồi môi trường bổ sung khoai tây nghiền chuối xanh nghiền Với hàm lượng chuối xanh 30 g/l, số chồi trung bình đạt 15,8 chồi/cụm, chiều cao chồi trung bình 18,5 mm số lá/chồi 2,8 Tuy nhiên tăng hàm lượng chuối xanh lên 50 g/l sinh trưởng phát triển chồi bị giảm, số chồi trung bình đạt 10,1 chồi/cụm, chiều cao chồi 35 trung bình 14,8 mm số lá/chồi 2,1 Như vậy, kết cho thấy hàm lượng chuối xanh tốt cho nhân nhanh lan Hồng thảo phi điệp tím 30 g/l Bên cạnh đó, với thí nghiệm bổ sung 30 g/l khoai tây nghiền, số chồi trung bình đạt 17,6 chồi/cụm, chiều cao trung bình đạt 21,2 mm số lá/chồi 2,4 Khi tăng hàm lượng khoai tây lên 50g/l phát triển chồi cao với số chồi trung bình đạt 19,2 chồi/cụm, chiều cao trung bình đạt 25,2 mm số lá/chồi 3,1 Như vậy, so sánh sinh trưởng chồi môi trường có chứa dịch chuối xanh khoai tây nghiền, chúng tơi nhận thấy khoai tây có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng chồi giai đoạn nhân nhanh so với chuối xanh nghiền nên bổ sung vào mơi trường nhân nhanh lan Hồng thảo phi điệp tím khoai tây nghiền Hàm lượng khoai tây phù hợp 50 g/l Chuối xanh 30 g/l Khoai tây 50 g/l Hình 3.5 Ảnh hưởng chuối xanh khoai tây lên nhân nhanh cụm chồi lan Hồng thảo phi điệp tím sau 60 ngày 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng α - NAA đến khả rễ Hồng thảo phi điệp tím α - NAA hormone sinh trưởng thuộc nhóm auxin Nó sinh mô phân sinh vận chuyển xuống phận khác Vai trò α - NAA thúc đẩy sinh trưởng dãn nở tế bào thực vật, tăng 36 cường trình tổng hợp trao đổi chất ADN, protein Ngồi cịn kích thích rễ, kéo dài rễ tham gia vào cảm ứng tạo chồi vơ tính ống nghiệm Để nghiên cứu ảnh hưởng α - NAA đến khả tạo rễ lan Hồng thảo phi điệp tím chúng tơi sử dụng môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar g/l; nước dừa 100 ml/l; THT g/l; khoai tây 50 g/l NAA với nồng độ thay đổi từ 0,2 mg/l đến 0,7 mg/l Kết theo dõi sau tuần trình bày bảng 3.3 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng α - NAA đến khả tạo rễ lan Hồng thảo phi điệp tím Nồng CT độ α – NAA ĐC CT1 0,2 CT2 0,5 CT3 0,7 Tỷ lệ rễ (%) 20 72 80 Số rễ/cây Độ dài rễ (mm) 0,8 ± 0,01 1,5 ± 0,05 3,0 ± 0,11 2,0 ± 0,12 3,9 ± 0,13 5,1 ± 0,02 76 1,88 ± 0,03 4,2 ± 0,08 Đặc điểm rễ Rễ nhỏ, ngắn, màu trắng Rễ nhỏ,màu trắng đục Rễ mập, dài, màu trắng đục Rễ dài, nhỏ, màu trắng đục, chóp rễ có màu xanh Qua bảng 3.6, nhận thấy bổ sung α - NAA với hàm lượng khác có tác dụng khác đến hình thành rễ lan Hồng thảo phi điệp tím: - Ở mơi trường ĐC khơng bổ sung NAA lan có tăng trưởng chiều cao số tỷ lệ rễ thấp đạt 20%, số rễ trung bình/chồi đạt 0,8; độ dài rễ mm Rễ nhỏ, ngắn, màu trắng - Khi mơi trường có bổ sung α - NAA, chồi rễ với tỉ lệ cao Ở nồng độ NAA 0,2 mg/l tỉ lệ rễ đạt 72%; số rễ trung bình/chồi đạt 1,5; độ dài rễ 3,9 mm Rễ nhỏ, màu trắng đục - Khi tăng nồng độ NAA lên 0,5 mg/l tỷ lệ tạo rễ 80%, độ dài rễ lên đến 5,1 mm gấp đôi độ dài so với công thức ĐC số chiều cao tăng lên tương ứng 5,3 mm 4,12 cm Rễ mập, dài, màu trắng đục - Tiếp tục tăng nồng độ NAA lên 0,7 mg/l tỷ lệ rễ, số rễ trung bình/chồi chiều dài rễ giảm tương ứng 1,88; 4; 5; 4,6 Rễ dài, nhỏ, 37 màu trắng đục, chóp rễ có màu xanh Từ kết kết luận rằng, α - NAA thích hợp cho rễ lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) nồng độ α - NAA thích hợp 0,5 mg/l ĐC NAA 0,5 mg/l Hình 3.6 Ảnh hưởng α - NAA đến khả tạo rễ lan sau 30 ngày 3.6 Ảnh hƣởng chế phẩm dinh dƣỡng đến sinh trƣởng phát triển lan sau trồng bầu ọng bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, nước, sâu bệnh chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn Đây giai đoạ in vitro Khi nuôi cấy mô đạt đủ tiêu chuẩn, tiến hành dùng panh gắp khỏi bình ni cấy sau rửa nhẹ nhàng vòi nước cho thật agar tránh để bị nát, để nước, trồng vào cốc nhựa đựng giá thể gồm vỏ thông, dớn, rêu chuẩn bị trước Sau cho vào túi bóng nilon ghim lại ni phịng cấy mơ giàn đèn Tiến hành chăm sóc chế phẩm dinh dưỡng khác nhằm đánh giá ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng tới sinh trưởng lan Thí nghiệm tiến hành công thức (CT1: phun tưới nước lã; 38 CT2: phun tưới ½ MS; CT3 phun tưới phân đầu trâu 501) công thức trồng 20 cây, có chiều cao - 4cm, số - 5, rễ - nhánh Với chế phẩm dùng bình xịt phun sương tưới cho lan - lần/tuần Các tưới giữ ẩm hàng ngày Kết theo dõi sau tuần trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng chế phẩm dinh dƣỡng đến sinh trƣởng phát triển Chế phẩm Nước lã (ĐC) Phân đầu trâu 501 ½ MS Chiều cao (cm) Số lá/cây 4,54 ± 0,15 4,56 ± 0,12 4,86 ± 0,15 4,6 ± 0,03 5,2 ± 0,01 4,8 ± 0,04 ½ MS Đặc điểm Lá xanh nhạt, không rễ mới, rễ cũ có màu xanh nhạt Lá xanh, rễ mới, rễ xanh, nảy chồi Lá xanh, rễ mới, rễ xanh, nảy chồi ĐC Hình 3.7 So sánh ảnh hưởng từ chế độ tưới ½ MS tới sinh trưởng phát triển lan so với đối chứng sau 60 ngày Qua thí nghiệm, nhận thấy loại chế phẩm dinh dưỡng có tác dụng đến khả tăng chiều cao số lan Các lan chăm sóc chế phẩm dinh dưỡng cao so 39 đối chứng phun nước lã Khi phun nước lã chiều cao đạt 4,54 cm, số 4,56; xanh nhạt, khơng rễ mới, rễ cũ có màu xanh nhạt Khi sử dụng chế phẩm dinh dưỡng phân đầu trâu 501 đạt chiều cao trung bình 4,86 cm số 4,6; xanh, rễ mới, rễ xanh, nảy chồi Khi phun ½ MS tiêu theo dõi cao nhất: chiều cao trung bình 5,2 cm, số trung bình 4,8; xanh, rễ mới, rễ xanh, tạo chồi Như vậy, chế phẩm chăm sóc lan giai đoạn chúng tơi sử dụng ½ MS có tác dụng tốt phân đầu trâu 501 Các lan chăm sóc ½ MS sinh trưởng phát triển tốt, rễ thêm chồi sau tuần 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Khử trùng hạt loài Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) HgCl2 0,1% 10 15 phút cho kết tốt, tỷ lệ mẫu vơ trùng đạt 80% ảnh hưởng đến khả nảy mầm hạt Môi trường MS bổ sung NAA 0,2 mg/l BAP 2,0 mg/l có tác dụng tốt đến phát sinh Protocorm từ hạt nhân chồi từ protocorm Môi trường thích hợp cho nhân nhanh cụm chồi lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) mơi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar g/l; nước dừa 100 ml/l; THT g/l BAP 1,5 mg/l Mơi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar g/l; nước dừa 100 ml/l; THT g/l; BAP 1,5 mg/l khoai tây 50 g/l Môi trường thích hợp cho tạo rễ lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) mơi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar g/l; nước dừa 100 ml/l; THT g/l; khoai tây 50 g/l NAA 0,5 mg/l Chế phẩm dinh dưỡng ½ MS có tác dụng tốt phân đầu trâu 501 sinh trưởng phát triển lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) giai đoạn trồng bầu Kiến nghị Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu giá chế phẩm dinh dưỡng thể phù hợp cho vườn ươm Tiếp tục tiến hành nghiên cứu, hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro lan Dendrobium anosmum Lindl nhằm góp phần bảo tồn lan rừng phục vụ cho nhân nhanh giống, phục tráng giống cảnh 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2009), “Nhân giống lan Dendrobium anosmum, Dendrobium mini phương pháp nuôi cấy mô, nghiên cứu loại giá thể trồng lan Dendrobium thích hợp cho hiệu cao”, đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường, Đại học An Giang Trần Hợp (1998), Phong lan Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật Thái Hà (2011), Kỹ thuật trồng lan nhiệt đới, NXB Văn hóa Thơng tin Thanh Loan (2011), Kỹ thuật trồng lan, NXB Thời đại Nguyễn Văn Song (2011), “Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum) - lồi lan rừng có nguy tuyệt chủng”, Tạp chí khoa học Đại học Huế, số 64, tr 127 - 136 Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai (2011), “Nhân giống in vitro giống lan Dendrobium fimbriatum (Lan Hoàng Thảo Long nhãn)”, Tạp chí Khoa học Phát triển, trường Đại học Nơng nghiệp, tập 10, số 2, tr 263 - 271 Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh (2007), “Ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng đến q trình ni cấy phát sinh tế bào soma phơi vơ tính lan (Dendrobium, Phalaenopsis, Cybidium)”, Hội nghị Khoa học Công nghệ 2007, tr 503 - 508 Nguyễn Thanh Tùng, Lê Văn Điệp, Nguyễn Minh Trung, Trương Thị Bích Phượng (2010), “Áp dụng phương pháp ni cấy lát mỏng tế bào nhân giống in vitro Hoàng lan thân gãy (Dendrobium aduncum)”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (3): 361 - 367 10 Vũ Văn Vụ, Lê Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ Sinh học tế bào, NXB Giáo dục 42 11 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2007), Sinh lí học Thực vật, NXB Giáo dục TIẾNG ANH 12 Angiosperm Phylogeny Group (APG), (Octorber 2009), “APG III system” Botanical Journal of the Linnean Society 13 Bijaya P., Deepa T (24, May 2012), “In vitro mass propagation of an epiphytic orchid, Dendrobium primulinum Lindl through shoot tip culture” African Journal of Biotechnology Vol 11 (42), pp 9970 - 9974 14 Maridass M., Mahesh R., Raju G.A., Muthuchelian K (2010) “In vitro propagation of Dendrobium nanum through rhizome bud culture” International Journal of Biological Technology, 1(2), 50 - 54 15 Sana A., Touqeer A., Ishfaq A H., Mehwish Y “In vitro propagation of orchid (Dendrobium nobile) var Emma white” African Journal of Biotechnology Vol 10(16), pp 3097 - 3103, 18 April, 2011 TRANG WEB 16 http://www.hoalanvietnam.org 17 http://www.vnorchids.net/index.php?/topic/11-lan-hoang-thao% 18 https://vi.wikipedia.org/ 19 http://www.vuonhoalan.net/?tab=detailnews&tin=68&title=lan-da-hacphi-diep-dendrobium-anosmum ... góp phần bảo tồn nhân nhanh giống lan rừng phương pháp in vitro Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống lồi lan rừng Dendrobium anosmum Lindl (Hồng thảo phi điệp tím) nhằm bảo... sinh chồi từ phơi hạt lồi lan Hồng thảo phi điệp tím - Nghiên cứu ảnh hưởng số chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin lên q trình nhân nhanh lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum. .. auxin lên q trình hình thành rễ lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl. ) - Tìm hiểu tác dụng số chế phẩm lên sinh trưởng phát triển lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl. )