TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Khái niệm về nhân giống in vitro
Nhân giống in vitro, hay nuôi cấy mô, là phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm, sử dụng môi trường xác định và điều kiện vô trùng Môi trường này bao gồm các chất dinh dưỡng cần thiết như muối khoáng, vitamin, hoocmon tăng trưởng và đường, giúp thúc đẩy sự phát triển của cây trồng.
Phương pháp nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc các cơ quan từ các mô như: thân, lá, rễ ,hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh…
Giới thiệu về họ lan
Cây lan đã được biết đến lần đầu tiên ở phương Đông từ thời vua Thần Nông (2800 TCN) và được sử dụng làm thuốc chữa bệnh Robut Bron (1773 – 1858) là người đầu tiên phân biệt rõ ràng giữa họ lan và các họ khác, góp phần đặt nền tảng hiện đại cho môn học về lan.
Vào năm 1836, ông đã công bố bảng phân loại các tông họ lan (A tabuler view of the Tribes of orchids), và tên gọi mà ông đề xuất vẫn được sử dụng cho đến nay Theo tài liệu, họ lan (Orchidaceae) thuộc bộ lan (Orchidales) và lớp một lá mầm (Monocotyledoneae) Họ lan có mặt ở hầu hết các khu vực trên thế giới, nhưng khoảng 80% trong số đó tập trung ở các vùng nhiệt đới Với khoảng 15.000-35.000 loài, họ lan đứng thứ hai sau họ cúc và phân bố từ vĩ độ 68° đến 56° vĩ nam, chủ yếu tập trung ở các vùng nhiệt đới, đặc biệt là tại châu Á.
Cây lan, đặc biệt là loài kiến lan Cymbidium ensifonymum, lần đầu tiên được biết đến ở Trung Hoa và đã thu hút sự chú ý của châu Âu từ thế kỷ 18 Nhờ vào các thủy thủ thời đó, phong lan đã được mang đến nhiều nơi trên thế giới, bắt đầu từ Vanny rồi đến Bạch Cập, Hạc Đính và Kiến Lan Tại Việt Nam, Gioalas Noureiro, một nhà truyền giáo Bồ Đào Nha, là người đầu tiên khảo sát về lan vào năm 1789 trong cuốn "Flora cochin chinensis", mô tả các loài lan như Aerides, Phaius và Sarcopodium, được ghi lại bởi Ben Tham và Hooker.
“Genera plante rum” (1862 – 1883) (Nguyễn Hữu Huy, Phan Ngọc Cấp –
Năm 1995, sau khi người Pháp đặt chân đến Việt Nam, các công trình nghiên cứu về thực vật mới bắt đầu được công bố đáng kể Trong bộ sách "Thực vật Đông Dương chí" (Flora Genera Indochine), H Leconte đã biên soạn và xuất bản từ những năm 1932 – 1934, mô tả 70 chi và 101 loài thực vật cho cả ba nước Đông Dương Bài viết cũng đề cập đến đặc tính thực vật học của địa lan.
Lan cũng giống như các loại thực vật khác, gồm 6 bộ phận: rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt [5], được mô tả như sau:
Họ lan là nhóm thực vật bao gồm các cây thân thảo, sống lâu năm, thường phát triển trên đất và vách đá vôi Địa lan, khi sống ở đất, thường có củ giả và rễ mập, xum xuê, với các rễ bò dài hoặc ngắn Chúng phát triển thân rễ có kích thước và hình dạng đa dạng, tạo thành các bụi dày hoặc bò xa Hệ rễ nhỏ, đan thành búi, trong khi một số loài có thân và lá kém phát triển lại có hệ rễ dày đặc, đồng thời thực hiện cả chức năng quang hợp Rễ có hình dạng dẹt, bò dài và có màu xanh như lá.
Phong lan có thân ngắn hoặc dài, đôi khi phân nhánh và có thể mang hoặc không mang lá Theo M.E.Pfizer (1882), phong lan chủ yếu thuộc loại sinh trưởng hợp trụ, trong đó hệ thống thân gồm nhiều nhánh lâu năm, có bộ phận nằm ngang hoặc bò dải trên giá thể, thậm chí ẩn sâu trong lòng đất Ngược lại, các loài phong lan sinh trưởng đơn trục rất hiếm gặp.
Các loài phong lan sống phụ có thân cây khó duy trì tư thế thẳng đứng, vì vậy chúng cần các rễ chống đỡ để vươn cao Những đoạn phình lớn tạo thành củ giả là bộ phận dự trữ nước và chất dinh dưỡng, giúp cây sống sót trong điều kiện khô hạn trên cao Hầu hết củ giả có màu xanh bóng, cùng với lá, chúng cũng tham gia vào quá trình quang hợp.
Có ba loại lá lan: lá đứng, lá nửa đứng và lá cong rũ Địa lan chủ yếu là cây tự dưỡng, phát triển hệ thống lá phong phú nhờ quang hợp Lá thường mọc đơn độc, dày đặc ở gốc hoặc cách đều trên thân và củ giả Hình dáng lá đa dạng, từ lá mọng nước, dài hình kim đến lá mỏng, dài, trong khi lá gần gốc có thể giảm thành bẹ hoặc vảy Số lượng lá trên nhánh biến động lớn, với Đông lan chỉ có 2,6 lá/nhánh, trong khi Bạc lan đạt tới 9,1 lá/nhánh Độ dày và chiều dài lá cũng khác nhau, ví dụ như Bích ngọc có lá dài 1cm, trong khi Thanh ngọc có lá dài từ 40-80 cm.
Phiến lá của các loài lan thường có màu xanh bóng, tương tự như chi Lan kiếm (Cymbidium SW) và chi lan Bầu rượu (Calanthe R.Br) Một số loài có màu xanh đậm, điển hình như Hạc Đính Vàng (P Flavum).
Hoa lan có cấu tạo phong phú và đa dạng, với nhiều loài chỉ nở một bông hoa trong mỗi mùa hoặc có cụm hoa với mỗi cụm chỉ một bông Dù hình dáng khác nhau, tất cả hoa lan đều có tổ chức đồng nhất theo mẫu 3, đặc trưng cho lớp một lá mầm, nhưng đã trải qua nhiều biến đổi để tạo ra sự đối xứng qua một mặt phẳng.
Mầm hoa của địa lan hình thành từ đốt thứ 3, thứ 4 gần đáy các giả hành, với hoa thường đứng thẳng hoặc cong và mang nhiều hoa chồi Chồi hoa xuất hiện bên dưới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹ già ra ngoài Mỗi giả hành thường chỉ cho hoa một lần, và chồi hoa thường xuất hiện đồng thời với chồi thân, nhưng chồi hoa có hình dạng no tròn hơn Các lá đầu tiên ở chồi thân mọc ra hai phía như đuôi cá, trong khi lá bao hoa ở chồi hoa ôm chặt quanh phát hoa.
Cọng phát hoa của địa lan không phân nhánh, có chiều dài từ 10cm đến hơn 100cm, mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luân phiên theo đường xoắn ốc Búp hoa khi đủ lớn bắt đầu dang xa khỏi cọng Hoa có 5 cánh gần giống nhau, thực tế chỉ có 2 cánh hoa ở bên trong, còn lại là 3 lá đài bên ngoài Cánh hoa thứ 3 phát triển thành cánh môi, có màu sắc nổi bật và chia thành 3 thuỳ, tạo thành hình dạng nửa ống Hai thuỳ bên ôm lấy trụ, trong khi thuỳ thứ 3 có hình dạng bầu hoặc nhọn, tạo thành chỗ đậu cho côn trùng Giữa 2 cánh môi có 2 gờ dọc màu vàng, bên trong có đĩa mật và đôi khi có tuyến tiết mồ hôi Hoa lưỡng tính với nhị đực và nhị cái gắn chung trên một trụ nhị, nhuỵ hình bán trụ cong về phía trước Nhị ở trên cùng mang 2 khối phấn màu vàng, được đậy bởi nắp màu trắng ngà Cấu trúc này chỉ cho phép hoa địa lan thụ phấn nhờ côn trùng Sau khi thụ phấn, hoa xoay về vị trí cũ và bầu noãn phình to tạo thành quả.
Quả của cây địa lan là loại quả nang, có khả năng nở theo 3-6 đường nứt dọc Hình dạng quả thay đổi từ dài như quả vanilla đến hình trụ ngắn phình ở giữa Khi chín, quả nở ra và phần vỏ vẫn dính lại ở đỉnh và gốc Ở một số loài, quả chín có thể nở theo 1-2 khía dọc hoặc không nứt, với hạt chỉ ra ngoài khi vỏ quả bị mục nát.
Hạt lan có kích thước rất nhỏ, với khối lượng tổng cộng chỉ từ 1/10 đến 1/1000 mg, trong đó không khí chiếm 76-96% thể tích của hạt Do đó, hạt lan gần như không có khối lượng, chỉ là một khối chưa phân hóa trên mạng lưới xốp chứa đầy không khí Thời gian để hạt chín dao động từ 2 đến 18 tháng, nhưng phần lớn hạt thường chết do không tìm thấy nấm cộng sinh cần thiết để nảy mầm Mặc dù hạt lan có thể bay xa theo gió, nhưng khả năng nảy mầm thành cây lại rất hiếm, chỉ xảy ra trong những khu rừng già ẩm ướt ở vùng nhiệt đới.
Đặc điểm thực vật của Địa lan Trần Mộng Xuân
Địa lan Trần Mộng Xuân, với tên khoa học Cymbidium lowianum, thuộc họ Phong lan Đây là loại lan đất với củ giả tròn, lá dài từ 60 – 80cm và trung bình có khoảng 5,1 lá trên một nhánh Chùm hoa có chiều dài từ 70 – 100cm, thường dài hơn lá, với 15-30 bông hoa lớn, mỗi bông dài 12cm, mang màu vàng lục Cánh môi của hoa chia ba thuỳ, màu vàng với đỉnh môi màu đỏ hồng Hiện tại, Địa lan Trần Mộng Xuân được xem là một trong số ít giống lan Sapa có hoa đẹp, nở đúng dịp Tết.
Loài địa lan này chỉ sản sinh một nhánh mỗi năm và có hai đợt mầm vào tháng 3-4 và tháng 9-10 Các mầm xuất hiện vào tháng 9-10 thường phát triển kém và khó có khả năng ra hoa Tốc độ sinh trưởng của địa lan là chậm, đạt chiều cao tối đa vào tháng 6.
Hình 1: Địa lan Trần Mộng Xuân (Cymbidium lowianum)
Thành tựu đạt được trong nuôi cấy mô hoa lan
Năm 1899: Noel Bernard, nhà thực vật người Pháp đã tìm ra vai trò của nấm cộng sinh trong quá trình nảy mầm tự nhiên của hạt lan
Năm 1904, Noel Bernard và Burgeff, hai nhà khoa học người Đức, đã hợp tác phát triển phương pháp gieo hạt lan nhiễm nấm trong chai thạch Phương pháp này đã giúp tăng cường đáng kể số lượng cây con được trồng từ hạt.
Năm 1922, Knudson, một nhà khoa học người Mỹ, đã thành công trong việc thay thế nấm bằng đường trong môi trường thạch để gieo hạt Phương pháp này của ông đã nhanh chóng được áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới.
Năm 1996, Yonco Sagaw và T.Shoji nuôi cấy mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh bên của Cymbidium trên cùng một lúc hai môi trường lỏng và đặc
Giống địa lan là nền tảng quan trọng cho việc nhân giống thông qua nuôi cấy mô tế bào thực vật, với ứng dụng nổi bật trong việc nhân nhanh và phục tráng giống cây trồng Morel (1960) đã phát hiện rằng Meristem của một loài địa lan hầu như không chứa virus, đồng thời ông đã thành công trong việc tạo protocorm Khi nuôi cấy Meristem, các protocorm được cắt và tiếp tục nuôi cấy sẽ tạo ra protocorm mới, và trong điều kiện thích hợp, chúng có thể phát triển thành những cây địa lan con sạch virus.
Nhân giống in vitro đã đạt được nhiều thành công với các chi thuộc họ lan như Hồ Điệp (Phalaenopsis), Cát lan (Cattleya), Hoàng Thảo (Dendrobium), và Kim Tuyến (Anoectochilus) cùng các giống lai của chúng Điều này đã tạo nền tảng vững chắc cho những thành công trong các công trình nuôi cấy mô tế bào sau này.
1.4.2 Nghiên c ứ u ở Vi ệ t Nam Ở nước ta hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu khá thành công về nhân giống lan
Năm 2002, Phạm Thị Liên đã thành công trong việc nghiên cứu nhân giống Invitro cho một số loài địa lan tại miền Bắc Việt Nam, đặc biệt là loài Địa lan Hạc đính nâu Quy trình nhân giống bao gồm khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 15 phút, sau đó đưa mẫu vào môi trường F với 3% đường saccaro, 0,8% Agar, BAP 1,0 mg/l, Kinetin 0,7 mg/l và IBA 0,5 mg/l Để tạo ra cây hoàn chỉnh, môi trường cần thêm 10% nước dừa và 0,5 mg/l NAA.
Năm 2003, trường Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội đã nghiên cứu quy trình nhân giống và nuôi trồng Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis) do Nguyễn Quang Thạch và cộng sự thực hiện Nghiên cứu chỉ ra rằng môi trường thích hợp để tạo vật liệu khởi đầu từ cơ quan sinh dưỡng là sự kết hợp giữa VW và 100 ml/l ND.
Môi trường tối ưu cho việc tạo nguồn vật liệu khởi đầu từ hạt bao gồm 2 mg/l BA, 0,3 mg/l Kinetin và 10g/l đường Để phát sinh protocorm từ lát mỏng tế bào, môi trường tốt nhất là VW + 100 ml/l ND + 0,5 mg/l 2,4D + 0,3 mg/l Kinetin + 10g/l đường Đặc biệt, môi trường VW + 100 ml/l ND + 1g/l pepton + 10g/l đường cùng với 30g khoai tây và 30g cà rốt là lựa chọn lý tưởng cho việc nhân nhanh chồi.
Năm 2004, Tiến sĩ Dương Tấn Nhựt đã thành công trong việc nhân giống in vitro loài lan Hài Hồng quý hiếm bằng phương pháp gây vết thương trước khi tiến hành nuôi cấy.
Năm 2005, Viện Di truyền Nông nghiệp Hà Nội đã nghiên cứu nhân nhanh phong lan Hồ Điệp từ phát hoa và chóp rễ Nghiên cứu của Khuất Hữu Trung và cộng sự chỉ ra rằng môi trường phát sinh chồi từ chồi ngủ của phát hoa có vai trò quan trọng trong quá trình này.
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Gấm và các cộng sự tại Trung tâm Giống và Công nghệ sinh học – trường Đại học Lâm nghiệp vào năm 2007 đã chỉ ra rằng, để nhân giống Lan Ngọc Điểm Tai Trâu (Rhychostylis gigantea) bằng phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm, cần sử dụng môi trường MS với 10% nước dừa, 3% đường, 1g/l than hoạt tính, 1mg/l BAP và 0,1mg/l NAA Để tạo cây hoàn chỉnh từ chồi ngủ của phát hoa, công thức môi trường là MS + 10% nước dừa + 3% đường + 1g/l than hoạt tính + 0,1mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA Quá trình khử trùng quả lan được thực hiện trong 3 phút với cồn 70% và 5 phút với HgCl2 0,1% Môi trường gieo hạt tối ưu được xác định là Knudson với 30 g/l đường, 100 g/l khoai tây, 100ml/l nước dừa, 7 g/l agar và 0,3 mg/l Kinetin.
Môi trường nhân giống cây trồng được thiết lập với công thức gồm 30 g/l đường, 100 g/l khoai tây, 100 ml/l nước dừa, 7 g/l agar, 0,3 mg/l Kinetin, 0,2 mg/l IAA và 0,3 mg/l NAA, cho hệ số nhân thể chồi đạt 4,25 Để tái sinh chồi, công thức tương tự được áp dụng Đối với môi trường kéo dài chồi, thêm 0,2 mg/l GA3 vào công thức trên Cuối cùng, môi trường ra rễ R2 sử dụng Knudson cải tiến với 30 g/l đường, 100 g/l khoai tây, 100 ml/l nước dừa, 7 g/l agar và 0,1 mg/l NAA.
Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô in vitro
1.5.1 D ự a trên tính toàn n ă ng c ủ a t ế bào
Mỗi tế bào trong cơ thể sinh vật chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thích hợp Tuy nhiên, hoạt động của các gen trong từng tế bào, loại mô và giai đoạn sinh trưởng khác nhau, do cơ thể điều hòa hoạt động của chúng.
1.5.2 S ự phân hóa và ph ả n phân hóa t ế bào
Sự phân hóa tế bào là quá trình chuyển đổi các tế bào phôi sinh ban đầu thành các tế bào mô chuyên hóa, mỗi loại tế bào đảm nhận những chức năng khác nhau trong cơ thể.
Cơ thể thực vật trưởng thành là một hệ thống thống nhất, bao gồm nhiều cơ quan chức năng được hình thành từ các loại tế bào khác nhau Tất cả các tế bào này đều xuất phát từ một tế bào đầu tiên, gọi là tế bào hợp tử Trong giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia để tạo ra nhiều tế bào phôi sinh chưa chuyên hóa Sau đó, các tế bào phôi sinh này tiếp tục phát triển thành các tế bào chuyên hóa, đảm nhiệm các chức năng khác nhau cho các mô và cơ quan trong cây.
Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào phân hóa (có chức năng riêng biệt)
Sơ đồ các giai đoạn phân hóa của tế bào
Sự phản phân hóa tế bào là quá trình mà các tế bào đã phân hóa thành tế bào chuyên hóa vẫn giữ được khả năng trở về dạng tế bào phôi sinh Trong những điều kiện thích hợp, các tế bào này có thể tái tạo và phân chia mạnh mẽ, điều này ngược lại với quá trình phân hóa tế bào.
Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa Phản phân hóa tế bào
Sơ đồ mối quan hệ giữa quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào
Sự phân hóa và phản phân hóa là quá trình hoạt hóa và ức chế các gen trong sự phát triển của cá thể Trong giai đoạn nhất định, một số gen được kích hoạt để tạo ra tính trạng mới, trong khi một số gen khác bị ngưng hoạt động Quá trình này được điều khiển bởi chương trình mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào, đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển hài hòa của cơ thể thực vật.
Khi tế bào nằm trong khối mô của cơ thể, chúng thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Việc tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước khối mô sẽ kích thích hoạt hóa các gen của tế bào Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực chất là việc điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật dựa trên sự phân hóa và phản phân hóa, cùng với tính toàn năng của tế bào Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là Auxin và Xytokinin, với tỷ lệ khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau.
Quy trình nhân giống in vitro
1.6.1 Giai đ o ạ n 1: Ch ọ n l ọ c và chu ẩ n b ị cây m ẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro, việc lựa chọn cây mẹ là rất quan trọng Cây mẹ cần phải khỏe mạnh, không có bệnh tật, đặc biệt là không bị nhiễm virus, và đang trong giai đoạn sinh trưởng mạnh mẽ.
Để giảm tỷ lệ nhiễm bệnh và tăng cường khả năng sống sót cũng như sinh trưởng của mẫu, việc nuôi dưỡng, chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả là rất quan trọng trước khi tiến hành lấy mẫu.
1.6.2 Giai đ o ạ n 2: Nuôi c ấ y kh ở i độ ng Đây là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần đảm bảo yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây Mô được lấy từ các phần non của cây (đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ ) có khả năng nuôi cấy thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận trưởng thành khác [17] Mặt khác, khi lựa chọn mô nuôi cấy cũng cần chú ý đến tuổi sinh lý, tuổi sinh lý của mô càng thấp thì độ trẻ hóa càng cao, nuôi cấy dễ thành công Các mô lấy ở thời kỳ sinh trưởng mạnh của cây trong mùa sinh trưởng cho khả năng tái sinh tốt hơn
Xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp, thường dùng các loại hoá chất như HgCL2 0,1% (trong 5-10 phút), NaOCL, Ca(OCl)2 5-7% (trong 15-
Giai đoạn này thúc đẩy sự phát triển của mô nuôi cấy bằng cách kích thích hình thái và gia tăng số lượng thông qua ba phương pháp chính: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và hình thành phôi vô tính.
Để đạt hiệu quả cao trong quá trình nuôi cấy, cần xác định môi trường và điều kiện ngoại cảnh phù hợp Môi trường có nồng độ xytokinin cao sẽ kích thích sự hình thành chồi Thông thường, chế độ nuôi cấy lý tưởng là ở nhiệt độ 25-27°C với 16 giờ chiếu sáng mỗi ngày, cường độ ánh sáng từ 2000 đến 4000 Lux Tuy nhiên, mỗi loại đối tượng nuôi cấy sẽ yêu cầu chế độ nuôi cấy riêng biệt.
1.6.4 Giai đ o ạ n 4: T ạ o cây in vitro hoàn ch ỉ nh Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Môi trường tạo rễ thường được bổ xung một lượng nhỏ Auxin Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng Đối với các phôi vô tính thường chỉ cần gieo chúng trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa nồng độ thấp của xytokinin để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh
1.6.5 Giai đ o ạ n 5: Thích ứ ng cây in vitro ngoài đ i ề u ki ệ n t ự nhiên Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
+ Cây trong ống nghiệm đã đạt được những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây)
Để cây con thích ứng với sự thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm và sâu bệnh, cần thực hiện quá trình huấn luyện trong khoảng thời gian từ 1 đến 2 tuần, tùy thuộc vào từng loại cây Việc này có thể được thực hiện bằng cách đặt bình cây ra ngoài điều kiện tự nhiên và mở nắp bình nuôi.
Để trồng cây in vitro thành công, cần sử dụng giá thể phù hợp, đảm bảo sạch sẽ, tơi xốp và thoát nước tốt Bên cạnh đó, việc điều chỉnh độ ẩm, ánh sáng trong vườn ươm và áp dụng chế độ dinh dưỡng hợp lý cũng rất quan trọng.
Các phương thức nhân giống vô tính in vitro
Sự phát triển của chồi nách được kích thích khi loại bỏ ưu thế ngọn trong quá trình nuôi cấy các đỉnh chồi và đoạn thân có mắt ngủ Phương pháp này thúc đẩy sự phát triển chồi theo hai cách khác nhau.
+ Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách, trường hợp này thường xảy ra khi nuôi cấy cây hai lá mầm
+ Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách, trường hợp này thường gặp ở cây một lá mầm
Để phát triển cây từ tế bào soma, cần thực hiện quá trình phản phân hóa và tái phân hóa, giúp hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp qua giai đoạn phát triển mô sẹo Ở những đối tượng một lá mầm như dứa, chuối và lan, cây thường trải qua giai đoạn protocom, trong đó mẫu cấy tạo ra hàng loạt protocom, cho phép chúng tiếp tục sản sinh protocom mới hoặc phát triển thành cây trưởng thành.
Để tạo phôi vô tính, cần thực hiện quá trình phản phân hóa và tái phân hóa tế bào, giúp các tế bào soma hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo Phôi vô tính có cấu trúc lưỡng cực, bao gồm cả chồi mầm và rễ mầm.
Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất hạt giống nhân tạo.
Một số trường hợp thường gặp trong quá trình nuôi cấy in vitro 16
1.8.1 Tính b ấ t đị nh v ề m ặ t di truy ề n
Nhân giống in vitro nhằm tạo ra quần thể cây đồng nhất với số lượng lớn, tuy nhiên, trong một số trường hợp, phương pháp này có thể dẫn đến sự xuất hiện của biến dị soma.
Sự tác động của các chất kích thích sinh trưởng gây ra tính bất định di truyền, với tần số biến dị thường thay đổi và không đồng nhất Cây được sản xuất từ nuôi cấy tế bào mô sẹo thường có mức độ biến dị cao hơn so với cây được nuôi cấy từ chồi đỉnh.
Tần số biến dị xảy ra phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loại mô cấy, số lần cấy chuyển và kiểu di truyền hay giống cây trồng
Khi khử trùng mẫu để nuôi cấy, các vi sinh vật như nấm và vi khuẩn thường bị loại bỏ Tuy nhiên, một số loại vi khuẩn như Agrobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Erwinnia và Pseudomonas vẫn có thể xâm nhập vào mô dẫn và gây hại khi tế bào bắt đầu phân chia sau 1-2 tuần nuôi cấy Để khắc phục tình trạng này, cần áp dụng các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.
+ Mẫu nhiễm virut: nên sử dụng mẫu nuôi cấy là mô phân sinh đỉnh thì có thể loại bỏ được virut
+ Mẫu nhiễm vi khuẩn: có thể sử dụng kháng sinh như Penicillin, Ampicillin với nồng độ khác nhau tùy vật liệu nuôi cấy
+ Mẫu nhiễm nấm: không nên giữ mẫu đã nhiễm nấm do bào tử nấm phát tán rất mạnh
Trong nuôi cấy mô, hiện tượng hóa nâu hoặc đen của mẫu thường xảy ra, gây cản trở sự sinh trưởng và phát triển của cây Nguyên nhân chính là do mẫu nuôi cấy chứa nhiều tanin hoặc hydroxyphenol, thường xuất hiện nhiều ở mô già Để khắc phục hiện tượng này, cần áp dụng các biện pháp thích hợp.
Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy với tỷ lệ 0,1-0,3% rất hiệu quả cho các loài phong lan như Phalenopsis, Cattleya và Aerides Tuy nhiên, việc sử dụng than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanh cây do khả năng hấp phụ các chất điều tiết sinh trưởng và dinh dưỡng cần thiết Ngoài ra, việc bổ sung polyvinyl pyrolidone (PVP) cũng mang lại hiệu quả tốt trong việc khử nâu hóa cho một số mẫu cây ăn quả.
+ Sử dụng mô non, gây vết thương nhỏ nhất khi khử trùng
+ Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và xytric vài giờ trước khi cấy
+ Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, O2 thấp, không có ánh sáng (1-2 tuần) + Cấy chuyển mẫu liên tục sang môi trường tươi trong 1- 2 tuần
1.8.4 Hi ệ n t ượ ng th ủ y tinh hóa
Trong quá trình nhân nhanh in vitro, hiện tượng "thủy tinh hóa" thường xuất hiện, khiến cây có thân và lá mọng nước, trong suốt và khó sống khi ra môi trường do mất nước mạnh Hiện tượng này xảy ra khi nuôi cấy trong môi trường lỏng hoặc ít agar, kèm theo sự trao đổi khí thấp Để khắc phục tình trạng thủy tinh hóa, có thể áp dụng một số giải pháp cụ thể.
+ Tăng nồng độ đường hoặc các chất gây áp suất thẩm thấu cao để làm giảm sự hút nước của cây
+ Giảm các chất chứa nito trong môi trường
+ Giảm sự sản sinh ethylen trong bình nuôi cấy
+ Sử lý axit absixic hoặc một số chất ức chế sinh trưởng
+ Tăng cường độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng nuôi.
Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro
Tất cả các loại tế bào trong cơ thể thực vật, bao gồm tế bào từ mô rễ, thân, lá và hoa, đều có khả năng nuôi cấy thành công nhờ tính toàn năng Tuy nhiên, trên cùng một cây, các mô non như chồi đỉnh, chồi nách và chồi bất định thường tái sinh tốt hơn so với các mô già Những mẫu có tỷ lệ cao mô phân sinh và tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn thể sẽ phù hợp hơn cho việc nuôi cấy in vitro.
1.9.2 Môi tr ườ ng nuôi c ấ y
1.9.2.1 Môi trường vật lý Ánh sáng
Mẫu cấy trên môi trường có sẵn nguồn năng lượng từ đường, và mức độ sử dụng phụ thuộc vào khả năng quang hợp của cây.
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng thời gian chiếu sáng từ 12-18 giờ/ngày là lý tưởng cho sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Cường độ ánh sáng, thường từ 1000-7000 lux, đóng vai trò quan trọng trong quá trình này; ánh sáng cao kích thích sự phát triển của mô sẹo, trong khi ánh sáng thấp dẫn đến sự tạo chồi Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái, với ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân chồi hơn so với ánh sáng trắng Ánh sáng xanh có tác dụng ức chế sự vươn cao của mô nhưng lại hỗ trợ sự sinh trưởng của mô sẹo Do đó, trong phòng thí nghiệm, ánh sáng từ đèn huỳnh quang với cường độ 2000 – 3000 lux thường được sử dụng.
Nhiệt độ phòng nuôi cấy mô - tế bào là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và sự phát triển của cây in vitro Nhiệt độ tối ưu cho nhiều loại cây thường nằm trong khoảng 23-28°C Đặc biệt, một số loài cây cần nhiệt độ tối ưu để đạt được hình dáng mong muốn.
Trong bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn bằng 100% nên trong quá trình nuôi cấy ta không cần quan tâm nhiều đến độ ẩm
Môi trường in vitro, bao gồm cả không gian bên trên và dưới mặt thạch trong bình nuôi cấy, đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển hình thái của cây Để đạt hiệu quả cao trong nhân giống in vitro, cần thiết phải thực hiện các biện pháp cân bằng CO2 và tạo ra môi trường thuận lợi cho cây hấp thu và vận chuyển dinh dưỡng.
Môi trường hóa học đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp các chất dinh dưỡng thiết yếu cho sự tăng trưởng và phân hóa mô trong quá trình nuôi cấy in vitro Trong số nhiều công thức môi trường nuôi cấy đã được phát hiện, công thức của Murashige và Skoog (1962, MS) được coi là phù hợp nhất cho hầu hết các loại môi trường nuôi cấy in vitro Hầu hết các môi trường nuôi cấy thực vật đều bao gồm một nguồn cacbon quan trọng.
Cây in vitro chủ yếu phát triển theo phương thức dị dưỡng, hoàn toàn sử dụng các chất dinh dưỡng từ môi trường, vì vậy cần cung cấp một lượng hợp chất cacbon nhất định để cung cấp năng lượng cho tế bào và mô (Debengh, 1991) Các loại đường, như glucoze và saccarose, được sử dụng làm nguồn cacbon, giúp mô tế bào tổng hợp các chất hữu cơ, tăng sinh khối và đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường.
Các nguyên tố đa lượng bao gồm các khoáng chất như N, P, K, S, Mg, và Ca, thường được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm Những nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp nguyên liệu cho tế bào thực vật xây dựng cấu trúc và hỗ trợ quá trình trao đổi chất giữa các tế bào và môi trường Cụ thể, nguyên tố N có thể được sử dụng dưới dạng NO₃⁻ và NH₄⁺, riêng rẽ hoặc kết hợp, trong khi S thường được sử dụng dưới dạng muối SO₄²⁻ với nồng độ thấp, còn dạng SO₃²⁻ cũng có ứng dụng trong một số trường hợp.
2- kém tác dụng thậm chí còn gây độc cho môi trường nuôi cấy), P (Là nguyên tố mà mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu rất cao và thường được đưa vào môi trường ở dạng đường Photpho.), K, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi theo từng đối tượng
Nồng độ thấp của Na+ và Cl- cần được duy trì và được bổ sung vào môi trường cùng với muối khoáng để điều chỉnh pH Các nguyên tố vi lượng cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.
Các nguyên tố vi lượng như Fe, Cu, Zn, Bo, Co và Iot được sử dụng với nồng độ dưới 30 ppm (dưới 30 mg/l) và đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của enzyme Những nguyên tố này cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển bình thường của cây, nhưng được áp dụng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng.
Trong quá trình nuôi cấy in vitro, chồi tái sinh vẫn có khả năng tổng hợp vitamin, nhưng lượng vitamin này không đủ đáp ứng nhu cầu phát triển, vì vậy cần bổ sung vitamin, đặc biệt là vitamin B vào môi trường nuôi cấy Hàm lượng vitamin bổ sung sẽ thay đổi tùy thuộc vào loại mô và giai đoạn nuôi cấy Hai loại vitamin B1 và B6 thường được sử dụng phổ biến với nồng độ từ 0,1 đến 1 mg/l trong môi trường nuôi cấy.
Một số loài cây cần bổ sung dung dịch hữu cơ vào môi trường nuôi cấy để kích thích sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan Các dung dịch hữu cơ hiệu quả bao gồm nước dừa, khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men và dịch thủy phân Casein.
Kể từ năm 1941, nước dừa đã được ứng dụng trong nuôi cấy mô, đặc biệt trong các môi trường nhân nhanh in vitro Nước dừa chứa nhiều thành phần quan trọng như axit amine, axit hữu cơ, ARN, ADN, cùng với các hợp chất thiết yếu cho nuôi cấy mô như Myoinositol, các hoạt chất Auxin và gluxit của Xytokinin.
Agar (thạch) là một polysaccharid chiết xuất từ tảo, có khả năng ngậm nước cao từ 6 đến 12g/lít Việc lựa chọn môi trường nuôi trồng, có thể là rắn hoặc lỏng, rất quan trọng cho sự phát triển của cây Môi trường chứa agar giúp đỡ cây và tạo độ thông thoáng, nhưng có thể hạn chế sự tiếp xúc của cây mầm với dinh dưỡng cần thiết.
1.9.3 Các ch ấ t đ i ề u hòa sinh tr ưở ng
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu tập trung vào việc khử trùng vật liệu bằng các nồng độ khác nhau của HgCl2 và cồn trong các khoảng thời gian khác nhau Mục tiêu là xác định nồng độ, thời gian khử trùng và loại chất khử trùng phù hợp nhất để đạt hiệu quả tối ưu.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh của mẫu cấy
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo protocom
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh (giai đoạn tạo rễ)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trưởng chiều cao của cây con ở giai đoạn vườn ươm
QUY TRÌNH KHẢO NGHIỆM TỔNG QUÁT
Chồi, hạt lan Trần mộng xuân (Cymbidium nowianum)
Tạo chồi ban đầu Đưa vào môi trường tái sinh Đưa vào môi trường nuôi cấy
Chồi Đưa vào môi trường nuôi cấy
Cây hoàn chỉnh Đưa vào môi trường ra rễ
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Ph ươ ng pháp lu ậ n
- Các nhân tố chỉ tiêu phải chia thành những phương pháp khác nhau
- Các nhân tố không phải nghiên cứu phải đảm bảo đồng nhất giữa các công thức thí nghiệm
- Số mẫu của các công thức thí nghiệm phải đủ lớn
- Thí nghiệm phải lặp lại ≥ 3
2.2.2 Ph ươ ng pháp b ố trí thí nghi ệ m c ụ th ể
- Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố và hai yếu tố: + Số lần lặp lại: 3
+ Số chai cho mỗi lần lặp lại: 3
- Đánh giá kết quả sau 4 - 6 tuần nuôi cấy
2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp khử trùng vật liệu đến khả năng tái sinh của mẫu cấy
- Tìm phương pháp khử trùng thích hợp
- Xác định nồng độ, thời gian khử trùng phù hợp nhất đối với quả lan
- Theo dõi biểu hiện của hạt
Phương pháp và hóa chất sử dụng:
- Phương pháp hóa chất: Dùng HgCl2.
- Quả lan được thu hái từ những cây bố mẹ khỏe mạnh, sạch bệnh và sinh trưởng tốt ở Sapa
- Mẫu được khử trùng thô ở ngoài bằng dung dịch xà phòng loãng rồi rửa sạch dưới vòi nước chảy và rửa lại bằng nước cất vô trùng
- Đưa mẫu vào trong box cấy rửa bằng cồn 70 0 trong 1 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 2- 3 lần
+ Đối với phương pháp đốt cồn: Nhúng quả vào cồn 90 0 và hơ nhanh qua ngọn lửa Nhanh chóng đặt quả lan vào đĩa petri, đậy lắp lại
+ Đối với phương pháp dùng hóa chất: Ngâm mẫu trong HgCl2 và thường xuyên lắc mẫu Rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng 3-4 lần cho sạch
- Sau đó quả lan sẽ được cắt gọt hai đầu và dùng dao mổ xẻ dọc quả lan, tách làm hai
- Dùng dao giữ lấy phần vỏ quả, dùng panh lấy hết hạt lan ra đĩa petri
- Gieo hạt vào môi trường
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần một quả
Chỉ tiêu theo dõi: + Tỷ lệ mẫu sống, mẫu chết, mẫu nhiễm
Bảng 2.1: Công thức khử trùng cho từng loại mẫu
Nồng độ (%) Số lần đốt
2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh của mẫu cấy
Mục đích: Tìm môi trường khoáng thích hợp để cấy mẫu
- Môi trường MS cải tiến (MS*), không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng
- Môi trường MS cải tiến có bổ sung 1,5mg BA
- Môi trường Vacxin and Went (VW), không bổ sung chất ĐHST
- Môi trường Vacxin and Went (VW), bổ sung 1,5mg BA
- Lấy các quả lan đã được khử trùng ở thí nghiệm 1 đem gieo vào 4 loại môi trường thử nghiệm có bổ sung (25g đường + 50g khoai tây + 150ml nước dừa + 5,8g aga/ lít)
- Theo dõi và ghi nhận kết quả sau 2- 6 tuần nuôi cấy
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần mỗi lần 10 bình
Chỉ tiêu theo dõi: + Tỷ lệ mẫu tái sinh
+ Môi trường thích hợp nhất cho mẫu tái sinh
Bảng 2.2 Ảnh hưởng của môi trường hóa học và nồng độ chất ĐHST đến khả năng tái sinh của hạt lan
BA (mg/lít) Tỷ lệ mẫu tái sinh (%)
2.2.2.3 Thí nghiệm 3:Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và nồng độ chất ĐHST Ki và BA đến khả năng tạo protocom
+ So sánh sự thành lập protocom trên 2 môi trường khác nhau và bổ sung cùng nồng độ chất ĐHST
+ Tìm môi trường thích hợp cho các thí nghiệm về sau
- Môi trường MS cải tiến (MS*), không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng
- Môi trường MS cải tiến có bổ sung 1mg BA, 1mg Ki
- Môi trường MS cải tiến có bổ sung 1,5mg BA, 1,5mg Ki
- Môi trường VW, không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng
- Môi trường VW, bổ sung 1mg BA, 1mg Ki
- Môi trường VW, bổ sung 1,5mg BA, 1,5mg Ki
Chuyển những mẫu hạt đã phình to, có màu xanh và không bị nhiễm thu được ở thí nghiệm 3 vào 6 loại môi trường thử nghiệm, kèm theo bổ sung 25g đường, 150ml nước dừa và 5.8g agar/lít Đồng thời, bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) như được trình bày trong bảng 2.3 Bảng 2.3 thể hiện ảnh hưởng của môi trường và nồng độ chất ĐHST Ki, BA đến khả năng tạo protocom.
Môi trường Ki (mg/ lít) BA (mg/ lít)
Chỉ tiêu theo dõi: + Thời gian tạo prorocom
+ Môi trường tạo protocom tốt nhất
+ Nồng độ chất ĐHST thích hợp để tạo protocom
+ Tình trạng phát triển của protocom
2.2.2.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi
- Tìm nồng độ chất ĐHST thích hợp nhất cho nhân nhanh thể chồi
Môi trường cơ bản là môi trường đã tìm được ở thí nghiệm 3 bổ sung thêm các chất điều hòa sinh trưởng có nồng độ khác nhau như bảng 2.4
Bảng 2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh thể chồi
Ki (mg/ lít) BA (mg/ lít)
Chỉ tiêu theo dõi: + Màu sắc, chiều dài lá
+ Thời gian xuất hiện rễ đầu tiên + Hệ số nhân chồi
2.2.2.5 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST NAA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/ cây, chiều dài rễ
- Khảo sát môi trường thích hợp cho sự ra rễ
Đưa những cây con cao 3-5 cm với 3-4 lá từ thí nghiệm 4 vào môi trường MS cải tiến (MS*), trong đó có bổ sung 25g đường, 1g than hoạt tính và 5,8g agar/lít, cùng với các chất điều hòa sinh trưởng theo bảng 2.5.
Bảng 2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST NAA đến sự ra rễ
CTTN Môi trường NAA (mg/lít)
Chỉ tiêu theo dõi: + Chiều dài rễ
+ Số rễ trung bình/ cây
+ Sự tăng trưởng chiều cao cây
2.2.2.6 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vườn ươm
Trước khi trồng cây con trong ống nghiệm ra vườn ươm, cần thực hiện giai đoạn huấn luyện để cây làm quen với môi trường bên ngoài Giai đoạn này chuyển cây từ trạng thái sống dị dưỡng sang tự dưỡng, yêu cầu đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh phù hợp cho sự phát triển tối ưu Cần đặt bình cây ở nhiệt độ và ánh sáng tự nhiên với cường độ từ 5.000 – 10.000 lux, tránh ánh nắng trực tiếp.
Sau khi huấn luyện, cây được lấy ra khỏi bình, quấn dớn và trồng vào khay nhựa Tiếp theo, cần chăm sóc cây theo các bước kỹ thuật đã thực hiện tại Vườn lan thuộc Phòng khoa học, Vườn quốc gia Hoàng Liên Sau khoảng 4 tuần trồng ra bầu, tiến hành đo đếm tỷ lệ sống và chiều cao cây để đánh giá ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của cây con trong giai đoạn vườn ươm.
2.2.3 Ph ươ ng pháp thu th ậ p và x ử lý s ố li ệ u
2.2.3.1 Phương pháp thu thập số liệu
Các chỉ tiêu thu thập:
Tổng số mẫu ban đầu
Tổng số mẫu ban đầu
(đối với mẫu quả) Số bình mẫu vào
Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = x 100 %
Tổng số mẫu thí nghiệm
Tổng số bình thể chồi
Hệ số nhân nhanh thể chồi Số bình thể chồi cấy ban đầu
Số chồi phát sinh từ thể chồi
Tỷ lệ phát sinh chồi = x100%
Số thể chồi ban đầu
Hệ số nhân nhanh chồi = (lần)
Số chồi cấy ban đầu Tổng số chồi ra rễ
Tổng số chồi nuôi cấy
Chiều dài rễ trung bình = x 100%
Tổng số rễ đo đếm
Tổng số cây ban đầu
Dữ liệu được thu thập và ghi chép trong bảng biểu, sau đó được xử lý bằng phần mềm thống kê Excel, theo nghiên cứu của Nguyễn Hải Tuất và Ngô Kim Khôi (1996).
2.2.3.2 Phương pháp xử lý số liệu
- Vẽ biểu đồ và tính toán các giá trị trung bình được thực hiện trên phần mềm Excel
Để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm, phương pháp phân tích phương sai một nhân tố được thực hiện qua phần mềm SPSS 11.5 Tiêu chuẩn Duncan được áp dụng nhằm phân nhóm và xác định công thức thí nghiệm tối ưu nhất.
Giả thiết H 0 : Nhân tố A có tác động một cách đồng đều (ngẫu nhiên) đến kết quả thớ nghiệm khi đú: α1=α2 = =αa = 0 hoặc à1=à2= =àa=à
Giả thiết H1: Tác động của nhân tố A là không đồng đều ở tất cả các cấp khi đó có ít nhất là có một α i # 0
Nếu giá trị Sig của F0,05 thì chấp nhận H1.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp khử trùng vật liệu đến khả năng tái sinh của mẫu cấy
Hiện nay, nhiều loại hóa chất được sử dụng để khử trùng mẫu lan trong nhân giống invitro, trong đó HgCl2 là phổ biến nhất Mặc dù khử trùng bằng HgCl2 thường mang lại tỷ lệ mẫu sống cao, nhưng đây là chất độc hại, do đó cần thận trọng khi sử dụng Ngoài HgCl2, một số hóa chất ít độc hại hơn như Ca(OCl)2 và cồn cũng được áp dụng Trong nghiên cứu này, hai loại hóa chất được sử dụng là HgCl2 và cồn Sau khi khử trùng, quả lan được gieo hạt vào môi trường nuôi cấy và kết quả theo dõi sau 6 tuần được trình bày trong bảng.
Bảng 3.1a: Tổng hợp kết quả khử trùng mẫu quả lan bằng HgCl 2
Bảng 3.1b: Tổng hợp kết quả khử trùng mẫu quả lan bằng cồn
CT2' 2 66,67 30,00 3,33 Ở cả hai phương pháp ta đều thấy mẫu hạt lan được gieo vào môi trường, sau 6 tuần theo dõi mẫu có những biểu hiện khác nhau:
+ Với những mẫu sống và không nhiễm sau 1 tuần hạt bắt đầu thích nghi với môi trường và có biểu hiện chuyển sang màu nâu vàng mật ong
+ Những mẫu hạt bị ảnh hưởng bởi HgCl 2 và nhiệt độ cao thì hạt chuyển sang màu trắng và nâu đục, không phát triển
Qua kết quả ở bảng 3.1a cho thấy:
Nồng độ HgCl2 0,1% trong quá trình khử trùng cho thấy hiệu quả rõ rệt Sau 5 phút, tỷ lệ mẫu sống và không nhiễm đạt 83,33%, tuy nhiên tỷ lệ nhiễm vẫn cao ở mức 16,67% Khi tăng thời gian khử trùng lên 10 phút, tỷ lệ mẫu sống và không nhiễm tăng lên 96,67%, với chỉ 3,33% mẫu bị chết nhưng không bị nhiễm.
Khi nồng độ khử trùng tăng, tỷ lệ mẫu chết tăng và tỷ lệ mẫu nhiễm giảm Ở nồng độ 0,3% với thời gian khử trùng 5 phút, tỷ lệ mẫu sống đạt 86,67%, tỷ lệ mẫu chết chỉ 10%, trong khi tỷ lệ mẫu nhiễm rất thấp ở mức 3,33% Tuy nhiên, khi thời gian khử trùng kéo dài lên 10 phút, mẫu không còn nhiễm nhưng tỷ lệ mẫu chết lại tăng lên 26,67%.
Quá trình ngâm quả lan trong dung dịch HgCl2 cho phép phần vỏ bên ngoài tiếp xúc trực tiếp với chất khử trùng, trong khi phần hạt bên trong vẫn được bảo vệ, giúp hạt phục hồi nhanh và nảy mầm hiệu quả Tuy nhiên, nếu nồng độ dung dịch tăng cao và thời gian khử trùng kéo dài, chất khử trùng có thể thẩm thấu vào bên trong vỏ quả, ảnh hưởng tiêu cực đến hạt, làm cho hạt phục hồi chậm và có nguy cơ bị hóa trắng (chết).
Nồng độ HgCl2 0,1% trong thời gian 10 phút là lựa chọn tối ưu, mang lại tỷ lệ mẫu sống cao nhất trong các thí nghiệm.
Qua kết quả ở bảng 3.1b cho thấy:
Khử trùng quả lan bằng phương pháp đốt cồn chỉ làm mẫu hạt gieo bị nhiễm 10%, nhưng nếu đốt hai lần, tỷ lệ mẫu chết tăng lên 30%, cao hơn so với phương pháp khử trùng bằng HgCl2 0,3% trong 10 phút Đốt cồn một lần cho tỷ lệ mẫu sống là 90%, thấp hơn một chút so với khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 5 phút.
Khi nhúng quả lan vào cồn 96 độ và đốt, nhiệt độ cao sẽ loại bỏ các tác nhân gây nhiễm bên ngoài vỏ quả, nhưng việc tăng số lần đốt lên 2 lần có thể làm hạt bên trong bị ảnh hưởng, dẫn đến việc hạt phục hồi chậm, có thể hóa nâu và không nảy mầm Để đánh giá ảnh hưởng của các biện pháp khử trùng đến khả năng sống, chết và nhiễm của mẫu cấy, chúng tôi đã sử dụng tiêu chuẩn Kruskal – Wallis trong SPSS Kết quả phân tích cho thấy rằng các biện pháp khử trùng có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sống của cây mẫu, với CT2 có ảnh hưởng lớn nhất đến tỷ lệ sống Đối với tỷ lệ chết, CT2’ cũng cho thấy ảnh hưởng rõ rệt nhất, trong khi CT1 có tác động đến tỷ lệ nhiễm của mẫu cấy.
Kết quả khử trùng mẫu cho thấy, khi sử dụng HgCl2 0,1% trong 10 phút và đốt cồn 1 lần, cả hai phương pháp đều đạt tỷ lệ sống cao và không nhiễm Tuy nhiên, HgCl2 0,1% cho hiệu quả khử trùng mạnh mẽ hơn, với tỷ lệ sống cao hơn và tỷ lệ chết thấp hơn so với đốt cồn Do đó, phương pháp khử trùng được chọn là HgCl2 0,1% trong thời gian 10 phút.
Hình 3.1a: Mẫu quả lan khử trùng
Hình 3.1b: Mẫu quả lan đã khử trùng
Hình 3.1c: Hạt lan được gieo vào MT Hình 3.1d: Hạt gieo sống và không nhiễm
3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường và nồng độ chất điều hoà sinh trưởng BA đến khả năng tái sinh của mẫu cấy
Việc xác định môi trường và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA là yếu tố quyết định cho khả năng tái sinh của mẫu cấy trong nhân giống lan bằng phương pháp nuôi cấy mô Tỷ lệ mẫu tái sinh phụ thuộc vào thành phần môi trường và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng, do đó nghiên cứu này nhằm tìm ra môi trường tối ưu cho quá trình tái sinh Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng dưới đây.
Bảng 3.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của 2 loại môi trường và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA đến khả năng tái sinh của mẫu cấy
Tỷ lệ mẫu hóa nâu sau 2tuần(%)
Tỷ lệ mẫu nảy mầm sau 4 tuần(%)
Tỷ lệ mẫu hóa xanh sau 6 tuần(%)
Sau 2 tuần gieo hạt vào các môi trường khác nhau, tất cả các hạt lan đều chuyển màu nâu vàng Đến tuần thứ 4, xuất hiện hiện tượng nảy mầm với sự khác biệt rõ rệt giữa các loại môi trường Sau 6 tuần, những hạt có màu vàng bắt đầu chuyển sang xanh nhờ tiếp xúc với ánh sáng, tạo ra chất diệp lục.
Từ kết quả bảng 3.2 đề tài nhận thấy rằng:
Hạt gieo trong môi trường MS* có tỷ lệ nảy mầm cao, đạt từ 80% đến 96,67%, với hầu hết các mẫu hạt đều phình lên và chuyển sang màu vàng Ngược lại, tỷ lệ nảy mầm của hạt gieo trong môi trường VW chỉ đạt từ 46,67% đến 56,67% Trong giai đoạn này, không có sự khác biệt đáng kể giữa môi trường có và không có kích thích tố.
Sau 6 tuần thấy trong môi trường MS* có bổ sung 1,5mg/l BA, tất cả mẫu hạt đều hóa xanh, nếu cũng trong môi trường MS* nhưng không bổ sung
Tỷ lệ mẫu hóa xanh trong môi trường BA đạt 87,5%, trong khi tỷ lệ này thấp hơn trong môi trường VW Sự khác biệt giữa môi trường VW có và không có kích thích tố BA được thể hiện rõ ràng Cụ thể, môi trường VW có bổ sung 1,5 mg/l BA cho tỷ lệ nảy mần cao hơn, đạt 76,47% so với môi trường VW không có BA.
Trong giai đoạn này, chất kích thích sinh trưởng thể hiện vai trò quan trọng, giúp hạt gieo trong môi trường bổ sung trở nên xanh đậm và phình to hơn.
Trong nghiên cứu về sự nảy mầm của hạt lan, môi trường MS với nồng độ khoáng cao hơn đã cho thấy sự phát triển nhanh hơn so với môi trường VW, mặc dù cả hai đều có cùng nồng độ chất kích thích sinh trưởng.
Khi áp dụng tiêu chuẩn Kruskal – Wallis để so sánh nhiều mẫu độc lập, kết quả cho thấy: Đối với mẫu hóa nâu, xác suất X² = 1,00 > 0,05 cho phép chấp nhận giả thiết H₀, tức là môi trường và nồng độ BA không ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng xuất hiện mẫu hoa nâu Ngược lại, với mẫu nảy mầm, xác suất X² = 0,021 < 0,05 dẫn đến việc bác bỏ H₀, cho thấy môi trường và nồng độ BA có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tái sinh của mẫu nảy mầm Cụ thể, công thức thí nghiệm 6 có số hạng trung bình cao nhất (10,83), chỉ ra rằng môi trường MS*, BA = 1,5 mg/l có tác động lớn nhất, đạt tỷ lệ tái sinh 96,67% Đối với mẫu hóa xanh, xác suất X² < 0,05 cũng bác bỏ H₀, chứng minh rằng môi trường và nồng độ BA ảnh hưởng đến tỷ lệ mẫu hóa xanh, với công thức CT6 đạt số hạng trung bình cao nhất và 100% mẫu cấy đã hóa xanh.