Nghiên cứu nhân giống địa lan trần mộng xuân (cymbidium lowianum) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM VŨ THỊ HẢI NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG ĐỊA LAN TRẦN MỘNG XUÂN (CYMBIDIUM LOWIANUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP THÁI NGUYÊN - 2013 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM VŨ THỊ HẢI NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG ĐỊA LAN TRẦN MỘNG XUÂN (CYMBIDIUM LOWIANUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO CHUYÊN NGÀNH: LÂM HỌC MÃ SỐ: 60.62.02.01 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS: DƯƠNG MỘNG HÙNG THÁI NGUYÊN - 2013 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, số liệu kết nghiên cứu Luận văn hồn tồn trung thực, có thực tiễn; chưa bảo vệ hội đồng khoa học hay học vị Tôi xin cam đoan, giúp đỡ cho việc thực Luận văn dều cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Vũ Thị Hải ii LỜI CẢM ƠN Với mong muốn góp phần cơng sức cho phát triển giống lan Trần mộng xuân, thực đề tài “Nghiên cứu nhân giống Địa lan Trần Mộng Xuân (Cymbidium lowianum) phương pháp nuôi cấy invitro” Trong thời gian làm đề tài viết luận văn này, ngồi cố gắng lỗ lực thân, tơi nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ Nhân dịp xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Trước tiên, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo hướng dẫn khoa học PGS TS Dương Mộng Hùng trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt trình nghiên cứu hồn thiện đề tài Tơi xin cảm ơn thầy, cô giáo Ban giám hiệu Trường Đại học Nông – Lâm Thái Nguyên, Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi, cung cấp tài liệu cần thiết cho tơi hồn thành nội dung chương trình mà luận văn đặt Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc cán công nhân viên Vườn Quốc gia Hoàng Liên tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu, thu thập số liệu thừa kế số liệu sẵn có để hồn thành tốt luận văn Cuối xin cảm ơn đồng nghiệp Bộ phận nuôi cấy mô tế bào thực vật, bạn bè người thân gia đình động viên, giúp đỡ suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin trân thành cảm ơn! Thái Nguyên, năm 2013 Tác giả luận văn Vũ Thị Hải iii MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái niệm nhân giống in vitro 1.2 Giới thiệu họ lan 1.3 Đặc điểm thực vật Địa lan Trần Mộng Xuân 1.4 Thành tựu đạt nuôi cấy mô hoa lan 1.4.1 Nghiên cứu giới 1.4.2 Nghiên cứu Việt Nam 10 1.5 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô in vitro 12 1.5.1 Dựa tính tồn tế bào 12 1.5.2 Sự phân hóa phản phân hóa tế bào 12 1.6 Quy trình nhân giống in vitro 13 1.6.1 Giai đoạn 1: Chọn lọc chuẩn bị mẹ 13 1.6.2 Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động 14 1.6.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh 14 1.6.4 Giai đoạn 4: Tạo in vitro hoàn chỉnh 14 1.6.5 Giai đoạn 5: Thích ứng in vitro điều kiện tự nhiên 15 1.7 Các phương thức nhân giống vơ tính in vitro 15 1.7.1 Hoạt hóa chồi nách 15 1.7.2 Tạo chồi bất định 15 1.7.3 Tạo phôi vô tính 16 1.8 Một số trường hợp thường gặp q trình ni cấy in vitro 16 1.8.1 Tính bất định mặt di truyền 16 1.8.2 Sự nhiễm mẫu 16 1.8.3 Sự hóa nâu 17 1.8.4 Hiện tượng thủy tinh hóa 17 1.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 18 iv 1.9.1 mẫu cấy 18 1.9.2 Môi trường nuôi cấy 18 1.9.2.1 Môi trường vật lý 18 1.9.2.2 Môi trường hóa học 19 1.9.3 Các chất điều hòa sinh trưởng 21 1.9.3.1 Auxin 21 1.9.3.2 Gebberelin 22 1.9.3.3 Các Xytokinin 22 1.9.3.4 Ethylene 22 1.9.3.5 Các chất ức chế tăng trưởng 23 1.9.3.6 Kết luận 23 1.9.4 Điều kiện vô trùng 23 1.9.5 Phịng ni 24 CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Nội dung nghiên cứu 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phương pháp luận 27 2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm cụ thể 27 2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng biện pháp khử trùng vật liệu đến khả tái sinh mẫu cấy 27 2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng mơi trường nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh mẫu cấy 28 2.2.2.3 Thí nghiệm 3:Nghiên cứu ảnh hưởng mơi trường nuôi cấy nồng độ chất ĐHST Ki BA đến khả tạo protocom 29 2.2.2.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi 30 2.2.2.5 Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng chất ĐHST NAA đến tỷ lệ rễ, số rễ trung bình/ cây, chiều dài rễ 31 v 2.2.2.6 Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chiều cao vườn ươm 32 2.2.3 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 33 2.2.3.1 Phương pháp thu thập số liệu 33 2.2.3.2 Phương pháp xử lý số liệu 34 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng biện pháp khử trùng vật liệu đến khả tái sinh mẫu cấy 36 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng mơi trường nồng độ chất điều hồ sinh trưởng BA đến khả tái sinh mẫu cấy 40 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy nồng độ chất ĐHST Ki BA đến khả nhân protocom 43 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi 46 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng chất ĐHST NAA đến tỷ lệ rễ, số rễ trung bình/ cây, chiều dài rễ 49 3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chiều cao vườn ươm 53 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Tồn 59 4.3 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 63 Phụ lục 1: Môi trường Murashige- Skoog (MS, 1962) 63 Phụ lục 2: Môi trường MS cải tiến (MS*) 64 Phụ lục 3: Môi trường Vacin &Went (VW) 65 Phụ lục 4: Phân tích kết khử trùng mẫu cấy 66 vi Phụ lục 5: Phân tích kết ảnh hưởng mơi trường nuôi cấy nồng độ BA đến khả tái sinh mẫu cấy 70 Phụ lục 6: Phân tích kết ảnh hưởng mơi trường nồng độ chất điều hịa sinh trưởng BA, Ki đến khả nhân Protocom 73 Phụ lục 7: Phân tích kết ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng BA, KI đến khả nhân nhanh chồi 74 Phụ lục 8: Phân tích ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng NAA đến tỷ lệ rễ, số rễ trung bình/ chiều dài rễ 75 Phụ lục 9: Phân tích kết ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chiều cao vườn ươm 77 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Công thức khử trùng cho loại mẫu 28 Bảng 2.2 Ảnh hưởng mơi trường hóa học nồng độ chất ĐHST đến khả tái sinh hạt lan .29 Bảng 2.3 Ảnh hưởng môi trường nồng độ chất ĐHST Ki, BA đến khả tạo protocom 30 Bảng 2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất ĐHST đến khả nhân nhanh thể chồi .31 Bảng 2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng chất ĐHST NAA đến rễ .32 Bảng 3.1a: Tổng hợp kết khử trùng mẫu lan HgCl2 .36 Bảng 3.1b: Tổng hợp kết khử trùng mẫu lan cồn 37 Bảng 3.2: Kết nghiên cứu ảnh hưởng loại mơi trường nồng độ chất điều hịa sinh trưởng BA đến khả tái sinh mẫu cấy 40 Bảng 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy nồng độ chất ĐHST Ki BA đến khả nhân protocom 43 Bảng 3.4: Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi 47 Bảng 3.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chất ĐHST NAA đến tỷ lệ rễ, số rễ trung bình/ cây, chiều dài rễ 50 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chiều cao vườn ươm .54 viii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ TT Tên biểu đồ Biểu đồ 3.1a: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy nồng độ chất ĐHST Ki BA đến tỷ lệ mẫu tái sinh 45 Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng phối hợp chất ĐHST BA Ki đến HSNC 45 Biểu đồ 3.1c: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy nồng độ chất ĐHST Ki BA đến chiều cao trung bình thể chồi 44 Biểu đồ 3.1b: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy nồng độ chất ĐHST Ki BA đến hệ số nhân thể chồi Trang 47 Biểu đồ 3.3a: Ảnh hưởng chất ĐHST NAA đến tỷ lệ rễ 50 Biểu đồ 3.3b: Ảnh hưởng chất ĐHST NAA đến số rễ trung bình/ 51 Biểu đồ 3.3c: Ảnh hưởng chất ĐHST NAA đến chiều dài trung bình rễ 51 62 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trường Murashige- Skoog (MS, 1962) STT Đa lượng Vi lượng Sắt Vitamin Dung dịch mẹ Nồng độ (mg/l) KNO3 1900 KH2PO4 170 NH4NO3 1650 MgSO4 370 CaCl2 440 H3BO3 6,2 MnSO4.4H2O 22,3 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.7H2O 0,025 ZnSO4.7H2O 8,6 Na2MoO4.2H2O 0,25 KI 0,83 FeSO4 27,8 Na2EDTA 37,3 Myo-Inositol 100 Thiamine.HCl 0,1 Pyridoxine.HCl 0,5 Acid nicotic 0,5 Glycine 63 Phụ lục 2: Môi trường MS cải tiến (MS*) STT Đa lượng Dung dịch mẹ Sắt 225 KH2PO4 33,8 NH4NO3 45 MgSO4 7H2O 45 17.8 H3BO3 62 MnSO4.4H2O 25 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.7H2O 0,025 ZnSO4.7H2O 10 Na2MoO4.2H2O 0,25 KI 0,25 FeSO4 2,78 Na2EDTA 3,73 Thiamine.HCl Vitamin (g/lit) KNO3 Ca(NO3)2.4H2O Vi lượng Nồng độ Pyridoxine (B6) 0,5 Acid nicotic (B5) Glycine 64 Phụ lục 3: Môi trường Vacin &Went (VW) STT Dung dịch mẹ KH2PO4 (g/lit) 10 Ca3(PO4)2 12,5 MnSO4.7H2O 5,7 MgSO4 7H2O 25 NH4NO3 50 KNO3 52,5 FeSO4 2,78 Na2EDTA 3,73 Thiamine.HCl Nồng độ Pyridoxine (B6) 0,5 Acid nicotic (B5) Glycine 65 Phụ lục 4: Phân tích kết khử trùng mẫu cấy Chỉ TT CTTN tiêu thống kê Số bình TN TB ĐC S Bình Tỷ lệ Bình Tỷ lệ sống (%) chết (%) 0,00 0,00 10 CT2 CT3 CT4 CT1' S 8,33 83,33 10 0,00 1,67 V% 6,93 34,64 TB 9,67 96,67 10 0,00 0,33 0,58 0,58 V% 5,97 173,21 TB 8,67 86,67 1,00 10,00 0,33 0,58 1,00 0,58 V% 6,66 100,00 173,21 TB 7,33 73,33 2,67 26,67 0,58 0,58 V% 7,87 21,65 TB 9,00 90,00 S S S 10 10 10 TB CT2' 0,58 S S V% (%) 10,00 100,00 0,58 V% bệnh Tỷ lệ 0,00 TB CT1 nhiễm 0,00 V% Bình 10 0,00 0,00 16,67 3,33 3,33 0,00 0,00 1,00 10,00 1,00 1,00 11,11 100,00 6,67 66,67 3,00 30,00 0,33 0,58 1,00 0,58 8,66 33,33 173,21 3,33 66 Kruskal-Wallis Test Ranks CongthucTN N Mean Rank Binhsong 2.00 12.67 3 18.67 14.33 8.00 15.67 5.67 Total 21 Test Statisticsa,b Binhsong ChiSquare Df Asymp Sig 17.238 008 a Kruskal Wallis Test b Grouping Variable: CongthucTN 67 Ranks Congthuc TN N Mean Rank Binhche 7.00 t 7.00 3 7.00 12.33 18.00 7.00 18.67 Total 21 Test Statisticsa,b Binhchet Chi-Square Df Asymp Sig a Kruskal Wallis Test b Grouping Variable: CongthucTN 17.831 007 68 Kruskal-Wallis Test Ranks Mean CongthucTN N Rank Binhnhiem 20.00 15.67 3 8.00 8.00 5.50 11.83 8.00 Total 21 Test Statisticsa,b Binhnhiem ChiSquare Df Asymp Sig a Kruskal Wallis Test b Grouping Variable: CongthucTN 14.318 026 69 Phụ lục 5: Phân tích kết ảnh hưởng mơi trường ni cấy nồng độ BA đến khả tái sinh mẫu cấy Công TT thức TN Chỉ tiêu thống kê Số Mẫu bình hóa TN nâu TB CT5 CT6 CT7 CT8 (%) nảy mầm Tỷ lệ (%) Mẫu hóa xanh 7,00 1,00 1,00 V% 12,50 14,29 TB 10 10 100 Mẫu 8,00 80,00 S 10 Tỷ lệ 9,67 96,67 9,67 0,58 0,58 V% 5,97 5,97 TB 10 4,67 46,67 2,67 1,15 0,58 V% 24,74 21,65 TB 10 S S S V% 10 10 10 100 100 100 5,67 56,67 4,33 0,58 0,58 10,19 13,32 Tỷ lệ (%) 70,00 96,67 26,67 43,33 70 Ranks CongthucTN N Mean Rank 6.50 6.50 3 6.50 6.50 Total 12 Mauhoanau Test Statisticsa,b Mauhoanau ChiSquare Df Asymp Sig .000 1.000 a Kruskal Wallis Test b Grouping Variable: CongthucTN 71 Ranks Mean CongthucTN N Maunaymam 8.17 10.83 3 2.67 4.33 Total 12 Test Statisticsa,b Maunaymam ChiSquare df 9.686 Asymp Sig Rank 021 a Kruskal Wallis Test b Grouping Variable: CongthucTN 72 Phụ lục 6: Phân tích kết ảnh hưởng mơi trường nồng độ chất điều hịa sinh trưởng BA, Ki đến khả nhân Protocom Chỉ Hệ số Số Mẫu tiêu Tỷ lệ Số thể TS CTTN mẫu tái thống (%) chồi thể TN sinh kê chồi TB 8,33 23,15 14,33 1,73 CT9 36 S 1,15 1,15 0,11 V% 13,86 8,06 6,36 TB 26,33 73,15 102,00 3,87 CT10 S 36 1,53 7,81 0,18 V% 5,80 7,66 4,75 TB 33,67 93,52 197,00 5,85 CT11 S 36 1,15 9,85 0,21 5,00 3,63 V% 3,43 TB 7,33 20,37 11,67 1,63 CT12 S 36 1,15 0,58 0,33 V% 15,75 4,95 20,35 TB 21,00 58,33 73,67 3,51 CT13 S 36 1,00 6,35 0,17 V% 4,76 8,62 4,97 TB 30,67 85,19 127,33 4,16 CT14 S 36 1,53 13,05 0,50 10,25 12,08 V% 4,98 Test Statisticsa,b Mautaisinh Chi-Square 16.302 Df Asymp Sig .006 a Kruskal Wallis Test b Grouping Variable: CongthucTN Chiều cao thể chồi (mm) 12,25 1,56 12,73 67,60 4,05 5,98 101,25 2,75 2,72 9,97 1,81 18,21 51,03 4,25 8,32 77,77 4,80 6,17 Chiều cao TB thể chồi (mm) 1,47 0,02 1,30 2,57 0,15 6,01 3,01 0,04 1,36 1,36 0,05 3,72 2,43 0,09 3,63 2,54 0,17 6,78 73 Phụ lục 7: Phân tích kết ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng BA, KI đến khả nhân nhanh chồi Cơng thức Số mẫu thí Chỉ tiêu Số chồi Hệ số TT thí nghiệm nghiệm thống kê thu nhân chồi TB 73,00 2,03 ĐC 36 S 4,00 0,11 5,48 V% 5,48 TB 86,00 2,39 CT15 36 S 3,61 0,10 V% 4,19 4,19 TB 103,67 2,88 CT16 36 S 7,02 0,20 V% 6,78 6,78 TB 137,67 3,82 CT17 36 S 7,02 0,20 V% 5,10 5,10 TB 108,33 3,01 CT18 36 S 7,02 0,20 V% 6,48 6,48 TB 88,33 2,45 CT19 36 S 3,06 0,08 3,46 V% 3,46 TB 82,33 2,29 CT20 36 S 4,51 0,13 V% 5,48 5,48 TB 79,67 2,21 CT21 36 S 7,09 0,20 V% 8,91 8,91 Test Statisticsa,b Sochoithuduoc Chi-Square 20.512 Df Asymp Sig .005 a Kruskal Wallis Test b Grouping Variable: CongthucTN 74 Phụ lục 8: Phân tích ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng NAA đến tỷ lệ rễ, số rễ trung bình/ chiều dài rễ Chỉ CTTN tiêu thống kê Chiều Số mẫu TN S 36 TB S 36 TB S 36 TB S 36 TB S 36 TB S 36 TB S V% trung bình/cây dài rễ bình 2,84 138,27 1,89 9,00 10,70 1,90 11,65 2,27 82,33 2,98 156,67 1,91 1,53 4,62 0,05 6,37 0,08 5,52 5,61 1,81 4,07 4,29 3,08 191,97 2,11 91,33 1,53 6,66 0,26 5,80 0,21 5,15 7,29 8,55 3,02 10,03 3,71 286,47 2,41 118,67 2,00 7,09 0,04 16,72 0,04 6,25 5,98 1,01 5,84 1,69 4,59 600,87 3,81 157,67 1,15 5,13 0,04 21,23 0,05 3,36 3,25 0,97 3,53 1,22 3,93 461,00 3,52 131,00 1,53 7,00 0,05 31,45 0,05 4,58 5,34 1,24 6,82 1,56 3,46 377,70 3,38 32,33 89,81 36 73,00 0,04 33,33 92,59 V% CT28 chiều 16,10 34,33 95,37 V% CT27 trung 0,05 32,00 88,89 V% CT26 dài rễ 7,81 29,67 82,41 V% CT25 rễ Tổng 2,31 27,67 76,85 V% CT24 (%) 25,67 71,30 V% CT23 rễ Số rễ (cm) TB CT22 Số Tỷ lệ Tổng số 111,67 2,08 5,51 0,07 15,55 0,04 6,44 4,93 2,05 4,12 1,06 75 Test Statisticsa,b Test Statisticsa,b Socayrare ChiSquare df Asymp Sig 15.976 014 Test Statisticsa,b Tongsore ChiSquare df Asymp Sig 18.756 005 Tongchieudaire ChiSquare 19.636 df Asymp Sig 003 a Kruskal Wallis Test a Kruskal Wallis Test a Kruskal Wallis Test b Grouping Variable: b Grouping Variable: b Grouping Variable: CongthucTN CongthucTN CongthucTN 76 Phụ lục 9: Phân tích kết ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chiều cao vườn ươm Chiều Chỉ CTTN tiêu thống Số Số mẫu TN sống kê Số Tỷ lệ (%) Tổng cao Tỷ lệ chiều trung (%) cao bình (cm) chết (cm) TB CT29 23,67 65,74 36 S V% TB CT30 V% TB CT31 V% TB CT32 10,39 0,14 8,80 16,88 6,60 2,13 198,10 7,00 V% 7,67 21,30 2,52 2,52 15,70 0,07 8,88 32,83 7,93 0,99 262,13 7,42 0,67 1,85 0,58 0,58 4,92 0,02 1,63 86,60 1,88 0,26 219,73 7,01 31,33 87,04 36 S 6,65 2,08 35,33 98,15 36 S 157,30 2,08 28,33 78,70 36 S 12,33 34,26 4,67 12,96 1,15 1,15 9,73 0,05 3,69 24,74 4,43 0,77 Test Statisticsa,b Test Statisticsa,b Socaysong Tongchieucaocay Chi-Square 9.834 Chi-Square 9.974 df df Asymp Sig .020 Asymp Sig .019 a Kruskal Wallis Test a Kruskal Wallis Test b Grouping Variable: CongthucTN b Grouping Variable: CongthucTN