Các công thức nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa cẩm chướng đơn giốngMix.... - Khảo sát sinh trưởng và phát triển của cây hoa cẩm chướng đơn g
Trang 1NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC
NHÂN NHANH CÂY HOA CẨM CHƯỚNG
GIÓNG MIX (Dianthus Mix) BẰNG KỸ THUẬT
NUÔI CẤY IN VITRO
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 0114
LUẬN V ĂN THẠC SĨ SINH HỌC • • •
Nguửi hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Văn Đính
HÀ NỘI, 2015
Trang 2Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Đính đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô trong Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2, Phòng Sau đại học trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện trong thòi gian tôi học tập chương trình thạc sĩ
Trong thòi gian thực tập tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của ThS La Việt Hồng - Trưởng phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, đã đóng góp
ý kiến để hoàn chỉnh luận văn, nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Tập thể cán bộ Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ - trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lọi về thiết bị, phương tiện để tôi có thể hoàn thành luận văn này
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè những người đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong thời gian qua
Hà Nội, tháng 7 năm 2015
Học viên
NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC
Trang 3liệu, kết quả nghiên cứu ữong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố.
Hà Nội, thảng 7 năm 2015
Học viên
NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC
Trang 41 Lí do chọn đề tài 1
2 Mục đích nghiên cứu 2
3 Nhiệm yụ nghiên cứu 2
4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3
4.1 Ý nghĩa khoa học 3
4.2.Ý nghĩa thực tiễn 3
NỘI DUNG 4
Chương 1 TÔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÂY HOA CẨM CHƯỚNG 4
1.1.1 Đặc điểm phân lo ại 4
1.1.2 Đặc điểm sinh học 4
1.1.3 Điều kiện sinh thái của cây hoa cẩm chướng 5
1.2 GIÁ TRỊ KINH TẾ CỦA NGÀNH SẢN XUẤT HOA TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 6
1.2.1 Sản xuất hoa trên thế g iớ i 6
1.2.2 Sản xuất hoa ở Việt Nam 8
1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THựC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG CÂY HOA CẢNH 12
1.3.1 Nhân giống bằng chồi chính hoặc chồi bên 13
1.3.2 Nhân giống bằng chồi bất định 14
1.4 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THựC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG CÂY HOA CẨM CHƯỚNG 16
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18
2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN cứu 18
2.1.1 Mau v ậ t 18
Trang 52.1.4 Môi trường nuôi cấy 19
2.1.5 Điều kiện nuôi cấy 19
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 19
2.2.1 Phương pháp khử trùng 19
2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 20
2.2.3 Phương pháp phân tích số liệu 24
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN 25
3.1 TẠO VẬT LIỆU KHỞI Đ Ầ U 25
3.2 TÁI SINH VÀ NHÂN NHANH CHỒI THÔNG QUA s ự PHÁT TRIỂN CỦA CHỒI NÁCH 29
3.3 RA RỄ TẠO CÂY CẨM CHƯỚNG IN VITRO HOÀN CHỈNH 32
3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA NƯỚC DỪA ĐẾN SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA CÂY 38
3.5 RÈN LUYỆN CÂY THÍCH NGHI VỚI MÔI TRƯỜNG 44
3.6 KHẢO SÁT SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY HOA CẨM CHƯỚNG ĐƯỢC GIỐNG IN VITRO NGOÀI ĐIỀU KIỆN T ự NHIÊN 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47
1 Kết luận 47
2 Kiến nghị 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 49
Trang 6a-NAA a - Napứialene acelic acid
BAP 6 - benzyl amino purin
GA Gibberellic acid
IAA p - indoleacetic acid
IBA p - indole butyric acid
H20 2 Hydro peroxide (nước oxy già)
HgCl2 Thủy ngân Clorua
MS Murashige and Skoog, 1962
mg/1 Miligram/lít
TDZ N-phenyl-N'-1,2,3-thidiazol-5-yl urea2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
y/y Nồng độ % thể tích/thể tích
Trang 7Hình 3.2 Mau sạch sau 7 ngày 28
Hình 3.3 Mau và chồi in vitro sạch 28
Hình 3.4: Anh hưởng của BAP đến quá trình tái sinh chồi bên của cây
cẩm chướng in vỉtro (sau 4 tuần nuôi cấy) 30
Hình 3.5 Sự tạo chồi dưới ảnh hưởng của BAP 31Hình 3.6 Lá cẩm chướng đơn ừong môi trường ВАР 1 mg/1 (4 tuần nuôi cấy) 32 Hình 3.7 Chồi nách hoa cẩm chướng đơn ừong môi trường BAP lmg/1 (4
tuần nuôi cấy) 32Hình 3.8 Ảnh hưởng a-NAA đến sự hình thành số lượng rễ của c â y 34Hình 3.9 Ảnh hưởng của a-NAA đến chiều dài rễ của cây 34Hình 3.10 Ảnh hưởng a-NAA đến sự hình thành rễ của chồi cẩm chướng
ỉn vitro 36,36
Hình 3.11 Sự hình thành rễ cẩm chướng ở môi trường bổ sung a-NAA nồng
độ 0,2 т § л (sau 7 ngày nuôi cấy) 37Hình 3.12 Chiều dài rễ cẩm chướng ở môi trường bổ sung a-NAA nồng
độ 0,2 mgA (sau 7 ngày nuôi cấy) 37Hình 3.13 Ảnh hưởng của nước dừa đến chiều cao c h ồ i 39Hình 3.14 Ảnh hưởng của nước dừa đến số chồi/mẫu 40Hình 3.15 Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tạo rễ của chồi cẩm chướng
in vitro 40
Hình 3.16 Anh hưởng của nước dừa đến khối lượng tươi 41Hình 3.17 Chiều cao cây nuôi cấy trong môi trường MS đối chứng sau 6
tuần 42Hình 3.18 Chiều cao cây nuôi cấy trong môi trường nước dừa 10% - 6
tuần 42
Trang 8Hình 3.20 Khối lượng tươi cây cẩm chướng ở đối chứng - 9 tuần 43Hình 3.21 Khối lượng tươi cây cẩm chướng ở nước dừa 10% - 9 tuần 43Hình 3.22 Khối lượng tươi cây cẩm chướng ở nước dừa 25% - 9 tuần 44Hình 3.23: Anh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây trong vườn ươm 45 Hình 3.24 Hình ảnh cây hoa cẩm chướng đơn giống Mix thích nghi với
môi trường tự nhiên .46
Trang 9Bảng 2.2 Các công thức thí nghiệm xác đinh hiệu quả của chất khử
trùng 20Bảng 2.3.Các công thức nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự tái sinh
chồi 22Bảng 2.4 Các công thức nghiên cứu ảnh hưởng của a-NAA đến sự tạo
rễ của cây 22Bảng 2.5 Các công thức nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến sự
sinh trưởng và phát triển của cây hoa cẩm chướng đơn giốngMix 23
Bảng 2.6 Công thức nghiên cứu sự thích nghi của cây in vitro qua các
giá thể 24Bảng 3.1 Hiệu quả khử trùng bề mặt của dung dịch javel đến tạo vật liệu
in vitro 26
Bảng 3.2 Anh hưởng của BAP đến quá trình tái sinh chồi bên của cây
cẩm chướng in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy) 29
Bảng 3.3 Anh hưởng của a-NAA đến quá trình tạo rễ cây cẩm chướng
Mix (sau 7 ngày nuôi cấy) 33Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy
đến một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro 38,39
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây trong vườn
ươm 44
Trang 10Ở Việt Nam trong những năm gần đây xuất khẩu hoa tươi đã trở thành một ngành sản xuất có thu nhập cao và ổn định cho người sản xuất Tuy nhiên xuất khẩu hoa tươi đòi hỏi phải có những điều kiện chặt chẽ từ giống, gieo trồng, chăm sóc đến thu hoạch, công nghệ bảo quản, đóng gói, vận chuyển,
an toàn thực phẩm và thị trường nhập khẩu Trong điều kiện hiện nay, ít có doanh nghiệp Việt Nam có thể đáp ứng được các yêu cầu này vì hoa xuất khẩu đòi hỏi mẫu mã đẹp, kích thước đồng đều, đặc biệt là sạch bệnh Vì vậy,
để có được những giống hoa sạch bệnh thì hướng vận dụng các công nghệ cao như nuôi cấy mô; kỹ thuật canh tác và bảo vệ thực vật tiên tiến; áp dụng công nghệ nhà lưới có mái che sáng đang được áp dụng rộng rãi ở một số cơ sở sản xuất như Đà Lạt và một số vùng khác
Nuôi cấy mô và tế bào đã có những đóng góp quan ừọng để cải tiến giống cây trồng và còn nhiều tiềm năng ứng dụng ừong tương lai Trong một vài năm gần đây, vi nhân giống đã trở thành một kỹ thuật đày hứa hẹn để nhân nhanh và mở rộng sản xuất của những đối tượng thực vật được con người chọn lựa Vi nhân giống thực tế là phiên bản thu nhỏ của nhân dòng được thực hiện trong điều kiện vô trùng Kỹ thuật vi nhân giống hay nhân
Trang 11giống in vỉtro được thực hiện dựa ưên khái niệm về tính toàn năng của tế bào
được nhà khoa học Harberlandt đưa ra Mỗi tế bào của cơ thể thực vật đều có tính toàn năng, chẳng hạn như khả năng phát triển thành cây mới dưới điều kiện nuôi cấy cụ thể Tính đến nay, đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy
mô tế bào thực yật được hình thành, đặc biệt là ở các nước đang phát triển, nơi có nhân công rẻ
Các quy trình vi nhân giống đã được phát triển trên nhiều đối tượng cây cảnh, chẳng hạn như cây hoa lay ơn [10], [15], hoa hồng, [30], [37], hoa cúc [33], [35], hoa cẩm chướng [21], [26] và cây hoa lan [7], [13] Giống hoa cẩm
chướng Dỉanthus Mix là một trong những giống hoa đẹp đang được trồng khá
phổ biến ở khu vực Mê Linh - Hà Nội, nhu cầu về giống tốt, sạch bệnh là rất lớn Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu sản xuất thì cần thiết phải có một qui trình nhân giống có hiệu quả cao, đáp ứng thị trường, chính vì vậy chúng tôi chọn
đề tài “NHÂN NHANH CÂY HOA CẨM CHƯỚNG GIỐNG MIX
(Dianthus Mix) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO”.
2 Mục đích nghiên cứu
Nhân nhanh cây hoa cẩm chướng đơn giống Mix (Dỉanthus Mix) bằng kỹ thuật nuôi cấy ỉn vỉtro.
3 Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo vật liệu khởi đầu ỉn vitro từ đốt thân của cây cẩm chướng ngoài tự
nhiên
- Tái sinh và nhân nhanh cây hoa cẩm chướng thông qua phát triển chồi chính và chồi nách
- Tìm hiểu ảnh hưởng của nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy tói
một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây cẩm chướng in vỉtro.
- Ra rễ tạo cây con in vitro hoàn chỉnh.
- Rèn luyện cây con ngoài vườn ươm
Trang 12- Khảo sát sinh trưởng và phát triển của cây hoa cẩm chướng đơn giống
Mix được nhân bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro.
4 Ỷ nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
4.1 Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần bổ sung các qui trình nhân giống
các loại cây trồng bằng kĩ thuật ỉn vitro.
4.2.Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần đưa ra qui trình nhân nhanh hoa cẩm chướng đơn giống Mix tạo ra nguồn giống cho sản xuất
Trang 13NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÂY HOA CẨM CHƯỚNG
1.1.1 Đặc điểm phân loại
Cây cẩm chướng (Dianthus carryophyllus) thuộc họ cẩm chướng
(Caryophyỉlaceae) có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản Họ cẩm chướng
với khoảng từ 82 đến trên 120 chi với khoảng 3.000 loài [16] Họ này phổ biến rộng khắp thế giói này chủ yếu là cây thân thảo, đa dạng nhất tại khu vực
ôn đói, vói một vài loài sinh sống trong miền núi tại khu vực nhiệt đói Một vài thành viên của họ được biết đến nhiều nhất có các loài cẩm chướng
(Dỉanthus), nhiều loài được trồng làm cây cảnh.
1.1.2.Đặc điểm sinh học
a Đặc điểm hệ rễ cây hoa cẩm chướng: cẩm chướng có bộ rễ chùm, phát triển rất mạnh vào vụ chính để hút nước, dinh dưỡng Chiều dài của rễ 15-20 cm Khi vun gốc, cây cẩm chướng sẽ ra rễ phụ ở các đốt thân Rễ phụ cùng với rễ chính tạo thành bộ rễ khoẻ mạnh để giữ cây và hút thức ăn nuôi cây tươi tốt, ra hoa nhiều, đẹp và thơm
b Đặc điểm thân cây hoa cẩm chướng: Thân thảo, nhỏ, mảnh mai, thân mang nhiều đốt và rất dễ gãy ở các đốt Thân cẩm chướng thường có màu xanh nhạt, bao phủ 1 lớp phấn trắng xung quanh có tác dụng quan trọng chống thoát hơi nước và bảo vệ cây khỏi bị sâu bệnh hại Trên mỗi đốt mang
lá và mầm nách
c Đặc điểm bộ lá cây hoa cẩm chướng: Lá kép, mọc từ các đốt thân Lá mọc đối, phiến lá dày, hình mũi mác, mép lá trơn Mặt lá nhẵn, không có độ bóng Trên mặt lá có phủ một lớp phấn trắng, mỏng và mịn Lớp phấn ữắng
có tác dụng làm giảm bốc hơi nước
Trang 14d Đặc điểm hoa cây cẩm chướng: Cây cẩm chướng có 2 dạng: Hoa đơn
và hoa kép Hoa mọc đơn, từng chiếc một Hoa nằm ở đàu cành và mang nhiều màu sắc Ngay cả trên một hoa cẩm chướng kép cũng có từ 2 màu khác nhau trở lên Nụ hoa có đường kính 2-2,5 cm Hoa khi nở hoàn toàn có đường kính khoảng 5-8 cm Hạt cẩm chướng nhỏ, nằm ữong quả Mỗi quả thường có
từ 100- 600 hạt
e Công dụng y học:
Hoa cẩm chướng còn được cho là có tác dụng chống nhiễm trùng, chống
co thắt, trợ tim, làm thoát mồ hồi và bổ ữợ thần kinh (Chopra et al, 1986).Ngoài ra, nụ hoa và hoa tri chứng khó tiêu, sinh nở khó, lọi tiểu Lá làm thuốc cho trẻ nhỏ chữa bệnh về ruột, các lá già nghiền ra chữa bệnh về mắt
1.1.3 Điều kiện sinh thái của cây hoa cẩm chướng
- Đất trồng: Cẩm chướng ưa đất thịt nhẹ, tơi xốp, nhiều mùn, giàu dinh dưỡng, đất thoát khí, giữ ẩm tốt nhưng không ứ nước pH thích hợp từ 6-7, độ
ẩm 60-70%
- Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho hoa cẩm chướng sinh trưởng và phát triển tốt là 18°c - 25°c Nếu nhiệt độ vượt qua ngưỡng thích hợp này, cây sẽ sinh trưởng và phát triển kém, cho hoa với chất lượng kém, màu sắc không tươi, tuổi thọ trung bình giảm
- Ánh sáng: Ánh sáng thích hợp 1500-11000 lux, tối thích 2000-2500 lux Trong quá trình phân hoá mầm hoa, nếu cường độ ánh sáng cao > 11000 lux, cây
sẽ có hoa sớm; nếu cường độ ánh sáng thấp < 1000 lux cây sẽ có hoa muộn
- Độ ẩm: Độ ẩm thích hợp 60-70 %, tối thích 70 % Độ ẩm tương đối của
không khí và đất ảnh hưởng trực tiếp đến sự quang hợp và hô hấp của cây cẩm chướng Nếu độ ẩm được ổn định sẽ tạo điều kiện cho cây hút dinh dưỡng và muối khoáng thuận lợi, cây sinh trưởng tốt, năng suất và phẩm chất hoa cao
Trang 15- Dinh dưỡng: Nếu thiếu dinh dưỡng cây sẽ còi cọc, hoa nhỏ và sâu bệnh hại dễ xâm nhập và phát triển Nếu bón phân không cân đối, thừa dinh dưỡng đạm, cây phát triển YÓng cao, dễ bị lốp đổ và khả năng chống chịu kém.
+ Đạm: Có tác dụng thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, tham gia vào cấu tạo diệp lục Thiếu đạm cây sinh trưởng kém, cho hoa nhỏ, nhanh tàn, lá vàng úa, nếu thiếu trầm trọng cây sẽ ngừng sinh trưởng và chết Tuy nhiên, thừa đạm cây sẽ mọc um tùm, lá nhiều và yếu ớt dễ phát sinh bệnh Hoa cũng yếu dễ bị gục ngã và nhanh tàn
+ Lân: Giúp cho bộ rễ cây phát triển khoẻ mạnh là tiền đề cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây sau này Lân giúp cho hoa bền, đẹp Thiếu lân lá thường có màu tím, màu tím từ mép lá lan dần vào bên trong Hoa nhỏ, chóng tàn, màu sắc nhợt nhạt Trong quá trình sinh trưởng của cây, cây cần lân nhiều vào giai đoạn sinh trưởng sinh thực tức là khi ra hoa kết quả Vì yậy, cần phải hiểu nhu cầu của cây để cung cấp lân vào các giai đoạn hợp lý
+ Kali: Giúp cho cây cứng cáp, chống chịu tốt với điều kiện bất lợi của môi trường và sâu bệnh hại Cây cần kali nhiều vào lúc ra hoa, giúp cành hoa cứng cáp, màu sắc hoa tươi, bền lâu Nếu thiếu kali thì đàu chóp lá già, bắt đầu vàng và chết khô, sau đó là phần thịt l á
+ Canxi: Giúp cho cây chống chịu tốt với điều kiện bất lợi Thiếu canxi ữên lá non xuất hiện những đốm màu xanh nhạt, nghiêm trọng hơn là bị chết khô
1.2.GIÁ TRỊ KINH TẾ CỦA NGÀNH SẢN XUẤT HOA TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM■
1.2.1.Sản xuất hoa trên thế giới
Ngành trồng hoa được bắt đầu từ những năm 1800 ở nước Anh khi mà cây hoa được trồng ữên những cánh đồng mênh mông [39] Ngày nay, ngành trồng hoa là một trong những ngành công nghiệp chính ở cả nước đang và đã
Trang 16phát triển Sản xuất của ngành trồng hoa trên thế giới tăng nhanh với tốc độ 10% trên năm Hiện này có trên 50 quốc gia đã chủ động sản xuất hoa ở quy
mô công nghiệp.Tổng diện tích của ngành trồng hoa ưên thế giới (tính cả diện tích được bảo vệ và diện tích không được bảo vệ) khoảng 628.972 ha Trong
số các nước trồng và sản xuất hoa, Hà Lan, Mỹ, Nhật Bản, Italia, Đức và Canada là những nước sản xuất hoa lớn nhất thế giới, đặc biệt là hoa cắt cành Một số nước đang phát triển ngành trồng hoa (gồm cả trồng và xuất khẩu) như Columbia, Hàn Quốc, Kenya, Itxaren, Ecuado, Ba Lan, Etiopia, Costarica, Thái Lan, Ấn Độ, Trung Quốc, Zimbabue và Mexia Trung Quốc với 286.068 ha, Ấn Độ với 161.000 ha đang là hai nước có diện tích trồng hoa cắt cành chủ yếu trên thế giới, Vùng Châu Á-Thái Bình Dương chiếm khoảng 75% tổng diện tích trồng hoa của thế giới [32]
Châu Âu, Mỹ và Nhật Bản là những nước tiêu thụ hoa lớn nhất Các siêu thị tiêu thụ hoa ở các nước lớn lần lượt là Đức (22%), Mỹ (15%), Pháp (10%), Anh (10%), Hà Lan (9%), Nhật Bản (6%), Thụy Sĩ (5%) và Italia (5%) Trong trường hợp hoa cắt cành, tính trên khả năng tiêu dùng thì Nhật Bản là quốc gia sử dụng nhiều hoa nhất thế giới, sau đó là Châu Âu và Mỹ Cả Liên minh Châu Âu tiêu thụ trên 50% lượng hoa của thế giới, ừong đó Đức là quốc gia đóng vai ừò chủ yếu, sau đó là Anh, Pháp và Italia [12]
Mức thương mại toàn càu hàng năm được công bố vào khoảng trên 100
tỷ đô la Trong đó hoa cắt cành chiếm phần lớn lợi nhuận, sau đó là hoa trồng chậu, cây giống, củ hoa Ở các nước phát triển của Châu Âu, Châu Mỹ và Châu Á chiếm ữên 90% sản lượng thương mại của ngành ữồng hoa Đức là quốc gia nhập khẩu chủ yếu trong khi đó Hà Lan là nước xuất khẩu hoa chủ yếu, sau đó là Colombia, Italia, Itxaren Các nước Châu Á-Thái Bình Dương
là những nước cung cấp hoa chủ yếu cho Nhật Bản và Hồng Kông
Sản phẩm xuất khẩu của ngành trồng hoa tính cả thế giói vào khoảng 17
tỷ đô la (2007) Hoa cắt cành tươi và hoa trang trí (bằng bộ lá) ước tính chiếm
Trang 17khoảng 49,1% (khoảng 8,31 tỷ đô la), thực yật tươi, củ và cành giâm chiếm khoảng 50,9% (khoảng 8,60 tỷ đô la) vào năm 2007 Trong đó, hoa hồng chiếm khoảng 70% sản lượng hoa thương mại Hà Lan là nước có ngành công nghiệp hoa phát triển vào bậc nhất thế giới, ước tính sản lượng thương mại của ngành trồng hoa nước này vào khoảng 49,6% (tương đương 8,56 tỷ đô la) tổng giá trị của ngành hoa xuất khẩu của thế giới năm 2007 Colombia là nước xuất khẩu hoa lớn thứ hai trên thế giới, chiếm khoảng 6,5% (tương đương 1,12 tỷ đô la) Đức là nước nhập khẩu hoa lớn nhất trên thế giới khoảng 2,59 tỷ đô la, sau đó là Anh (1,89 tỷ đô la), Mỹ (1,81 tỷ đô la), Hà Lan vừa là nước sản xuất vừa là nước nhập khẩu hoa, hàng năm Hà Lan nhập khoảng 1,55 tỷ đô la, Pháp nhập khoảng 1,43 tỷ đô la [32] Trong số các sản phẩm của ngành ưồng hoa được các nước nhập khẩu thì hoa hồng là loại hoa chủ yếu được nhập khẩu bởi các nước Châu Âu, ngoài ra còn nhập khẩu các loại hoa mùa hè, hoa vùng nhiệt đới và hoa lan Nhật Bản là một nước nhập khẩu hoa lớn nhất ở vùng Châu Á-Thái Bình Dương.
1.2.2 Sản xuất hoa ở Việt Nam
Thực trạng của ngành sản xuất hoa và cây cảnh ở Việt Nam
Hoa tươi xuất khẩu của các nước Đông Nam Á nói chung và Việt Nam nói riêng khó có thể thâm nhập vào thị trường khu vực Bắc Mỹ hoặc Trung Âu
vì các thị trường này đã có truyền thống nhập khẩu hoa tươi từ các khu vực khác như vùng Nam Mỹ và Trung Mỹ, các nước Nam Âu, Itxaren và Châu Phi Những thị trường này cũng khá xa về khoảng cách địa lý nên chi phí vận chuyển sẽ không phải là lợi thế Các yếu tố liên quan đến việc đạt được những mục tiêu trung hạn này chỉ có thể là giá cả và các dịch vụ khách hàng
Đối với xuất khẩu hoa, mục tiêu ngắn hạn là phát triển sang các nước Châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan, Singapore Những thuận lọi khi bán hàng cho những nước này chính là vị trí địa lý gần, các yêu cầu vận
Trang 18chuyển và chi phí cho việc bảo quản sau khi thu hoạch thấp và sự liên hệ để tìm khách hàng thường có thể dựa vào các mối quan hệ kinh doanh hiện tại.Thị trường trong nước rộng lớn và phong phú, bên cạnh đó tiềm năng xuất khẩu cũng đầy hứa hẹn, hoa và cây cảnh Việt Nam nếu được tổ chức tốt
từ khâu sản xuất, quảng bá đến tiêu thụ sẽ tạo tiềm lực kinh tế lớn cho ngành sản xuất nông nghiệp Việt Nam trong tiến trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng.Với khí hậu và thổ nhưỡng thuận lợi để có thể trồng được nhiều loại hoa
và cây cảnh, hiện Việt Nam đang sở hữu một nguồn tài nguyên hoa rất đa dạng, từ các loại hoa xứ nhiệt đới được ữồng ở các vùng đồng bằng đến hoa
xứ lạnh trồng trên các cao nguyên như Lâm Đồng, Pleiku và vùng núi như Sapa, Hoàng Liên Sơn Sự phát triển của ngành hoa Việt Nam trong thời gian qua đã mang lại cho các sản phẩm hoa của Việt Nam sự đa dạng và chất lượng vượt bậc so với thời gian trước
Phương hướng phát triển sản xuất và xuất khẩu hoa tươi thời kỳ đến 2018
Đời sống tinh thần ngày càng được coi trọng hơn, sản phẩm hoa và cây cảnh cũng có vai trò quan trọng trong cuộc sống khi thu nhập và nhu cầu thẩm
mỹ của ngưòi dân ngày càng cao
Dự kiến đến năm 2018 vùng hoa TP Hồ Chí Minh có 1500 ha, diện tích tập trung chính ở các huyện Củ Chi, Thủ Đức; diện tích hoa được trồng theo quy trình công nghệ cao chiếm tỷ lệ lớn (khoảng 60-70% diện tích)
Vùng Đông Nam Bộ: Dự kiến đến năm 2018 vùng hoa Lâm Đồng 3000
ha, diện tích tập trung chính ở TP Đà Lạt (chiếm 1/3 diện tích toàn tỉnh); chủ yếu hoa ôn đới được trồng theo quy trình công nghệ cao
Vùng Trung du Miền núi Bắc bộ: Dự kiến đến năm 2018 vùng hoa hàng hoá có khoảng 500 ha, tập trung chính ở Lào Cai, Hà Giang, Sơn La
Hà Nội có 3000 ha, diện tích tập trung chính ở huyện Từ Liêm (Tây Tựu), Đông Anh, Quận Tây Hồ, Mê Linh V.Y
Trang 19Sản xuất của ngành hoa ở Việt Nam
Đà Lạt là vùng sản xuất hoa nổi tiếng và là vùng có tiềm năng lớn nhất
về sản xuất hoa của cả nước Hiện nay công ty TNHH Đà Lạt - Hasfarm 100% vốn nước ngoài đang áp dụng công nghệ sản xuất hoa tiên tiến vói qui
mô diện tích 15 ha sản xuất ữong nhà kính và 2 ha nhà thép; có hệ thống tự động điều chỉnh nhiệt độ, ẩm độ, hệ thống tưới nhỏ giọt bằng nguồn nước sạch hòa tan vói phân bón, thuốc bảo vệ thực yật Các chủng loại hoa Công ty
Đà Lạt - Hasfarm đang sản xuất bao gồm hoa hồng, cúc, cẩm chướng, ly ly, đồng tiền và lá hoa ưang trí Sản lượng hoa xuất khẩu sang các nước Hồng Kông, Nhật, Đài Loan, Singapore chiếm 55%, phàn còn lại dành cho tiêu thụ nội địa
Hiện nay, sản xuất hoa ở nước ta được thực hiện bởi 2 đối tượng chính: Nông dân sản xuất tự phát theo xu hướng nhu càu thị trường trong nước và bởi các doanh nghiệp tư nhân trong nước, liên doanh với nước ngoài hoặc 100% vốn nước ngoài sản xuất hoa chủ yếu cho xuất khẩu Hoa tiêu thụ trong nước chủng loại đa dạng và cung cấp ra thị trường theo mùa vụ, chất lượng từ thấp đến cao, giá cả vừa phải, hiệu quả kinh tế không cao, sản xuất nhỏ lẻ và thiếu ổn định Các doanh nghiệp sản xuất hoa xuất khẩu lượng hoa nhiều hơn mang tính hàng hoá, chất lượng hoa cao hơn và được sản xuất trong điều kiện
kỹ thuật cao, sản phẩm được tiêu thụ theo hợp đồng Hiện nay, Việt Nam đã xuất khẩu được các sản phẩm hoa cắt cành như hồng, phong lan, cúc, đồng tiền, cẩm chướng, ly ly, sao tím sang Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan, Nhật bản, Singapore Australia, Ả rập; vạn niên thanh, mai chiếu thủy, mai cảnh sang Trung Quốc, Hoa Kỳ, Nhật Bản Tuy nhiên, số lượng xuất khẩu không nhiều, với doanh thu hơn 10 triệu ƯSD/năm Sở dĩ, sản phẩm hoa, cây cảnh của Việt Nam khó thâm nhập thị trường thế giới là do chủng loại, chất lượng, kích cỡ không đồng đều, chưa đáp ứng được thị hiếu của khách hàng
Trang 20quốc tế Trong khi đó, tiêu thụ trong nước lại có xu hướng chạy theo mùa yụ (rằm, lễ, Tết, các ngày kỷ niệm) là chính.
Sản xuất và xuất khẩu hoa tươi đòi hỏi phải có những điều kiện chặt chẽ từ giống, gieo trồng, chăm sóc đến thu hoạch, công nghệ bảo quản, đóng gói, vận chuyển, an toàn thực phẩm và thâm nhập vào các kênh phân phối của thị trường nhập khẩu Trong điều kiện hiện nay, ít có doanh nghiệp Việt Nam có thể đáp ứng được các yêu cầu này Vì vậy, trước mắt cần tập trung phát triển một số loại hoa Việt Nam có tiềm năng xuất khẩu và tương đối dễ đáp ứng yêu cầu của đối tác nước ngoài
v ề ứng dụng công nghệ cao: Đã được cải thiện đáng kể, như thay đổi cơ
cấu giống, nuôi cấy mô, kỹ thuật canh tác và bảo yệ thực yật tiên tiến; áp dụng công nghệ nhà lưới có mái che sáng Tuy nhiên, sự thay đổi này diễn ra không đồng đều giữa các vùng sản xuất vì nhiều lý do (khí hậu thời tiết, trình
độ thâm canh, khả năng đầu tư, khả năng tiếp cận kỹ thuật tiến bộ và thị trường )■ Đà Lạt có thể coi là địa bàn có tiến bộ nhanh nhất trong cả nước về phát triển sản xuất hoa cắt cành
Kỹ thuật trồng hoa: Ở nhiều nơi vẫn chủ yếu dựa vào kinh nghiệm và phương pháp nhân giống cổ truyền như gieo từ hạt, trồng từ củ, mầm, nhánh Các phương pháp này dễ ttồng, giá thành cây giống thấp nhưng chất lượng giống không cao, dễ bị thoái hóa, làm giảm chất lượng hoa vì vậy tuy chủng loại hoa của Việt Nam khá phong phú nhưng thiếu giống hoa đẹp, chất lượng cao
v ề quy mô và tổ chức sản xuất: Hầu hết những cơ sở sản xuất hoa cắt cành ở nước ta còn ở quy mô nông hộ nhỏ, tổ chức sản xuất đơn lẻ, với diện tích trung bình từ 2.000 đến 3.000 m2/hộ Hộ sản xuất hoa lớn cũng chỉ từ 1 đến 2 ha Ở quy mô sản xuất này không thể áp dụng những kỹ thuật tiến bộ như nhà kính, nhà lưới, sân bãi, mặt bằng, dây chuyền chế biến, bảo quản vận chuyển lạnh để đưa ngành sản xuất hoa trở thành sản xuất công nghiệp Từng
Trang 21hộ nông dân sản xuất cá lẻ, thiếu hợp tác là trở ngại lớn cho việc tạo nguồn hàng hóa lớn và đa dạng với chất lượng cao, đồng nhất Trên thực tế, đã có nhiều họp đồng xuất khẩu không thể thực hiện được do không thể tổ chức cung cấp sản phẩm theo yêu càu, trong khi tiềm năng sản xuất là rất lớn [38].
1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THựC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG CÂY HOA CẢNH
Sản xuất thương mại các loại cây trang trí (cây cảnh, cây hoa ) đang phát triển trên thế giới Đây là một ngành mang lại lọi nhuận cao và không ngừng phát triển ữong hai thập kỉ qua, hứa hẹn là một ngành công nghiệp tiềm năng trong tương lai [18] Quá trình nhân giống và cải tiến chất lượng sản phẩm cây cảnh chẳng hạn như kiểu lá, màu hoa, mùi hương, độ bền của sản phẩm đang là những mục tiêu quan trọng của ngành công nghiệp này.Nuôi cấy mô và tế bào đã có những đóng góp quan trọng để cải tiến giống cây trồng và còn nhiều tiềm năng ứng dụng trong tương lai Trong một vài năm gần đây, vi nhân giống đã trở thành một kỹ thuật đầy hứa hẹn để nhân nhanh và mở rộng sản xuất của những đối tượng thực vật được con người chọn lựa Vi nhân giống thực tế là phiên bản thu nhỏ của nhân dòng được thực hiện trong điều kiện vô trùng Kỹ thuật vi nhân giống được thực hiện dựa ưên khái niệm về tính toàn năng của tế bào được nhà khoa học Harberlandt đưa ra Mỗi
tế bào của cơ thể thực vật đều có tính toàn năng, chẳng hạn như khả năng phát triển thành cây mới dưới điều kiện nuôi cấy cụ thể
Nền công nghiệp cây cảnh đã được ứng dụng rất nhiều phương pháp
nhân giống in vitro nhằm mở rộng quá trình nhân giống ở quy mô công
nghiệp Tính đến nay, đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành, đặc biệt là ở các nước đang phát triển, nơi có nhân công rẻ
Trang 22Các quy trình vi nhân giống đã được phát triển trên nhiều đối tượng cây cảnh, chẳng hạn như cây hoa lay ơn [10], [15], hoa hồng [30], [37], hoa cúc [33], [35], hoa cẩm chướng [21], [26] và cây hoa lan [7], [13].
Quá trình vi nhân giống là một quá trình phức tạp, được phân chia thành
ba nhóm phương pháp chính:
1/ Nhân giống bằng chồi chính hoặc chồi bên
2/ Nhân giống bằng cách phát sinh chồi bất định
3/ Quá trình phát sinh phôi sôma
Hai phương pháp nhân giống đầu tiên có cây con được hình thành thông quá trình phát sinh cơ quan: Các chồi đơn cực được hình thành (cực chồi), sau
đó các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ để hình thành nên cực còn lại (cực rễ) Ngược lại, quá trình phát sinh phôi sôma dẫn đến sự hình thành phôi lưỡng cực thông qua một số bước tương tự như quá trình phát triển của phôi hữu tính Tất cả các phương pháp này được sử dụng để sản xuất cây cảnh
trong điều kiện ỉn vitro.
1.3.1 Nhân giống bằng chồi chính hoặc chồi bên
Chồi chính và chồi bên ở trạng thái nghỉ hoặc trạng thái hoạt động, tùy thuộc vào trạng thái sinh lý của mẫu Vi nhân giống thông qua hình thành chồi chính hoặc chồi bên là một ữong những kỹ thuật tốt nhất để nhân nhanh giống cây trồng bởi vì sự ổn định di truyền của các dòng được nhân ra Một đinh chồi và một chồi bên khi được sinh trưởng ừong điều kiện có nồng độ cytokinin cao thường phát triển chồi bên tạo thành cụm chồi, từ đó có thể được nhân lên thành các cụm chồi theo cách tương tự Quá trình nhân lên này
có thể là vô hạn, từ đó có hàng triệu cây giống có thể được nhân lên từ một chồi chính hoặc chồi bên Phương pháp này có độ di truyền ổn định cao bởi vì các tế bào của mô phân sinh đồng nhất lưỡng bội, các tế bào có độ đồng đều cao Hệ số nhân giống bằng kỹ thuật này khác nhau, tùy thuộc vào kiểu gen
Trang 23và lượng cytokinin sử dụng Theo tác giả Udom và cộng sự (2009), hệ số nhân chồi từ đoạn thân trưởng thành của cây hoa hồng lai Rosa hybrida trên môi trường bổ sung BAP (13,2 ỊiM) kết hợp với NAA (0,022 ỊiM) cho tỷ lệ hình thành số chồi trên mẫu là cao nhất [34] Còn tác giả Waseem và cộng sự
(2009) đưa ra quy trình nhân giống in vitro cây hoa cúc từ đỉnh chồi trên môi
trường bổ sung IAA với nồng độ 0,48 I^M cho tỷ lệ hình thành chồi cao nhất (86,6%) [35] Sự hình thành đa chồi cũng được nghiên cứu trên đối tượng hoa hồng Rosa rugosa từ đốt thân ừên môi trường MS có bổ sung BAP (2,2 ỊiM) + NAA (0,054 |iM) + GA3 (2,0 |iM) với lượng đường sacarozơ 3% [37] Tác giả Haouala và cộng sự (2012) đã phát triển một quy trình để nhân giống in vitro cây hoa lay ơn từ chồi đỉnh trên môi trường MS có bổ sung IBA (2,46 p,M) và BAP (9,84 p,M) [15] Trên đối tượng cây hoa cúc, tác giả Nalini (2012) đưa ra kết luận sự hình thành chồi từ chồi đỉnh trên môi trường MS có
bổ sung Kinetin (13,85 |iM) và IAA (9,6 ỊiM) [29] Tác giả Shirdel và cộng
sự (2013) thông báo quá trình nhân dòng cây hoa hong Rosa canina từ chồi bên trên môi trường MS có bổ sung BAP (26,4 ỊiM) là phù hợp nhất [30]
1.3.2 Nhân giống bằng chồi bất định
Có rất nhiều loại cây cảnh đã được nhân giống in vitro thành công bằng
việc hình thành các chồi bất định Các chồi bất định có thể được:
- Phát triển trực tiếp từ các loại mẫu như rễ, thân, cuống lá, phiến lá và các bộ phận của hoa
- Phát triển gián tiếp từ mô sẹo callus thu được từ các nguồn mẫu thực vật.Việc lựa chọn loại mẫu và hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật
là hai nhân tố quan trọng nhất trong quá trình phát sinh chồi bất định
Phát triển trực tiếp từ nguồn mẫu thực vật: Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Kantia và cộng sự (2002) đã đưa ra một quy trình phát sinh chồi bất định có
hiệu quả cao từ lá cây hoa cẩm chướng Dianthus chinensis được nuôi cấy trên
môi trường MS có bổ sung BAP (13,2 ỊiM) kết hợp với NAA (7,35 ỊiM) [19]
Trang 24Tác giả Martin và cộng sự (2003) đã tái sinh trực tiếp chồi từ phiến lá của hai
giống hoa hồng môn (Anthurium andraeanum) cắt cành, hiệu quả tái sinh chồi
cao nhất là 67% từ lá với hệ số đạt 7 chồi/mẫu [27] Nhóm nghiên cứu của tác giả Chen và cộng sự (2004) cũng phát triển một quy trình nhân giống hiệu
suất tái sinh trực tiếp chồi từ lá của cây lan Paphiopedilum Ba công thức
nghiên cứu (2,4-D 4,52 |iM; TDZ 22,71 ^iM và 2,4-D (4,52 |iM) kết hợp TDZ (4,54 ỊiM)) đã cho số chồi trung bình/mẫu cao từ mẫu lá [7] Nhóm nghiên cứu Waseem và cộng sự (2009) đã chứng minh ảnh hưởng của các loại auxin đến khả năng tái sinh chồi bất định trực tiếp từ mảnh lá của cây hoa cúc [35] Quá trình phát sinh cơ quan đã được thực nghiệm trên một số loại cây cảnh, ví dụ các tế bào sôma của cây thuốc lá cảnh [8], cây san hô xanh
(Euphorbia tirucalli) [14], cây Hygrophila polysperma [22].
- Phát triển gián tiếp thông qua mô callus
Tác giả Kantia và Kithari (2002) đã nghiên cứu quá trình hình thành chồi bất định trên môi trường MS có bổ sung BAP (2,2 |xM) và 2,4-D (4,87 |xM) từ
mô sẹo callus được hình thành nhiều trên bề mặt lá của loài cẩm chướng
Dỉanthus chỉnesỉs [19] Nhóm nghiên cứu Smaranda (2005) đã thực hiện quá
trình vi nhân giống gián tiếp của cây hoa cúc thông quá nuôi cấy callus thu được từ các đốt thân [31] Kaviani y à cộng sự (2011) đã hoàn chỉnh một quy trình cảm ứng hình thành callus và hình thành chồi và rễ từ mẫu lá ở cây
Matthỉola incana [23].
- Phát sinh phôi sôma
Sự hình thành cấu trúc lưỡng cực chứa cả mô phân sinh chồi và mô phân sinh rễ tương tự như quá trình phát triển phôi hữu tính (được hình thành từ hợp tử) Các thể phôi này có thể phát triển thành thực yật đủ chức năng dưới điều kiện thích hợp
Theo nhóm nghiên cứu Tanaka (2004), sự phát sinh phôi sôma cao nhất tò
mẫu lá của cây hoa cúc (Dendranthema grandiflorum) trên môi trường MS có
Trang 25chứa IAA (57,08 mM) + kinetin (0,465 mM) [33] Phôi được phát sinh trên
môi trường không chứa kinetin Tác giả Kumar và cộng sự (2002) đã thông báo
rằng sốc nhiệt cảm ứng quá trình phát sinh phôi sôma ở mô sẹo callus được
nuôi cấy và tái sinh cây từ callus nuôi cấy ở một số loài Tricyrtis [25] Tác giả
Datta và cộng sự (2001) đã phát sinh trực tiếp phôi sôma từ mẫu là các cánh
hoa hình tia ở chi hoa cúc trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D và BAP [9]
1.4 ỨNG DUNG KỸ THUÂT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THƯC VÂT• • • • TRONG NHÂN GIỐNG CÂY HOA CẨM CHƯỚNG
Nhóm nghiên cứu Brar và cộng sự (1996) đã nghiên cứu ảnh hưởng của
TDZ và BAP đến quá trình tạo đa chồi từ chồi bên ở các giống cẩm chướng
khác nhau {Dỉanthus caryophyllus) [6] số chồi được tạo ra phụ thuộc vào
bản chất và nồng độ của cytokinin được sử dụng Giống cẩm chướng Barlo II
Nora có số chồi cao nhất trên môi trường MS bổ sung BAP nồng độ 8,8 (iM
BAP Với kết quả tương tự, nhóm nghiên cứu của tác giả Ali và cộng sự
(2008) cho rằng môi trường MS bổ sung BAP 4,4 |iM có hiệu quả tạo đa chồi
lớn nhất từ nguồn mẫu là mô phân sinh đỉnh chồi sau 7 ngày nuôi cấy [3]
Nhóm nghiên cứu của Kharrazi và cộng sự (2011) đã đánh giá ảnh hưởng các
chất điều hòa sinh trưởng thực yật đến quá trình tạo đa chồi từ chồi bên ở cây
hoa cẩm chướng, kết quả là trên môi trường có bổ sung BAP 4,4 ỊiM + NAA
1,47 ỊiM cho số chồi/mẫu cao nhất, đạt 5 chồi/mẫu [24]
Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Altvorst và cộng sự (1992) đã hoàn
chỉnh quy trình phát sinh chồi bất định từ mẫu lá ỉn vitro của cây hoa cẩm
chướng Số chồi bất định cao nhất trên môi trường chứa BAP 4,4 I^M và NAA
2,205 I^M [4] Tác giả Watad và cộng sự (1996) đã đưa ra phương pháp tái sinh
cây cẩm chướng hoàn chỉnh trên môi trường có bổ sung TDZ (4 mg/1) và NAA
(7,35 ỊiM) [36] Nhóm nghiên cứu Arici và cộng sự (2009) đã phát triển một
Trang 26quy trình để vi nhân giống in vitro cây hoa cẩm chướng, hệ số tái sinh chồi tốt
nhất trên môi trường có bổ sung BAP 4,4 (iM và NAA 0,36 ỊiM [5]
Kanwar và Kumar (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các loại chất điều hòa sinh trưởng thực vật, nguồn mẫu và tương tác giữa chúng lên quá
trình hình thành chồi in vitro từ callus của cây hoa cẩm chướng, đã có trên 27
loại môi trường nuôi cấy đã được nghiên cứu, chỉ môi trường chứa riêng lẻ TDZ 2 mg/1 và zeatin hoặc kết hợp giữa TDZ hoặc zeatin với NAA với sự có mặt của IAA mới có khả năng biệt hóa các cụm callus, trong đó, môi trường
có bổ sung TDZ 2 mg/1 kết hợp IAA 4,8 |iM cho hệ số tái sinh chồi cao nhất
từ mô sẹo callus [20]
Một quy trình hiệu quả đã được phát triển và hoàn thiện để tái sinh cây hoàn chỉnh thông qua phát sinh phôi sôma ở cây hoa cẩm chương từ nụ hoa
đã cảm ứng thành callus [26] Năm 2006, tác giả Karami và cộng sự đã nghiên cứu một phương pháp hiệu quả để phát sinh phôi sôma ở cây hoa cẩm chướng và nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường saccarozơ đến quá trình này Tỷ lệ cao nhất phát sinh phôi sôma là môi trường có bổ sung đường saccarozơở 9% và 12% có bổ sung 2,4-D 9 |iM và BAP 0,8 [21] Tác giảIantcheva và cộng sự (2008) đã công bố quá trình phát sinh phôi sôma từ mẫu
lá của cây hoa cẩm chướng Phôi sôma khỏe thu được trên môi trường hình
thành phôi có bổ sung BAP 2,2 ỊiM và casein hydrolysate 250mg/l ở cây hoa
cẩm chướng [17] Kết quả tương tự vậy, tác giả Frey và cộng sự (1991) đã phát triển quy trình tối ưu để cảm ứng quá trình phát sinh phôi sôma từ callus trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3,0 |iM [11]
Trang 27Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN cứu
2.1.1 Mẩu vật
Cây hoa cẩm chướng đơn giống Mix (Dìanthus Mix,) được chọn làm vật
liệu thí nghiệm và do Phòng Sinh lý thực vật (Khoa Sinh-KTNN, ĐHSPHN 2) cung cấp
2.1.2 Thòi gian và đỉa điểm thưc hiên u • • •
Đe tài nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Sinh lý thực vật trường ĐHSPHN 2 từ tháng 11-2014 đến tháng 6-2015
2.1.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
2.13.1 T h ỉầ b i s
Bảng 2.1: Danh mục thiết bị thí nghiệm.
Máy khuấy từ gia nhiệt ARE/VELP, Italia
Trang 282.1.4 Môi trường nuôi cấy
Các nghiên cứu invitro íhường sử dụng môi trường nuôi cấy cơ bản
(Murashige và Skoog, 1962) MS + 30g saccarozơ+ 7,5 g agar + các chất điều hòa sinh trưởng
Môi trường thạch được đựng ữong bình thủy tinh hoặc túi nilon
pH môi trường: 5,8
Môi trường được khử trùng trong nồi vô trùng ở 117°c với thời gian 15phút
2.1.5 Điều kiện nuôi cấy
Toàn bộ các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhân tạo
Ngoài tủ cấy vô trùng:
Từ đoạn thân cây hoa, cắt thành đoạn 3-4 cm bao gồm cả chồi nách Sau
đó, lau sạch bằng cồn, rửa bằng nước rửa bát, cho chảy dưới vòi nước sạch
Trong tủ cấy vô trùng:
Chuẩn bị: nước cất, bình đựng, Fancol 50ml, giấy thấm đã khử trùng Làm sạch mẫu: Rửa lại bằng nước cất, lắc cồn 70° trong 2 phút khử trùng
sơ bộ Sau đó rửa lại từ 3-5 làn bằng nước cất vô trùng và đặt lên môi trường
MS đựng sẵn ữong bình tam giác
Trang 292.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1 Tạo vật ỉiệu khởi đầu
- Mục đích: Tạo được mẫu sạch ỉnvỉtro.
- Mau vật: Cây cẩm chướng được chăm sóc và sàng lọc ở trong Phòng Sinh lý thực yật (ĐHSPHà Nội 2) cao khoảng 15-20cm, sau đó cắt những đoạn thân dài 3-5cm
- Phương pháp tiến hành: Theo các công thức bảng 2.2
- Môi trường nuôi cấy: MS + 3% sacarozơ+ 7,5 g agar, pH 5,8
Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại được thực hiện ở các công thức trong bảng 2.2
Bảng 2.2 Các công thức thí nghiệm tạo vật liệu khỏi đầu từ đốt thân Công
Trang 30- Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết sau 7 ngày theo dõi.
Tỷ lệ mẫu sạch ịmẫu vô trùng):
Tổng số m ẫu không bị nhiễm
- Mục đích: Tìm ra nồng độ B AP thích hợp cho sự phát triển chồi ngủ
- Mẩu yật: Vật liệu khởi đầu đã có sẵn
- Phương pháp tiến hành: Từ vật liệu khởi đầu cắt những đoạn dài khoảng 1-2 cm,nuôi cấy ừên môi trường nghiên cứu theo bảng 2.3
- Môi trường: MS cơ bản( 3% sacarozơ+ 7,5 g agar, pH5,8) bổ sung BAP có nồng độ thay đổi 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/1 Điều kiện chiếu sáng 2000 lux, chu kỳ 12 giờ/ngày, độ ẩm 70%
Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, yếu tố ngoại cảnh gần như tương đối theo các công thức trong bảng 2.3