quy trình sản xuất amylase và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm (sản xuất maltodextrin)

Enzyme amylase được sử dụng nhiều trong sản xuất là do khả năngchịu nhiệt cao, năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chiphí cho quá trình tinh sạch dịch đư

BỘ CÔNG THƯƠNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE, NGUỒN THU NHẬN VÀ GIỐNG VI SINH

VẬT SỬ DỤNG 4

1.1 Giới thiệu về enzyme amilase 4

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu và định nghĩa 4

1.1.2 Phân loại, đặc tính, cơ chế tác dụng 4

1.2 Nguồn thu nhận enzyme amylase 8

1.3 Tổng quan về nguồn giống vi sinh vật 9

1.3.1 Vai trò của giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme 9

1.3.2 Các giống vi sinh vật sản xuất enzyme Amylase 9

1.3.3. Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae 9

1.3.4 Yêu cầu đối với giống vi sinh vật 15

CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME α- AMYLASE TỪ ASPERGYLLUS ORYZAE 16

2.1 Bảo quản giống Aspergyllus oryzae 16

2.2 Nguyên liệu 16

2.3 Quy trình công nghệ 16

2.3.1 Sơ đồ quy trình công nghệ 16

2.3.2 Thuyết minh quy trình 18

2.3.3 Ưu và nhược điểm của phương pháp 19

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của enzyme 20

2.5 Các yếu tối ảnh hưởng đến quá trình lên men 22

2.6 Một số thiết bị sử dụng trong quá trình sản xuất amylase 23

CHƯƠNG 3: VAI TRÒ VÀ ỨNG DỤNG CỦA ENZYME AMYLASE 30

3.1 Vai trò của enzyme amylase 30

3.2 Ứng dụng của enzyme amylase trong công nghiệp thực phẩm 31

3.2.1 Ứng dụng của enzyme amylase trong sản xuất Maltodextrin 31

3.2.2 Các ứng dụng khác của enzyme amylase trong công nghiệp thực phẩm 45

3.3 Các loại sản phẩm hiện đang lưu hành trên thị trường 47

3.4 Một số ứng dụng của enzyme amylase trong các lĩnh vực khác 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

Nhóm 9

Môn UDCNSH trong CNTP GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang

áp dụng hai cách: thủy phân tinh bột bằng acid và bằng enzyme Để thủy phân tinh bột từlâu người ta đã sử dụng acid vô cơ như HCl và H2SO4 Nhưng kết quả cho thấy, thủy phânbằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đápứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm Do vậy việc thay thế và ứng dụng enzyme để thủy phântinh bột là một kết quả tất yếu của lịch sử phát triển

Enzyme amylase đã được tìm ra đã được góp phần quan trọng cho nhiều ngành côngnghiệp chế biến thực phẩm Enzym amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau nhưamylase từ thực vật, động vật và VSV Amylase càng ngày càng được thay thế acid trongsản xuất ở quy mô công nghiệp Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khảnăng chịu nhiệt cao mà không mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được chiết xuất từ VSV,

cụ thể là các chuẩn vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng Ngoài ra,amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thủy phân tinh bột: năng lượng xúctác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịchđường

Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch (malt), hạt bắp nảy mầm,hay từ nấm mốc, Nguyên liệu sản xuất là gạo, bắp, khoai mì, … Đây là những nguồnnguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền và có thể thấy dễ dàng ở nước ta Do đó, đây là một lợi thế và làhướng phát triển mạnh làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát triển

Chính vì vậy, với đề tài này sẽ giúp mọi người tìm hiểu rõ hơn về phương pháp sảnxuất enzyme amylase và những ứng dụng vượt trội của nó, đặc biệt là ứng dụng trong việcsản xuất maltodextrin - một polysaccharide được sử dụng như là một phụ gia thực phẩm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE, NGUỒN THU NHẬN VÀ

GIỐNG VI SINH VẬT SỬ DỤNG 1.1 Giới thiệu về enzyme amilase

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu và định nghĩa

Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra quá trình lênmen Năm 1814, Kirchoff - viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước chiết của mầm đạimạch có khả năng chuyển hoá tinh bột thành đường ở nhiệt độ thường Năm 1833, hai nhàkhoa học người Pháp là Payen và Persor đã chứng minh chất có hoạt động phân giải tinhbột thành đường có thể tách được ở dạng bột Thí nghiệm này được tiến hành bằng cáchcho etanol vào dịch chiết của lúa đại mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa Kết tủađược hình thành này có khả năng chuyển hoá tinh bột và nếu đun kết tủa này sẽ mất tácdụng chuyển hoá Danh từ diastase là do Payen và Persor dung để gọi enzyme lúc bấy giờ

Enzyme amylase đã được tìm ra góp phần quan trọng cho nhiều ngành chế biến thựcphẩm Enzyme amylase có thể được tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như từ thực vật,động vật và vi sinh vật Enzyme amylase được sử dụng nhiều trong sản xuất là do khả năngchịu nhiệt cao, năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chiphí cho quá trình tinh sạch dịch đường

Các enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nộiphân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:

R.R` + H-OH → RH + R`OH

1.1.2 Phân loại, đặc tính, cơ chế tác dụng

1.1.2.1 Phân loại

Có 6 loại enzyme được xếp vào hai nhóm lớn:

 Endoamylase (enzyme nội bào)

 Exoamylase (enzyme ngoại bào)

a Endoamylase: Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi

polysaccharide

Gồm có:

 α– amylase: có khả năng phân cắt các liên kết 1,4- glucoside của cơ chất một cách

ngẫu nhiên, là enzyme nội bào α- amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinhbột mà còn có khả năng phân hủy các hạt tinh bột nguyên vẹn

 Nhóm enzyme khử nhánh:

Chia thành hai loại:

Nhóm 9

Môn UDCNSH trong CNTP GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang

 Khử trực tiếp: Pullulanase (α-dextrin 6 – glucosidase)

Pullulanase là một trong các enzyme quan trọng nhất trong chế biến tinh bột Enzymenày được sử dụng trên một quy mô lớn trong glucose và các ngành công nghiệp sirômaltose Pullulanase là một loại enzyme rất mạnh cho sự thoái hóa tinh bột thành glucosehoặc maltose Pullulanase thủy phân α-1,liên kết 6- glycosidic của chuỗi phân nhánh và α-

1, 4-glycosidic

 Khử gián tiếp: Transglucosylase (oligo-1,6 glucosidase) và Maylo-1,6- glucosidase.Enzyme này thủy phân liên kết β-1,6- glucoside trong isomaltose, panose và cácdextrin tới hạn có thể chuyển hóa đường có thể lên men được

b Exoamylase:

Enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide Thuộcnhóm enzyme này có γ- amylase và β- amylase

 β- amylase (β-1,4-glucan-maltohydrolase)

β–amylase xúc tác từ sự thủy phân các liên kết 1,4-glucan trong tinh bột, glucogen

và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch Maltoseđược hình thành do sự xúc tác của β-amylase có cấu hình β

 γ- amylase (glucose amylase)

Glucose amylase có khả năng thủy phân liên kết -1,4 lẫn -1,6- glucoside, ngoài ra còn

có khả năng thủy phân liên kết -1,2 và -1,3- glucoside Glucose amylase có khả năng thủyphân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin, dextrin… thành glucose mà không cần có

sự tham gia của các loại enzyme amylase khác

Tính tan: Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng

Các amylase bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+,Hg2+

Cơ chất tác dụng của enzyme amylase: là tinh bột và glycogen

 Đặc tính riêng:

α – amylase có những đặc tính rất đặc trưng về cơ chế tác động, chuyển hóa tinh bột,khả năng chịu nhiệt:

Thể hiện hoạt tính trong vùng axit yếu: với nấm mốc có pH từ 4.5 – 4.9, nấm sợi có pH

từ 4.0 – 4.8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4 5 – 5.8), vi khuẩn có pH từ 5.9 – 6.1

(pH<3 thì enzyme α – amylase bị vô hoạt trừ enzyme của Asp.Niger có pH 2.5 – 2.8).

α - amylase của nấm mốc có khả năng dextrin hóa cao tạo ra một lượng lớn glucose vàmaltose

Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau: α-amylase của Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis.

Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α - amylase từ các nguồn khác nhau cũngkhông đồng nhất: α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt Nhiệt độ tốithích của nó là 50°C và bị vô hoạt ở 70°C (Kozmina,1991)

Tùy vào mỗi loại và vào các nguồn khác nhau sẽ có thành phần amino acid khác nhau.Xét đặc tính và cơ chế tác dụng của enzyme amylase

 Tính chất vật lí:

 Trọng lương phân tử của α– amylase nấm mốc là: 45.000 – 50.000 D

 Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng

 Protein của các α– amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline

 Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4.2 – 5.7 (Bemfeld P,1951)

 Cấu tạo:

 Mỗi loại α– amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng, α– amylase là mộtprotein giàu tyrosine, trytophan, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid vàaspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme

 α– amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine

 α-amylase là một metaloenzyme Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30 nguyên

tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hìnhthành, ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme và duy trì hoạt động của enzyme Do đó,

Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gâybiến tính và tác động của các enzyme phân giải protein Nếu phân tử α-amylase bịloại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất α-amylasebền với nhiệt độ hơn các enzyme khác

Nhóm 9

Môn UDCNSH trong CNTP GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang

 Một số kim loại như: Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, CO2+, Sn2+, Cr3+ thì không cóảnh hưởng mấy đến α-amylase

1.1.2.3 Cơ chế tác dụng của α-amylaseamylase

α-amylase (1,4-α-glucan-glucanhydrolase ) α-amylase từ các nguồn khác nhau cónhiều điểm rất giống nhau α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4-glucosidenằm ở phía bên trong phần tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, khôngtheo một trật tự nào cả α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạttinh bột nguyên vẹn, song với tốc độ rất chậm

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn

+ Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa):

Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tửthấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bịdịch hóa nhanh)

+ Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa):

Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltosekhông cho màu với iodine Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tớidisaccharide và monosaccharide Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khánhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose Sau đó, các poliglucose này bị phâncách tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đếnmaltotetrose và maltotriose và maltose Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủyphân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose

Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phâncắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù cóchịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19%glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose,maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phântinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose.Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó Vì vậy, người tathường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa

1.2 Nguồn thu nhận enzyme amylase

Mặc dù enzyme amylase có thể được tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như từ thựcvật, động vật và vi sinh vật nhưng thực tế trong sản xuất chế phẩm enzyme, người ta vẫnhay chú trọng đến nguồ gốc thực vật và vi sinh sinh vật vì nó mang lại nhiều lợi ích về kinh

tế cũng như về hiệu quả sản xuất

1.2.1 Thu nhận amylase từ nguồn thực vật

Người ta đã biết cách chiết xuất enzyme amylase từ hạt nảy mầm để sử dụng trongngành công nghiệp chế biên thực phẩm Vd như kẹo mạch nha, bia…khi đó, hạt ngũ cốcđược cho nảy mầm, tách bỏ phần rễ và thân mầm, sấy khô ở nhiệt độ thấp và khi đó ta thuđược malt

1.2.1.1 Malt đại mạch

Các enzyme thủy phân tinh bột trong đại mạch chủ yếu là amylase mà quan trọng là amylase và β-amylase, quá trình nảy mầm của đại mạch là giai đoạn chuyển hóa enzyme từtrạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động, đồng thời tổng hợp thêm hàng loạtcác enzyme mới, giai đoạn này cần chú ý không làm giảm nhiều chất khô của hạt, tạo độthông thoáng bằng cách đảo trộn Hạt đại mạch trước khi ngâm không có hoạt lực củaenzyme α-amylase, khi hạ trải qua 3 - 4 ngày trong giai đoạn nảy mầm thì hoạt lực đạt tớimức cực đại vào ngày thứ 7 và sau đó sẽ giảm xuống

α-1.2.1.2 Lúa

Hệ enzyme trong lúa cũng tương tự như trong hạt đại mạch, trong quá trình nảy mầm,hoạt động các enzyme tăng cao thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp các loại enzyme và quátrình sinh hóa gần giống đại mạch, chỉ khác về mức độ tạo thành enzyme và tốc độ phảnứng

Khi hạt chưa nảy mầm, các enzyme tồn tại ở dạng liên kết Khi hạt nảy mầm, chúng lạichuyển sang hoạt động

1.2.2 Thu nhận amylase từ vi sinh vật

Trong ba nguồn thực vật, đông vật, vi sinh vật thì vi sinh vật được sử dụng nhiềunhất để thu nhận enzyme Cơ bản là do các lí do sau:

 Có thể điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn khác

 Hệ enzyme từ vsv vô cùg phong phú

 Giá thành môi trường nuôi cấy đơn giản và rẻ tiền

 Tốc độ sinh sản rất nhanh

 Dễ kiểm soát quá trình san xuất và mở rộng ở quy mô công nghiệp

Nhóm 9

Môn UDCNSH trong CNTP GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang

1.3 Tổng quan về nguồn giống vi sinh vật

1.3.1 Vai trò của giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme

Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:

 Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy

 Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính enzyme)

 Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất

 Giống VSV còn quyết định đến giá thành sản phẩm

1.3.2 Các giống vi sinh vật sản xuất enzyme Amylase

Ngày nay, do ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật trở thành nguồn thu nhận enzymeamylase chủ đạo Những chủng vi sinh vật tạo nhiều amylase thường được phân lập từ cácnguồn tự nhiên Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả nấm men

và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn

Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, rhizopus

Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces, Endomycopsy,

Endomyces cũng tạo amylase.

Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn amylase như: Bac.polymyxa, Phytomonas

destructans, Cassavanum… các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh và phát

triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít bị nhiễm vi sinh vật khác

Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo amylase mạnh mẽ, tuy nhiên cũng có

một số ít như xạ khuẩn ưa nhiệt Micromonospora vugaris 42 có khả năng tạo một lượng

nhỏ α-amylase hoạt động ở 65°C cùng với protease và các enzyme khác

1.3.3 Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae

Trong tất cả các nhóm vi sinh vật sản sinh ra amylase, người ta đặc biệt quan tâm đến khả

năng tổng hợp enzyme amylase của chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae vì một số ưu điểm

sau:

 Không sinh tổng hợp độc tố

 Tạo ra các hợp hợp chất chính cao

 Thích nghi nhanh , sinh tổng hợp mạnh

 Điều kiện nuôi cấy đơn giản rẻ tiền

 Dễ dàng tách khỏi môi trường nuôi cấy lỏng để thu enzyme ngoại bào

1.3.3.1. Đặc điểm cấu trúc, hình thái của nấm mốc Aspergillus Oryzae

Aspergillus Oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomyctes

(năng khuẩn) Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiềungang 5-7µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngăn, chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm

đa bào) Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đínhbào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính

Hình 1: Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae.

Cuống đính bào tử của Aspergillus Oryzae thường dài 1-2mm nên có thể nhìn

thấy bằng mắt thường Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng Từ bọng nàyphân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai Đầu các tếbào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử Đính

bào tử của Aspergillus Oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau… Bào tử cùng

thành phần môi trường được sấy khô ở nhiệt độ < 50oC cho đến khi độ ẩm <8oC, đưavào bao, hàn kín và bảo quản ở nhiệt độ thường

Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu cả enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào

(amylase, protease, pectinasae,….), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trongcác thùng chứa đựng bột, gạo….đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã

Nhóm 9

Môn UDCNSH trong CNTP GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang

rượu, ở lõi ngô, bã sắn….chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu đen,vàng… màu do các bào tử già có màu sắc Các bào tử này dễ bị gió cuốn bay xa và rơivào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mới

1.3.3.2 Các phương pháp phân lập và bảo quản

1.3.3.2.1 Các phương pháp phân lập

Vi sinh vật phân bố rất rộng trong tự nhiên từ nơi có địa hình bình thường đến nơi

có địa thế phức tạp, đâu đâu cũng có mặt vsv, ở những nơi giàu chất hữu cơ, hay nghèochất hữu cơ, trong không khí, trên bề mặt các vật, trong cơ thể người, động vật, nơi có nhệt

độ rất thấp và hiện diện cả ở nơi có nhệt độ cao VSV có khả năng thích nghi trong trongmọi hoàn cảnh môi trường Chính nhờ khả năng tuyệt vời này mà VSV có khả năng tồn tạingay cả trong hoàn cảnh khắc nghiệt nhất

Thông thường để phâp lập một giống chủng vsv để thu nhận enzyme thì có 3 cáchphân lập:

 Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên

 Phân lập giống trong điều kiện sản xuất

 Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng

Tùy thuộc vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách phân lập chophù hợp Mỗi cách phân lập trên đều cho thấy những ưu điểm riêng biệt Sau đây là một số

ưu điểm:

 Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên

Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi nhanh được thì cần phải

có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme để chuyển hóa nhanh cơ chất có trongmôi trường thành vật chất cung cấp cho tế bào(thích ứng mạnh mẽ) Điều này thì khôngthích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme (ở quy mô sản xuất công nghiệp) với một loạienzyme thật sự mạnh

Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó thường tập trung ởvùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng Dựa vào đặc điểm này chúng ta có thể dễdàng xác định vị trí cần phân lập loại VSV sinh tổng hợp enzyme mà ta cần

Ví dụ: nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp protease cao, ta phải tìmnơi có chứa nhiều protein trong tự nhiên, còn nếu muốn phân lập vsv có khả năng sinh tổnghợp amylase ta cần phải tìm nơi có chứa nhiều tinh bột trong tự nhiên

 Phân lập giống trong điều kiện sản xuất

Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều kiệnsản xuất Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cần qua giai đoạn sản xuất thử, thínghiệm

Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những giống đã đượcchọn lọc hoặc đã qua dại

Mật độ tế bào vi sinh quá trình biến đổi gen và có những đặc điểm sinh hóa hơn cácgiống vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên men, dịch nước thải, chất thải củaquá trình lên men) thường rất cao Do đó, khả năng thu nhận của những chủng có khả năngsinh tổng hợp cao thường rất cao

 Phân lập giống trong môi trường giống đã hư hỏng

Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản Do bị nhiễm, có thể rất nhiều tếbào vi sinh vật giống bị thoái hóa, nhưng cũng còn nhiều tế bào không bị thoái hóa Việcphân lập lại từ nguồn gốc này nhiều khi lại đạt được những kết quả tốt

 Phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae

Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase Ởnấm mốc, nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase này là tinhbột Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có thể mua trực tiếp từ cung cấp nấm mốcgiống Ưu điểm của việc này là giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suất chất lượnggiống được bảo đảm chắc chắn Tuy nhiên, quá trình phân lập giống này có thể cho nhữngkết quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới tại phòng thínghiệm

a Quá trình lấy mẫu: có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát đem

chôn xuống đất Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra, rửa sạchcát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây Sau đó cho vào bao nylon và mang vềphòng thí nghiệm

b Tiền hành thí nghiệm phân lập:

• Nghiền mẫu đối với mẫu khoai tây

• Lấy 10g mẫu đất hay mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước cất vôtrùng sau đó đảo mẫu

• Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyền sang 1 ống nghiệm khác

có chứa 90ml nước cất vô trùng

• Tiếp tục pha loãng ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo

• Hút 0.1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấmmốc phát triển, môi trường PDA (Potato Dextro Agar )

Nhóm 9

Môn UDCNSH trong CNTP GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang

• Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt

c Nhân giống VSV ở bình am giác (quy mô nhỏ)

Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm

Lắc đều cho bào tử hòa trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù

Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môitrường sinh trưởng của nấm

25 – 30oC trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng / phút Sau khi nhân giống thành công

có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ Để có hiệu quả cao cho nấm mốcgiống ta cần có những phương pháp bảo quản thích hợp

1.3.3.2.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

Mục đích của bảo quản giống vi sinh vật dùng trong sản xuất enzyme là đảm bảotính ổn định trong quá trình tổng hợp enzyme và tính ổn định của hoạt tính enzyme Có cácphương pháp để thực hiện quá trình này như sau:

a Cấy truyền và bảo quản lạnh

Phương pháp dựa trên nguyên tắc là vi sinh vật sẽ hạn chế quá trình trao đổi chất trongđiều kiện lạnh ở một khoảng thời gian nhất định Trong thời gian này vi sinh vật có khảnăng bảo tồn được khả năng sinh tổng hợp enzyme

Cách thực hiện: Ống giống vi sinh vật được cấy truyền vào 3-5 ống nghiệm có môitrường tối thiểu Trong đó một ống dùng để kiểm tra, một ống dùng cho sản xuất hoặcnghiên cứu và một ống dùng để bảo quản Có thể làm thêm hai ống để tránh sai sót do thaotác đối với những người mới bắt đầu làm công tác bảo quản giống

Sau khi cấy truyền, ống giống cần được bảo quản ở điểu kiện nhiệt độ lạnh từ 4-7oC.Sau thời gian định kỳ, sẽ phải cấy truyền trở lại, thao tác này được thực hiện liên tục

b Bảo quản giống trong đất hoặc trong cát

Phương pháp dựa trên nguyên tắc: Trong môi trường tối thiểu có độ ẩm thấp, vi sinh vật

có bào tử có thể bảo tồn khả năng sinh tổng hợp enzyme trong thời gian dài

Phương pháp này rất phù hợp và có hiệu quả đối với nấm mốc Asp.oryzae.

Trước khi sử dụng, đất, cát phải được làm sạch và sấy đến độ ẩm < 5% Asp.oryzae

được nuôi cho đến khi tạo bào tử Người ta trộn bào tử với đất hoặc cát đã được làm sạch

và sấy khô Sau đó hỗn hợp này cho vào bao hàn kín và bảo quản ở nhiệt độ thường

c Bảo quản giống trong hạt ngũ cốc

Phương pháp dựa trên nguyên tắc bào tử nấm được giữ trong hạt ngũ cốc đã xử lý nhiệt

có độ ẩm < 8% và giữ được khả năng sinh tổng hợp enzyme trong thời gian dài

Người ta thực hiện bảo quản giống trong hạt ngũ cốc như sau: Giống ống nấm mốcđược nuôi trong môi trường hạt ngũ cốc cho đến khi tạo nhiều bào tử sau đó đem đi xử lýnhiệt

1.3.4 Yêu cầu đối với giống vi sinh vật

Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sảnxuất theo quy mô công nghiệp Do đó, giống VSV ứng dụng trong công nghệ enzyme cầnphải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định Đó là:

 Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn Sản phẩm này phải có sốlượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác Vì trong quá trình trao đổichất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng nghìn lần cơthể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSV cần tổng hợp nhiềuchất Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác Chính vì thế, giống VSV dùng

Nhóm 9

Môn UDCNSH trong CNTP GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang

trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải trội hơn các sản phẩmkhác cả về số lượng và chất lượng

 Giống phải cho năng suất sinh học cao

 Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiệnsản xuất công nghiệp

 Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địaphương nơi nhà máy đang hoạt động

 Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV thuần khiết,

có tốc độ sinh sản nhanh

 Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn, dễ dàng tách sảnphẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV giống

 Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản

Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình lên men côngnghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần khiết

Muốn thu nhận các Enzyme Amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập,

và chọn giống VSV để tuyển lấy những chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải tiến hànhlựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hoá cácđiều kiện nuôi Như vậy sự tổng hợp Enzyme Amylase không những phụ thuộc vào tínhchất di truyền của VSV mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu.Ngoài các yếu tố hoá học (thành phần môi trường) ra, thì các điều kiện lý hoá của quá trìnhnuôi cấy cũng có một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp Enzyme Amylase.Trongcác yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các Enzyme Amylase trong quá trình nuôi VSV,thì thành phần môi trường, tính chất cơ lý của môi trường, độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độthoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường… là những yếu tố cơ bản quan trọng nhất

CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME α-amylase AMYLASE TỪ

ASPERGYLLUS ORYZAE

2.1 Bảo quản giống Aspergyllus oryzae

 Cho cát vào ống nghiệm, tiệt trùng trong autoclave ở 130oC trong 30 phút

 Trộn bào tử vào cát

 Sấy chân không ở nhiệt độ < 40oC (độ ẩm 5%)

 Dùng parafin rắn đun chảy và đổ lên nút bông

 Thời gian bảo quản: 1 năm hoặc hơn

2.2 Nguyên liệu

 Nguồn tinh bột: cám gạo (chứa khoảng 20% tinh bột, 10–15% chất béo, 10-14%protein, 8-16% cellulose, các chất hoà tan không chứa nitơ 37-59%)

2.3.1 Sơ đồ quy trình công nghệ

Sản xuất enzyme amylase bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt: Phương pháp nàyrất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bịtạp nhiễm Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, cáckhuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm Đốivới một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sảnxuất tương), hạt đậu tương (đậu tương lên men- misô) đã được nấu chín trộn hạt cốc cònsống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương)

Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là trấu Cám,trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnhhưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc Tỉ lệ các chất phụ gia phải bảo đảm sao chohàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêmnguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinhtrưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu

Hình 2: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất α-amylase bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt

Nhóm 9

Nguyên liệu

Xử lýThanh trùng

Môn UDCNSH trong CNTP GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang

2.3.2 Thuyết minh quy trình

 Xử lý nguyên liệu

Cám gạo, trấu và mạt cưa được xử lý để loại bỏ các tạp chất Trấu cho vào với tỉ lệ 20-25%

so với khối lượng cám gạo

Sắc ký

Thành phẩm

 Nuôi cấy

Đưa khay lên các giá đỡ

Nhiệt độ phòng nuôi cấy được giữ ở 25-30oC, độ ẩm 60-65%, đồng thời phải thoáng khí

 Thu enzyme thô

Đến khoảng 30-32 giờ sau khi cấy giống, ta thu nhận enzyme thô Cần thu nhận enzymethô vào thời điểm trước khi nấm sinh bào tử vì khi nấm sinh bào tử là lúc quá trình tổnghợp enzyme đã yếu đi Do đó cần một bước nuôi cấy thử nghiệm để xác định thời điểm thunhận enzyme thô Chế phẩm enzyme thô thu được chứa tế bào nấm, cơ chất, nước vàenzyme

và dùng 2lít ethanol cho 1lít enzyme

Môn UDCNSH trong CNTP GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang

2.3.3.2 Nhược điểm

Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy Trong phương pháp này VSVphát triển trên bề mặt môi trường nên cần nhiều diện tích

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của enzyme

2.4.1 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ dinh dưỡng

Nguồn dinh dưỡng Nitơ hết sức quan trọng Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để

nuôi nấm mốc Asp.oryzae để tạo enzym α-amylase, người ta dùng muối vô cơ Natri Nitrat

là nguồn Nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo α- amylase Hàm lượng thườngdùng là 0.91% Natri Nitrat và Amoni Nitrat có hiệu quả hơn so với các muối khác (KaliNitrat, Magie Nitrat, Amoni Sunfat…)

Cho nguồn Nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này

và ức chế tổng hợp amylase khác

Bảng1: Ảnh hưởng của nguồn Nitơ tới sinh tổng hợp các enzyme amylase

ngày nuôi đối với 100ml

muối (% theo N) α-amylase Glucomylase

2.4.2 Ảnh hưởng của amino acid

Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nguồn nitơ vừa là nguồn nănglượng

Một số amino acid riêng rẻ (glutamic acid, aspatic acid ) đóng vai trò vô cùng quantrọng trong trao đổi amino acid, cụ thể là sinh tổng hợp nhiều amino acid khác trong quátrình chuyển amine hóa

Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong nước như:pantotenic acid, biotin, folic acid,… các vitamin này có ý nghĩa sinh học rất lớn Ngoài ra

sự tổng hợp ARN trong tế bào một số vi sinh vật phụ thuộc vào sự có mặt của amino acidtrong môi trường nuôi cấy

Amino acid có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh tổng hợp enzyme.Một số amino acid kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp các enzyme amylase, một sốlại có tác dụng ức chế ngược và một số khác thì không có ảnh hưởng gì cả

2.4.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng

Nhóm 9

Môn UDCNSH trong CNTP GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang

 Mg2+ có ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzyme Thiếu MgSO4 sẽ có ảnh hưởng xấuđến sự tổng hợp mọi amylase bởi nấm sợi khi đó sự tổng hợp α-amylase bị ức chếhoàn toàn Nồng độ tối ưu của muối này cho tổng hợp α- amylase là 0.05%

 Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (nucleicphospholipide acid) và nhiều coenzyme, đồng thời đề phosphoryl hóa glucide trongquá trình oxy hóa sinh học Phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi,

do vậy mà tăng cường tổng hợp enzyme Các muối phospho thường được dùng vớinồng độ cao tới 0.15M Hoạt độ của α-amylase tăng cao khi có 0.1% KH2PO4

 Canxi cần cho tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt độ vì nó là cấu tử không thểthiếu của enzyme này Canxi còn có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác dụng củaprotease Muốn tích lũy nhiều α-amylase cần có lượng Ca trong môi trường là 0.01-0.05%

 Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylase Lưu huỳnh với hàm lượng 0.04g/ml môitrường là sự thích hợp nhất

Ngoài các yếu tố đa lượng cần chú ý tới các yếu tố vi lượng Chẳng hạn: coban, kẽm…

và các yếu tố gây ức chế sự tổng hợp enzyme amylase như: đồng, thủy ngân,…

2.5 Các yếu tối ảnh hưởng đến quá trình lên men

2.5.1 Độ ẩm môi trường

Độ ẩm tốt nhất cho sự hình thành enzyme của nấm mốc Asp.oryzae là 55-60% Độ ẩm

môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử là khoảng 45% nên cần giữ cho độ ẩm môitrường không bị giảm trong quá trình phát triển

Điều cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường ở mức độ tối thích Cần thông khí liên tụctrong suốt thời kì sinh trưởng của nấm mốc và còn phụ thuộc vào kích thước, chiều dày của lớpmôi trường nuôi

2.5.2 Độ ẩm tương đối của không khí

Độ ẩm cho phép từ 80% trở lên đến mức bão hòa tức là 100% W đều thích hợp cho nấmmốc phát triển trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm không khí bão hòa để tránh cho môitrường khỏi bị khô

2.5.3 Ảnh hưởng của thành phần không khí

Asp.oryzae phát triển bình thường khi nồng độ CO2 trong không khí đạt 8%

2.5.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng của chủngnấm mốc này và sự tạo thành các enzyme amylase Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển vàhình thành enzyme là 28-32oC Nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra môi trường có thể nóng lên 40oChoặc hơn Do vậy cần giữ cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới 27 oC và không cao hơn

36 oC

2.5.5 Ảnh hưởng của thời gian nuôi nấm mốc

Hầu hết các chủng nấm mốc Asp.oryzea có hoạt động cực đại của amylase ở khoảng giờ

thứ 30-38, rồi sau đó là cực đại của protease ở giờ thứ 36-42

2.5.6 Ảnh hưởng của pH

pH thích hợp cho Asp.oryzae là môi trường acid yếu khoảng 5,5-6,5.

2.6 Một số thiết bị sử dụng trong quá trình sản xuất amylase

2.6.1 Máy sấy phun sương

Nhóm 9

Môn UDCNSH trong CNTP GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang

 Công dụng: Sấy và tạo hạt từ dung dịch

Hình 3: Máy sấy phun sươngBảng 2: Thông số kỹ thuật của máy sấy phun sương

Thông số kỹ thuật máy phun sương

Hệ số thu hồi chất rắn =>60%

Nhiệt độ sấy (trong buồng sấy) 80 - 90°C

Motor giảm tốc bơm nhu động 40W, tỉ số truyền 1/36, 3pha

Nhóm 9

Motor trục khuấy dịch thùng khuấy Motor khí nén

Tốc độ bơm nhu động Vô cấp 0 - 40 v/phCông suất Motor quạt hút 3HP, 2800v/ph

bị này đã giải quyết đượcnhững vấn đề tồn tại của dạng máy sấy phun ly tâm thông thường.Các hạn chế của mấy sấy khô phun ly tâm tốc độ cao LPG:

 Vật liệu bám trên thành ống năng suất tạo bột thấp

 Vật liệu bám trên thành trong một thời gian dài, gây biến chất

 Khó vệ sinh, không phù hợp với yêu cầu GMP

 Công suất đầu ra thấp: với các máy sấy LPG-150 chỉ có thể cung cấp mức 50 đến

Môn UDCNSH trong CNTP GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang

 Có bộ lọc không khí 3 cấp, lượng khí đưa vào đạt yêu cầu cấp 300.000

 Có bộ phận giải nhiệt vách lò, giữ nhiệt độ vách lò ở mức 80OC, nguyên liệu trongthời gian dừng lại trên vách lò cũng không bị cháy

 Thể tích tổng thể bằng 3.5 lần lò phun ly tâm theo tiêu chuẩn LPG

 Có bộ phận xối rửa mở nhanh, thích hợp với yêu cầu sản xuất nhiều loại sản phẩm

 Phần khử bụi thiết kế khử bụi dạng ẩm, bụi không thoát ra ngoài, phù hợp với yêu cầubảo vệ môi trường

 Có bộ quét không khí cho hiệu quả khiến người sử dụng hài lòng

 Cung cấp 2 bộ phun sương, điều tốc bằng biến tần

 Điều khiển bằng PLC, hệ thống chương trình điều khiển có màn hình hiển thị (lựachọn) Có bộ phận xối rửa

 Dùng không khí khô khép kín

2.6.2 Máy nghiền siêu mịn khí nén

Nhóm 9