quy trình sản xuất pectinase và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm (nước quả)

Ngày nay, cùng với sựphát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học , các chế phẩm enzyme được sản xuất ra ngày càngnhiều và được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực như: công nghệ thực phẩm,

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU

Từ lâu enzyme đã được con người sử dụng một cách phổ biến Ngày nay, cùng với sựphát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học , các chế phẩm enzyme được sản xuất ra ngày càngnhiều và được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực như: công nghệ thực phẩm, nông nghiệp, chănnuôi, y tế,… Vì thế đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm tạo ra nhiều hơn, chiphí giá thành giảm, chất lượng sản phẩm tăng, giảm tác động xấu đến môi trường Cho thấyenzym ngày càng đóng vai trò quan trọng

Enzym pectinase là một nhóm enzym được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệpthực phẩm, đặc biệt có thể kể đến việc sản xuất các loại nước quả như táo, vả, nho, dâu tây, anhđào, phúc bồn tử Dạng enzym cố định được sử dụng rất hiệu quả vì có nhiều ưu điểm hơn hẳndạng enzym thông thường (enzyme hòa tan)

Để tìm hiểu rõ hơn về ứng dụng trong sản xuất nước quả của enzym pectinase cũng như

bổ sung thêm kiếm thức trong chương trình học bộ môn Ứng dụng CNSH trong CNTP nhóm 10

chúng em đã tiến hành thu thập thông tin tài liệu để hoàn thành bài báo cáo này với đề tài “QUY TRÌNH SẢN XUẤT PECTINASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM (NƯỚC QUẢ)” Trong quá trình thực hiện đề tài với hạn chế về mặt thời gian cũng như kiến

thức chuyên môn không tránh khỏi những sai sót, mong cô thông cảm và cho lời khuyên để nhóm có thể tích lũy thêm kinh nghiệm với những đề tài nghiên cứu sau này Xin chân thành cảm ơn cô!

1 Tổng quan

2.1 Định nghĩa enzyme pectinase

Pectin là cơ chất của enzyme pectinase Pectin là polysaccharide dị thể Về bản chất hóahọc, pectin là polygalacturonic nó phân hóa rộng rãi trong các mô thực vật, hòa tan trong dịchthực vật Có nhiều trong các loại rau quả, củ, đặc biệt là trong cùi trắng của bưởi, cam, chanh

Cùi trắng bưởi cam chanh có chứa nhiều pectinase

Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, mạch chính của phân tử do các acidgalacturonic kết hợp với nhau bằng liên kết α-1,4-glucoside tạo nên Petin khác với cáccarbonhydrate thông thường vì thành phần chủ yếu của nó không phải là đường đơn mà là mộtacid còn tên gọi là acid galacturonic

Pectin gồm một mạch chính có thay đổi nhưng tỷ lệ lớn các đơn vị acid D-galacturonic

đã được methyl hóa và được gọi là acid pectic (acid polygalacturonic)

Hai phân tử D-galacturonic acid nối với nhau bằng liên kết glucoside

Pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy các polymer pectin.Sản phẩm tạo thành là acidgalacturonic, galactose, arabinose, methanol…Là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi sauprotease và amylase

Enzyme pectinase có ở thực vật bậc cao và sản phẩm của VSV.Ở thực vật bậc cao cónhiều trong lá, khoai tây, chanh, trong các loại quả thường có enzyme pectinesterase Trong tựnhiên có nhiều trong nấm mốc, vi khuẩn phân giải pectin

Sự phân hủy của pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín Vì vậy enzymepectinase có vai trò rất quan trọng trong quá trình chế biến rau quả và bảo quản trái cây Việckiểm soát enzyme này trong cà chua chuyển gen là một ví dụ điển hình trong ứng dụng RNAchuyển gen đối mã để thao tác biểu hiện gen

Enzyme pectinase được ứng dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả nănglàm trong nước quả.( Việc kiểm soát cũng có thể phụ thuộc vào độ nhớt của sản phẩm)

2.2 Cấu tạo enzyme pectinase

Pectin là polysaccharide dị thể, chủ yếu là một mạch chính gồm các gốc acid –α–D–1,4galacturonic, liên kết với nhau bằng liên kết 1,4–O glucozic còn gọi là acid polygalacturonic hayacid pectic Pectine hòa tan trong tự nhiên là ester metylic của acid pectic

Trong thực tế không phải tất cả các nhóm –COOH ở C6 của đường galactose cũng bịmetyl hóa (tạo ester metylic), mà đôi khi một số nhóm –COOH bị decacboxyl hóa (khử CO2),một số nhóm –COOH thay thế -H bằng kim loại, cũng có lúc giữ nguyên dạng –COO Người tacho rằng protopectine là hợp chất giữa pectine và araban, galactose hay tinh bột Trọng lượngphân tử từ 20.000 – 200.000 đvC.

2.3 Trung tâm hoạt động của enzyme pectinase

Chứa vùng có 8-10 vòng xoắn về phía phải đối với hai vòng tạo thành khe liên kết với cơchất

Trung tâm hoạt động của enzyme này chứa các acid amin aspartate và lysine Có mộtHistidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của enzyme Nhiệt

độ tối ưu của enzyme pectinase khoảng từ 45-550C

2.4 Cơ chế tác động của enzyme pectinase

Trong chế biến nước quả, người ta sử dụng các chế phẩm enzym nhằm hai mục

đích cơ bản

• Phá vỡ thành tế bào thức vật nhằm nâng cao hiệu suất thu nước quả

• Làm trong và ổn định chất lượng nước

Enzym pectinase làm trong nước quả

Phá vỡ thành tế bào Tế bào thực vật được cấu tạo bằng vỏ tế bào (thành tế

bào) Vỏ tế bào như một lớp thành bảo vệ rất hữu hiệu và tạo hình cho tế bào Ở vỏ tế

bào thực vật có nhiều chất pectin, các chất pectin được xem như chất ciment gắn các tế

bào với nhau Phá vỡ sự gắn kết này sẽ tạo điều kiện cho các vật chất trong tế bào

thoát ra khỏi tế bào Các chế phẩm enzym có chứa không chỉ pectinase mà còn chứa

các enzym trong nhóm cellulase Các loại enzym này sẽ làm phá vỡ thành tế bào và

giúp quá trình thu nhận dịch tế bào tốt hơn

Làm trong nước quả Nước quả sau khi được tách khỏi tế bào thường chứa

nhiều chất khác nhau Trong đó chất pectin chiếm lượng đáng kể và pectin thường gây

hiện tượng độ nhớt cao và gây đục nước quả Hàm lượng pectin ở một số loại quả được

trình bày ở bảng sau

Bảng 6:Hàm lượng pectin của một số loại quả và dịch quả

Các chất protein có trong bào tương, màng tế bào và gian bào Pectin chứa

polygalacturonic acid, araban và galactan Trong đó lượng polygalacturonic acid

chiếm tới 40-60% Khi bị thủy phân, pectin tách thành hai phần:

• Phần trung tính – phức chất galactanoraban

• Phần acid – acid pectic

Trong bào tương, pectin nằm ở dạng hòa tan Trong màng tế bào và gian bào,

chúng nằm ở dạng không hòa tan gọi là protopectin Protopectin ở màng gian bào có

chứa lượng kim loại k há lớn và một lượng nhóm metocyl đủ để làm protopectin bền

vững Còn protopectin ở màng tế bào chứa một lượng kim loại không nhiều, có độ

metocyl hóa cao Vì thế, tế bào thực vật có khả năng trương nở tốt

Nếu enzym tham gia phân giải pectin ở gian bào sẽ làm các tế bào khó liên kết

với nhau và thịt quả dễ dàng bị mềm ra Pectin thường có mối liên kết hydro và liên

kết nguyên tử yếu hơn so với cellulose Tham gia phân hủy pectin gồm nhiều loại

enzym

Bảng 7: Các loại enzym pectinase

2.5 Lợi ích của việc sử dụng enzyme pectinase

 Hạn chế trong sử dụng enzyme pectinase

Nước quả được sử dụng enzym có nhiều ưu điểm, tuy nhiên việc sử dụng enzyme cũng

có những nhược điểm như xảy ra những biến đổi bất lợi về VSV

Nếu xử lý trong thời gian ngắn, quá trình oxy hóa và sự nhiễm VSV không thành vấn đềlớn Nhưng nếu xử enzym trong thời gian dài sẽ xảy ra quá trình oxy hoá và sự nhiễm VSV

Người ta ngăn ngừa quá trình oxy hoá trong nước quả bằng một trong ba cách sau:

• Cho ascorbic acid

• Cho anhydric sulfur

• Cho enzym glucose oxidase

Trước khi dùng những chất chống oxy hóa trên, người ta phải đun nóng dịch quả.

Khi đun nóng dịch quả, các enzym có trong nước quả sẽ bị ức chế Theo đó, nước quảđược ly tâm để làm sạch cơ học, sau đó nước quả được đun nóng tới 80OC và sau đó hạ nhiệtđến nhiệt độ tối ưu của họat động enzym Người ta thường cho lượng ascorbic acid tới5mg/100g nước quả để hạn chế quá trình oxy hoá

Để hạn chế sự phát triển của VSV trong tường hợp sử dụng enzym để xử lý nước quả,người ta thường áp dụng những biện pháp sau

Sử dụng sorbic acid, ascorbic acid, benzoate natri Sorbic acid thường được sử dụngtrong nước quả với liều lượng là 0,03% Acid này hoạt động ở pH rất rộng (pH 3,9-9,2) Sorbicacid ức chế sự phát triển của nấm men và nấm sợi, không làm thay đổi vị và mùi của sản phẩm.Benzoate natri thường được sử dụng trong nước quả với liều lượng là 0,15%

Sử dụng anhydric sulfur Người ta thường sử dụng anhydric sunfurơ để bảo quản nướcquả bán thành phẩm Chất này vừa có khả năng tiêu diệt VSV, vừa có khả năng chống oxy hoá.Khi cho chất anhydric sunfurơ vào dịch quả, chúng dễ dàng bị oxy hóa

Khi đó lượng oxy có trong dịch quả ít dần và đến mức triệt tiêu, gây ra trạng thái thế hiệuoxy hóa-khử trong dịch quả thay đổi và VSV sẽ bị ức chế hoặc tiêu diệt Tuy nhiên cần phải lưu

ý rằng, nếu lượng anhydric sunfurơ quá nhiều sẽ dẫn đến ức chế các hoạt động của enzym Cácthí nghiệm cho thấy, nếu hàm lượng anhydric sulfur 0,1% làm giảm hoạt tính của chế phẩmenzym, nếu 0,5% thì enzym hoàn toàn bị ức chế

Xử lý nhiệt Người ta có thể đun nóng dịch quả để bảo quản nước quả Tuy nhiên, việcđun nóng dịch quả không thể quá cao vì chính nhiệt độ sẽ làm thay đổi tính chất cảm quan,thành phần hóa học và hoạt tính enzym

Đa số enzym phân giải pectin bị mất hoạt tính ở 700C và chúng hoạt động mạnh ở

45-500C Tuy nhiên, ở nước quả lên men, người ta sử dụng enzym để xử lý nước quả ngay ở nhiệt

độ thường (trùng với nhiệt độ lên men)

 Hiệu qủa trong sử dụng enzyme pectinase

Đã có nhiều nghiên cứu và kết quả áp dụng trong sản xuất nước quả và rượu vang chothấy khi sử dụng enzym pectinase cho hiệu suất nước quả và chất lượng rượu vang rất cao

Khi tiến hành ứng dụng enzym trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta đặc biệtquan tâm đến hai yếu tố có tính chất quyết định đến hiệu quả enzym

• Nguyên liệu

• Khả năng xay, nghiền và làm nhỏ nguyên liệu

Nguyên liệu Không phải tất cả các loại quả đều cho hiệu suất cao khi xử lý enzym Khi

sử dụng enzym trong chế biến nước quả và rượu vang người ta phải đưa ra độ chín kỹ thuật chophù hợp Khái niệm này hoàn toàn khác với khái niệm độ chín kỹ thuật khi trong công nghệngười ta không sử dụng enzym Độ chín kỹ thuật để sản xuất nước quả là giai đoạn chín củaquả, đảm bảo tách dịch quả được tốt với sự tích tụ tối đa các chất có giá trị dinh dưỡng cao vàhương vị thích hợp

Tuy nhiên cũng cần biết rằng, phần lớn nguyên liệu, hiệu suất dịch quả cao không trùnghợp với sự tích tụ các chất có giá trị dinh dưỡng Ở nhiếu loại quả, khả năng thoát dịch quảkhông trùng với mức độ chín Nhiều khi quả thật chín, khả năng tích tụ chất dinh dưỡng caonhưng lại không thuận lợi cho việc tách nước quả Chính vì thế, từng loại quả, người ta phải tiếnhành phân loại và xác định độ chín kỹ thuât riêng, sao cho phù hợp với việc sử dụng enzym vàthu hồi dịch quả

Công việc thứ hai sau khi phân loại quả, việc nhất thiết phải làm trước khi sử dụngenzym là quả phải được làm sạch bằng cách rửa nhiều lần để loại bỏ những tạp chất, VSV Sau

đó là các quá trình kỹ thuật như xé nhỏ, nghiền, … để tăng khả năng tác động của enzym vàtăng hiệu suất thu dịch quả

Khả năng làm nhỏ nguyên liệu Làm nhỏ nguyên liệu là khâu kỹ thuật rất quan trọng, nóquyết định đến hiệu quả tác động của enzym và hiệu suất thu nhận dịch quả cũng như chất lượngdịch quả

Tùy theo tính chất cơ lý và đặc điểm cấu tạo của từng loại quả người ta chọn nhữngphương pháp xử lý quả thích hợp như nghiền cắt, chà hay xé nhỏ.

Khi thực hiện một trong những phương pháp cơ học trên, một số tế bào bị phá hủy, mấttính chất bán thấm, do đó việc chọn phương pháp cơ học làm nhỏ quả phù hợp với từng loại quảrất có ý nghĩa công nghệ

2 Công nghệ sản xuất

2.1 Nguồn gốc thu nhận

• Từ vi sinh vật : Nếu ở thực vật người ta chỉ thấy có một loại enzyme thì ở vi sinhvật là một loại enzyme rất phong phú.Vi sinh vật phân giải pectine hầu như có mặt ở cácđại diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn như:

 Nấm mốc: Asp niger, Asp oryase, Asp terreus, Asp saito, Asp japonicus…

 Nấm men: Sac ellipsoideus, Sac fragilis, Sac ludwigii …

 Vi khuẩn: Bac polymixa, Bac felseneus, Clostridium roseum…

1.1.1 Từ môi trường nuôi cấy bề mặt

Để chiết rút enzyme từ môi trường rắn người ta dùng nước, các dung dịch muối trungtính, các dung môi hữu cơ (cồn, axeton) Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trongmục đích này có kết quả tốt và dể được dùng rộng rãi trong sản xuất.Theo phương pháp khuếchtán bằng nước có thể chiết được lượng enzyme trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứacác tạp chất không tan Nước thường dung khuếch tán ở nhiệt độ 25 – 280C Để tránh tạp nhiễmnên thêm vào nước một ít focmalin hoăc chất sát trùng khác Dịch chiết thu được có màu nâusẫm, khá trong, chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và được làm lạnh kịp thời xuống 10 – 120C

Phương pháp tách chiết và làm sạch enzyme được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là phươngpháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (etanol, izopropanol và axeton).

Sơ đồ tinh sạch Enzyme từ canh trường nấm mốc.

Các dung môi hữu cơ này làm giảm hằng có điện môi của môi trường Như ta đã biết,lực hút tĩnh điện tỉ lệ nghịch với hằng số điện môi Vì vậy các enzyme, các chất protein cũngnhư các chất có phân tử thấp trong hệ dung dịch nước – dung môi hữu cơ sẽ tủa và lắng xuống

Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch cồn – nước phụ thuộc vào nồng độ cồn, nhiệt độ, lực hút ion của dung dịch và tính chất protein của enzyme Để tránh mất họat tính của enzyme tất cả phải được làm lạnh xuống 3 – 50C Khi trộn phải khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa và lắng xuống dưới cần tách ly ngay

1.1.2 Từ môi trường nuôi cấy bề sâu

• Phương pháp hiếu khí

Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của vi sinh vật gần đạtđến pha ổn định, khi môi trường bị acid hoá mạnh và khi lượng phospho vô cơ được sử dụnghoàn toàn, pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7.2 là thích hợp Đối với nấm mốc, pHkìm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích luỹ enzyme pectinase.Khi pH dịch về phía acid, ngay

cả khi pH nằm trong khoảng 4.5-5.0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sựtạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm

Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng Cô đặc chân khôngcanh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun Điềukiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180 độ C và đi ra đạt 60-70 độ C.Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độchế phẩm sau khi sấy phải không quá 40 độ C Chế phẩm thu được cần phải đóng gói kín đểtránh hút ẩm

• Phương pháp yếm khí

Môi trường: bã củ cải 2%; (NH4)2SO4 0.75%; KH2PO4 0.1%; CaCO3 0.3%; nước chiết

ngô 0.5% Clostridium pectinofermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách mạnh

mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích luỹ sinh khối Sựtích luỹ enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60h, pH ban đầucủa môi trường dinh dưỡng là 6.5-7.0 Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở trạng thái canhtrường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích Quá trình nuôi cấy được tiến hành ởnhiệt độ 350C

Cl felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase Thành phần môi

trường gồm có: lactose 2%; pectin củ cải 1%; (NH4)2SO4 0.4%; K2HPO4 0.7%; KH2PO4 0.3%;NaCl 0.1%; MgSO4 0.025%; FeSO4 dạng vết; CaCO3 0.5%; dịch nấm men tự phân 0.05%;ascorbic acid 0.5%

Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzyme vớidung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfat Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của

dung dịch đã xử lý là 6.5-6.8 Nếu kết tủa bằng 2-2.5 thể tích aceton thì hoạt độ enzyme trongkết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu

Khi kết tủa ammonium sulfat có độ bão hoà bằng 0.2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứapectinesterase và pectintranseliminase, khi độ bão hoà là 0.9-1.0 thì sẽ thu được chế phẩm chỉchứa pectintrenseliminase và exopolygalacturonase

2.2 Tách và làm sạch

Có 2 loại enzyme: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme đòi hỏi phải có phương pháp tách

và thu nhận riêng:

• Enzyme ngoại bào: (gồm pectinase) do vi sinh vật tiết ra trong môi trường nuôi cấy ngoài

tế bào, thường hoà tan trong nước do đó dễ trích ly và tinh sạch

• Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi sinh vật và không được tiết

ra môi trường bên ngoài Những tế bào vi sinh vật sau khi được nuôi cấy sẽ được tách ra vàphá vỡ tế bào Mục đích của việc này là giải phóng toàn bộ các chất có trong tế bào gồm cảenzyme nội bào Hỗn hợp thu được sẽ đem ly tâm tách tạp chất và những chất có phân tửlượng lớn; còn enzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay muối Enzyme sau đó sẽ tinh sạch đượctinhh sạch

Phải phá vỡ thành tế bào Không cần phá vỡ thành tế bào

Thường lẫn chung với các chất khác của tế

bào sau khi bị phá vỡ (acid nucleic, chất

nguyên sinh, lipid…)

Không lẫn chung với các thành phần nội bào, nếu có chỉ là một vài enzyme ngoại bào khác

Chỉ bền vững trong môi trường nội bào Bền vững hơn

Phương pháp tinh sạch khó thực hiện, quy

trình công nghệ phức tạp, giá thành đắt Phương pháp tinh sạch dễ và rẻ hơn

 Vật liệu lọc

Trong phương pháp này, vật ngăn để phân riêng các cấu tử là membrane Áp lực là độnglực duy nhất của quá trình Membrane có thể được sản xuất từ nhiều loại vật liệu khác nhau như:cellulose acetate, polyamide, polysulfone hay ceramic

 Ứng dụng trong nghiên cứu tinh sạch pectinase

Trong lĩnh vực tinh sạch enzyme nói chung, đặc biệt là pectinase, quá trình siêu lọcthường được áp dụng trong giai đoạn đầu của quy trình tinh sạch Mục đích của quá trình là táchnước và các tạp chất có phân tử lượng nhỏ trong canh trường lỏng như các ion kim loại, đườngsót, acid amin, peptide… (dòng permeate) Trong hầu hết các trường hợp, enzyme tinh sạch phảiđược giữ lại trên bề mặt vật liệu lọc (dòng retentate) Vì thế, vật liệu lọc cần phải có kích thướcmao quản nhỏ hơn kích thước enzyme Tuy nhiên, trong một số trường hợp, việc áp dụng kỹthuật siêu lọc không đạt hiệu quả cao do lựa chọn kích thước lỗ màng không thích hợp

1.1.5 Phương pháp sắc ký

Thuật ngữ sắc ký dùng để chỉ các kỹ thuật phân tích và điều chế cho phép tách biệt các