QUI TRÌNH SẢN XUẤT PECTINASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG CNTP (SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ)

QUI TRÌNH SẢN XUẤT PECTINASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG CNTP (SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ)Ngày nay cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, đa số các chủng vi sinh vật dùng trong nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase đều là những chủng đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999; Bai, 2004). Nhiều công trình nghiên cứu đã tiến hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzyme pectinase của các chủng vi sinh vật như: Couri và cộng sự (1995) đã nghiên cứu Sự thao tác gen trên chủng Aspergillus nhằm làm tăng sự sinh tổng hợp các enzyme phân giải pectin hay Solis (1997) đã Cải thiện việc sản xuất pectinase dùng các thể lai giữa các chủng Aspergillus.Qua nghiên cứu tác giả đều nhận thấy nguồn cacbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ gây ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzyme pectinase. Enzyme pectinase được tổng hợp cảm ứng mạnh trên môi trường bổ sung pectin hay acid polygalacturonic và sự tổng hợp này bị hạn chế khi môi trường giàu acid galacturonic hoặc glucose (Asguilar, 1987; Taragano, 1997; Guevara, 1997)Pectin tan trong nước, ammoniac, dung dịch kiềm, carbonat natri và trong glycerin nóng. Độ hòa tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hóa trong phân tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm.Pectin là tên chung được gọi cho các hợp chất chứa các thành phần rất khác, trong đó pectinic acid là thành phẩn chủ yếu. Các pectin tự nhiên định vị trong thành phần của tế bào có thể liên kết với cấu trúc polysaccharide và protein để tạo thành các protopectin không tan. Có thể phân hủy làm tan protopectin trong nước bằng cách nung nóng protopectin trong môi trường acid. Vì thế, các pectin tan thu nhận được là kết quả của sự phân hủy protopectin không tan và chúng không đồng dạng với nhau.Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng: pectin hoà tan, pectic acid và protopectin.Pectin hoà tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin (bị este hóa ở mức độ cao) tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong dung dịch đường có nồng độ 65%. Pectic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl được ester hoá bằng methanol. Các pectin tự nhiên định vị trong thành phần của tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polyssacharide và protein để tạo thành các protopectin không tan. Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hoá học phức tạp. Trong protopectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca2+, Mg2+, các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường. Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải phóng pectin hoà tan.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HỒ CHÍ MINH

DANH SÁCH SINH VIÊN

hợp, soạn P.P

3 Nguyễn Thái Huỳnh Như 2005130030 Ứng dụng trong nước

quả

quả

enzyme pectinase

7 Lý Lương Phương Thảo 2005130024 Tinh sạch enzyme

pectinase

Mục lục

A Giới thiệu:[2] 7

B Tổng quan: 9

I Cơ chất pectin [1] 9

II Pectinase [1], [2] 11

1 Giới thiệu 11

2 Trung tâm hoạt động của pectinase [2] 12

3 Phân loại pectinase: 12

a Pectinesterase (PE):[1] 12

b Polygalacturonase:[1], [2] 16

c Pectate lyase (PEL):[1] 22

d Các loại khác:[1] 24

4 Lợi ích khi sử dụng enzyme pectinase [2] 25

C Qui trình sản xuất enzyme pectinase: 27

I Nuôi cấy bề sâu 27

1 Khái niệm [3] 27

2 Phân loại 28

a Phương pháp hiếu khí [1] 28

b Phương pháp yếm khí [1] 29

c Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzyme: [1] 30

3 Các yếu tố ảnh hưởng: 30

a Thành phần môi trường 30

b Ảnh hưởng của chất cảm ứng và nguồn cacbon: 31

c Ảnh hưởng của nguồn nitơ: 31

d Tỉ lệ giống cấy 31

e Nhiệt độ nuôi cấy 32

f pH môi trường 32

g Độ ẩm môi trường 32

h Sự sục khí và khuấy trộn 33

i Thời gian nuôi cấy 33

4 Quy trình công nghệ: 34

a Nhân giống 35

b Tiệt trùng môi trường 36

c Lên men 36

d LY TÂM 40

e TÁCH VÀ TINH SẠCH ENZYME 40

f SẤY 41

II Lên men bề mặt: 42

1 Giới thiệu:[3] 42

2 Môi trường: [4] 42

3 Giống: [4] 43

4 Quy trình thu nhận enzyme pectinase bề mặt: [4] 44

5 Quá trình nuôi cấy:[4] 45

a Giai đoạn 1: Từ 10-14h: 45

b Giai đoạn 2: Kéo dài 14- 18h: 45

c Giai đoạn 3: Kéo dài từ 10 – 20h: 45

6 Thiết bị nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường rắn: [3] 46

a Dây chuyền tự động hóa để nuôi cấy giống nấm mốc:[3] 47

b Thiết bị dạng tháp:[3] 49

7 Thu nhận enzyme: 50

a Sử dụng nước: 50

b Sử dụng dung môi hữu cơ: 50

III Xác định hoạt độ enzyme: [4] 53

a Phương pháp nhớt kế 53

b Phương pháp đông chung(Cu-pectat) 53

c Phương pháp so màu: 53

IV Tinh sạch enzyme 54

1 Khái niệm: 54

Các phương pháp tinh sạch enzyme pectinase: [5], [6] 54

a Phương pháp thẩm tích: 54

b Phương pháp lọc gel sephadex: 55

c Phương pháp siêu lọc: 56

d Phương pháp sắc ký trao đổi ion: 56

e Phương pháp kết tủa bằng muối trung tính: 57

f Phương pháp kết tủa bằng dung môi: 58

D ỨNG DỤNG PECTINASE TRONG SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ [1] 60

I Chế phẩm enzyme 60

1 Giới thiệu 60

2 Mục đích 60

3 Các loại chế phẩm enzyme 61

4 Phân loại 62

II Ứng dụng chế phẩm trong sản xuất nước quả 63

1 Giới thiệu 63

2 Hiệu quả cả việc sử dụng enzyme pectinase trong sản xuất nước quả: 64

3 Ứng dụng 66

a Sử dụng enzym để sản xuất nước quả thanh trùng uống trực tiếp từ quả táo và quả vải 66

b Sản xuất nước quả uống ngay từ dâu tây, anh đào và phúc bồn tử: 67

c Sản xuất nước quả từ nho 68

d Sản xuất nước mận 72

e Một số ứng dụng khác 72

4 Những bất lợi khi xử lý bằng enzyme: 72

E Tài liệu tham khảo 74

Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử người ta đã đẩy mạnh nghiêncứu việc tạo dòng và biểu hiện gen của enzyme pectinase trong các tế bào chủ khácnhau (Whitehead, 1995; Surgey, 1996; Dalbogre, 1997; Yakoby, 2000) Tuy nhiên,

tế bào chủ được sử dụng nhiều nhất vẫn là Saccharomyces (Gognies, 1999;Gognies, 2001)

Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân các chất pectin, sản phẩmtạo thành là acid galacturonic, galactose, methanol,… Đây là nhóm enzyme thứ bađược ứng dụng rộng rãi sau amylase và protease

Enzyme pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao và vi sinh vật Ở thựcvật bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, cỏ ba

lá Trong các loại cỏ khác thường chỉ có enzyme pectinesterase

Nhiệt độ tối ưu của enzyme pectinase thường khoảng 45-55oC

Việc ghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng enzyme pectinase được tiến hành

nhiều trên đối tượng khác nhau như Fusarium oxysporum (Guevara, 1997),

Aspergillus japonicus (Maria, 2000), Botrytis cinerea (Wubben, 2000), Rhizopus stolonifer (Blandino, 2001), Aspergillus awamori (Blandino, 2001)…Tuy nhiên

đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất vẫn là Aspergillus niger (Aguillar, 1987;

Maldonado, 1989; Solis-Percira, 1993; Taragano, 1997; Caltisho, 2000)

Ngày nay cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, đa

số các chủng vi sinh vật dùng trong nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase đều lànhững chủng đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999; Bai, 2004) Nhiều công trìnhnghiên cứu đã tiến hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzyme pectinase của cácchủng vi sinh vật như: Couri và cộng sự (1995) đã nghiên cứu "Sự thao tác gen

trên chủng Aspergillus nhằm làm tăng sự sinh tổng hợp các enzyme phân giải

pectin "hay Solis (1997) đã "Cải thiện việc sản xuất pectinase dùng các thể lai giữa

các chủng Aspergillus".

Qua nghiên cứu tác giả đều nhận thấy nguồn cacbon bổ sung vào môi trườngnuôi cấy khác nhau sẽ gây ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzymepectinase Enzyme pectinase được tổng hợp cảm ứng mạnh trên môi trường bổsung pectin hay acid polygalacturonic và sự tổng hợp này bị hạn chế khi môitrường giàu acid galacturonic hoặc glucose (Asguilar, 1987; Taragano, 1997;Guevara, 1997)

Theo thời gian nguồn cacbon sử dụng trong nuôi cấy nghiên cứu sự tổng hợpcảm ứng enzyme pectinase cũng thay đổi Vào nhưng năm 90 các tác giả chủ yếu

sử dụng các nguồn cacbon tinh khiết và bổ sung riêng lẻ từng nguồn cacbon vàomôi trường nuôi cấy (Aguillar, 1987; Leone; 1987) Năm 2000, trong công trìnhnghiên cứu "Ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đến sự sinh tổng hợp

pectinase của Aspergillus japonicus 586", Maria và cộng sự đã kết hợp nhiều

nguồn cacbon vào cùng một môi trường nuôi cấy như: pectin và glucose, pectin vàglycerol,…gần đây các nghiên cứu đều hướng tới sử dụng các phế liệu, các chấtthải công nông nghiệp để làm nguồn cơ chất sinh tổng hợp cảm ứng enzyme

pectinase (Castilho, 2000; Blandino, 2001; Denis, 2002).

9Pectin trong thực vật

Pectin tan trong nước, ammoniac, dung dịch kiềm, carbonat natri và trongglycerin nóng Độ hòa tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hóatrong phân tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm.

Pectin là tên chung được gọi cho các hợp chất chứa các thành phần rất khác,trong đó pectinic acid là thành phẩn chủ yếu Các pectin tự nhiên định vị trongthành phần của tế bào có thể liên kết với cấu trúc polysaccharide và protein để tạothành các protopectin không tan Có thể phân hủy làm tan protopectin trong nướcbằng cách nung nóng protopectin trong môi trường acid Vì thế, các pectin tan thunhận được là kết quả của sự phân hủy protopectin không tan và chúng không đồngdạng với nhau

Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng: pectin hoà tan, pectic acid vàprotopectin

Pectin hoà tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin (bị este hóa

ở mức độ cao) tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong dung dịch đường có nồng

Ca2+, Mg2+, các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường Protopectin khi bị thủyphân bằng acid thì giải phóng pectin hoà tan

Khi quả chín dần, dưới tác dụng enzyme protopectinase, protopectin sẽchuyển sang pectin hòa tan làm giảm sự liên kết giữa các tế bào, quả trở nên mềm

hơn Quá trình này cũng xảy ra dưới tác dụng của acid và nhiệt độ trong quá trình

Việc kiểm soát hoạt động của enzyme pectinase cũng có thể kiểm soát được

2 Trung tâm hoạt động của pectinase [2]

Enzyme pectinase chứa vùng có 8 – 10 vòng xoắn kép về phía phải với 2 vòngtạo thành khe liên kết với cơ chất

Trung tâm hoạt động của enzyme này chứa axit amin Aspartate và Lysine Có 1Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả năng xúc tác củaenzyme

Nhiệt độ tối ưu của enzyme pectinase khoảng từ 45 – 550C

3 Phân loại pectinase:

Enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng:

a Pectinesterase (PE):[1]

PE xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester Enzyme thường tấncông vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị không bịester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự

do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol

Cấu trúc của enzyme Pectinase

Phương trình phản ứng:

Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khácnhau Nếu thu từ nguồn vi sinh vật thì pH tối ưu từ 4,5-5,5, còn nếu từ nguồn thựcvật thì có pH tối ưu từ 5,0-8,5 Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30-

40oC và bị vô hoạt ở 55-62oC Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion

Ca2+ và Mg2+

Đặc điểm của Pectineaterase thực vật

Bên cạnh các Pectineaterase (PE) vi sinh vật, hầu hết các loại trái cây đềuchứa enzyme PE Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằmtrong phần vỏ tế bào PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pHhơi kiềm Các cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca2+ chẳng hạn, có khuynhhướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme

Cà chua chứa ít nhất 2 loại PE Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầucủa quá trình chín Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giảm xuống,nhưng PE2 tích lũy dần cho đến khi trái cây có màu đặc trưng của trái chín PE2 cókhối lượng phân tử 23kD, pH tối ưu 7.6 Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút

đun ở 670C Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở cácnồng độ 0.005M và 0.05 M, theo thứ tự.33

PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối ưu tại

pH gần 8 Polygalacturonic acid, là sản phẩm được hình thành do quá trình đểmethyl hoá các phân tử galacturonic acid

Trong thịt quả chuối có hai isoenzyme PE Cả hai có cùng khối lượng phân

tử là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3 Các enzyme này hoạtđộng ở pH tối đa là 7,5 Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dịch NaCl ởnồng độ 0,2M, và đưa pH của dung dịch về 6,0 Các enzyme này bị ức chế bởinhiều loại polyol có khối lượng phân tử thấp, như glycerol, sucrose, glucose,maltose và galactose

PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khốilượng phân tử 36 kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và ≥11,0, theothứ tự pH tối ưu của PE1 là 7,6, còn của PE2 là 8,0

Trong thành phần của nhiều thịt quả khác cũng chứa hai isoenzyem, mộttrong hai enzyme này có tính bền nhiệt hơn, còn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơnkhi bị tác động của protease Độ ổn định của enzyme có thể liên quan đến mức độglycosyl hoá của các phân tử enzyme Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme còn lại có

Cấu trúc của pectinesterase từ carrot

Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme Các isoenzyme của kiwi cócùng khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3 Tuy nhiên, chúngkhác nhau về mức độ bền nhiệt.

Trình tự amino acid

Cấu trúc bậc một của PE cà chua chứa 305 amino acid với khối lượng phân

tử là 33239 Enzyme này có chứa 2 đầu nối disulfide (Cys98-Cys125 và Cys200) Cys166 có mặt trong tất cả các enzyme pectinesterase Trình tự aminoacid được suy luận trên cơ sở các nucleotide cDNA cho thấy sự không nhất quán,

Cys166-18 trong 27 vị trí khác nhau, có thể làm thay đổi điện tích của protein Mặt khác,chỉ có khoảng 94% trình tự amino acid trong một phần chuỗi amino acid có tínhđồng dạng với toàn bộ trình tự của cDNA Sự không nhất quán này có thể phảnánh sự tồn tại của các isoenzyme, mặc dù chỉ có hai isoenzyme trong cà chua đượcbiết đến Một số gen mã hoá cho các enzyme PE đã được tách dòng và nghiên cứuđặc điểm Gen tách dòng từ Pseudomonas mã hoá cho PE có chứa 396 amino acidvới khối lượng phân tử là 41004

Cơ chế để methyl hóa

PE loại bỏ các nhóm methoxyl trong phân tử pectin bằng tương tác ái nhâncủa enzyme lên ester, làm hình thành hợp chất trung gian acyl-enzyme và phóngthích methanol Tiếp theo sau là phản ứng deacyl hoá, là phản ứng thủy phân củahợp chất trung gian acyl-enzyme, để giải phóng enzyme và carboxylic acid

15

Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứng theo kiểu làm hình thành các khốipectin chứa các nhóm carboxylate dọc theo mạch pectin Enzyme của Trichodermareesei là một protein cơ bản cho kiểu phản ứng tương tự Enzyme của các loàiAsperillus với pH tối đa trong vùng acid, xúc tác phản ứng từ bên trong.

Ảnh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme pectinesterase có thể

có liên quan đến tương tác của nó với cơ chất Polygalacturonic acid là một chất ứcchế cạnh tranh trong phản ứng thủy phân nhờ sự xúc tác của PE Pectin chứa cácnhóm cacboxylate được sắp xếp như hình khối có thể tác dụng theo cách tương tự

Sự liên kết của các ion kim loại vào các nhóm carboxylate trong trường hợp này cókhuynh hướng trung hoà ảnh hưởng ức chế của cơ chất pectin lên enzyme Tuynhiên, lượng dư các ion này trên thực tế gây ra sự bất hoạt của PE vì các ion kimloại bị vây quanh bởi các nhóm carboxylate nằm kế cận với các liên kết ester cầnthiết cho phản ứng thủy phân xảy ra

b Polygalacturonase:[1], [2]

Cấu tạo

Polygalacturonase: còn có tên gọi là poly-1,4-galacturoniglucanohydrolase,xúc tác sự phân cắt các mối liên kết α–1,4-glycosid Các exo-PG (exo-poly 1,4-α-D-galacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ các đầu không khử, và endo-

PG (endo-poly1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, tấn công ngẫu nhiên vàogiữa mạch cơ chất.

Đặc điểm

Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhưng có chủ yếu ở một số nấm mốc

và vi khuẩn Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử vàthường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tácdụng với cơ chất, enzym polygalacturonase được chia làm bốn loại:

Polymethylgalacturonase hay còn gọi là methylesglucanohydrolase, tác dụng trên polygalactorunic acid đã được methoxylhoá (tức là pectin) Enzyme này lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vàokhả năng phân cắt ở trong hay cuối mạch trong phân tử pectin, đó là endo-glucosidase-polymethyl galacturonase kiểu I và exo-glucosidase-polymethylgalaturonase kiểu III

Polygalacturonase, enzyme tác dụng trên pectic acid hoặc pectinic, cũngđược chia thành hai nhóm nhỏ là endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II vàexo-glucosidase-polygalacturonase kiểu IV Enzyme endo-glucosidase-Polymethyl-galacturonase kiểu I là enzyme polymethylgalacturonase dịch hoápectin có mức độ methyl hoá càng cao thì bị thủy phân bởi enzyme này càng nhanh

và càng có hiệu quả Trong dung dịch, khi có mặt của enzyme pectinesterase thìhoạt độ của enzyme này thường bị giảm Enzyme này rất phổ biến trong các VSV,đặc biệt là A niger, A awamori

Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn VSV PG thườngđược tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh,chẳng hạn như Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger, Lactobacillus plantarum,Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, các loài Ascomycete, Phizopus

arrchizus, và Fusarium osyporum Tuy nhiên, trong thực tế, PG của thực vật bậc

cao được nghiên cứu rất nhiều ở cà chua chín là nấm mốc A niger, A awamori.

 Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin.

 Endo-PG: còn gọi là poly(1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, xúc tác

thuỷ phân ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid trong phân tử acid pectic

[2]

Cơ chế hoạt động của Endo-polymethylgalacturonase (Endo-PMG)

Cơ chế hoạt động của Endo-polymethylgalacturonase (Endo-PMG)

Các enzyme trong cà chua chín

Các enzyme PG trong cà chua chín tồn tại dưới hai dạng, và cả hai đều làendo-enzyme PG1 có khối lượng phân tử 84kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ởnhiệt độ 78oC PG2 có khối lượng phân tử 44kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở

57oC PG1 có độ ổn định tối đa ở pH 4,3, trái lại PG2 ổn định tối đa ở pH 5,6 Sựphân tích sử dụng SDS-PAGE cho rằng PG1 là một dimer của PG2, tuy nhiên cácnghiên cứu khác lại cho rằng PG1 hình thành là do sự kết hợp của PG2 với mộtsubunit Các chuỗi polypeptide của PG đều bị glycosyl hoá PG2 chứa 4,6 đườngtrung tính (D-mannose, L-gucose, D-xylose) liên kết với nhau thông qua cầu nốiN-acetylglucosaminylasparaginyl Có sự khác nhau chút ít về khối lượng phân tử,chẳng hạn các isoenzyme của PG2, PG2A va PG2B có khối lượng phân tử tươngứng là 43 và 46kD Sự khác nhau này có thể là do quá trình sửa sai hoặc quá trìnhglycosyl hoá sau dịch mã Trong thực tế, các nghiên cứu sau đó cũng đã chứngminh được rằng PG2A và PG2B là các dạng glycosyl hoá khác nhau của cùng cácpolypeptide

Trình tự amino acid

Các trình tự amino acid được suy luận trên cơ sở các nucleotic của cDNAphân lập không những từ trái cà chua mà còn từ phấn của các loài Pseudomonassolanacearum, Oenothera organesis, phấn hoa bắp, và từ trái bơ Gen của PG2 phânlập từ trái cà chua mã hoá cho protein hoàn chỉnh có 373 amino acid, với khốilượng phân tử là 40 279 Enzyme này được tổng hợp từ một tiền chất, sau đó điqua quá trình sửa chửa sau dịch mã, gồm cả các quá trình loại bỏ các peptide tínhiệu, bị glycosyl hoá tại bốn điểm có khả năng glycosyl, và sửa chữa ở đầu C cuối.Các gen PG đơn mã hoá cho các loại isoenzyme khác nhau, dẫn đến kết luận rằng

PG1 và PG2 đều xuất phát từ cùng một chuỗi polypeptide, và rằng PG1 được tạothành nhờ sự kết hợp của PG2 với β-subunit.

β-subunit Sự chuyển đổi PG2 và PG1 trong quá trình chín của cà chua làmột vấn đề gây được nhiều chú ý β-subunit, một yếu tố bền nhiệt, đầu tiên đượcphân lập từ cà chua xanh, có khả năng chuyển đổi PG2 thành PG1 trong ốngnghiệm Yếu tố này sau đó được xác minh là một glycoprotein rất đặc trưng vớipolypeptide PG về mặt miễn dịch Phân tử PG1 được tạo thành từ một phân tử PG2

và một phân tử β-subunit; tuy nhiên, chỉ có polypeptide PG có hoạt tính enzyme

cDNA mã hoá cho β–subunit có trong cà chua là một tiền chất có kích thướcphân tử lớn (69kD, 630 amino acid) Trong phân tử này, thêm vào phân tử proteinhoàn chỉnh là một trình tự tín hiệu kị nước (30 amino acid), một polypeptide chứađầu cuối N-(78 amino acid), và một tiền peptide chứa đầu cuối C-(233 amino acid).Protein hoàn chỉnh chứa glycosyl hoá là chứa 289 amino acid nặng 31,5 kD, điểmđẳng điện 4,9 Protein này chứa lượng lớn amino acid gly, tyr, phe, và một motiflặp có cấu trúc liên ứng FTNYGxxGNGGxxx, trong đó “x” phần lớn là các aminoacid phân cực Chức năng của motif này trong protein vẫn chưa được biết rõ

Vai trò của PG trong quá trình làm chín trái cây

Hoạt độ của enzyme trong giai đoạn đầu của quá trình làm chín chủ yếu lànhờ PG1 PG1 tiếp tục tăng trong quá trình chín, và có mặt trong tất cả các giaiđoạn của quá trình chín PG2 có khối lượng phân tử thấp hơn và ít bền nhiệt, PG2xuất hiện trong giai đoạn cuối của quá trình, và chiếm lượng lớn trong giai đoạnchín Sự xuất hiện kế tiếp nhau của hai enzyme này là kết quả của hoạt động điềuhoà của β–subunit, yếu tố này được tìm thấy với lượng ít trong cà chua xanh, sau

đó tăng lên trong giai đoạn chín

PG2 được coi như một endo-enzyme trong cà chua chín, PG1 được hìnhthành trong suốt quá trình chín khi β–subunit được sinh ra để phản ứng với PG2.Bằng cách điều chỉnh những thay đổi trong các phân tử PG trong các dịch chiếtkhác nhau có các nồng độ khác nhau của NaCl và pH đệm khác nhau Trên thực tếgen mã hoá cho polypeptide PG trong một số nghiên cứu trước đây đã chứng minhđiều này Gần đây, các nghiên cứu về các kiểu biểu hiện gen của β–subunit và cácphân tử PG cho thấy mRNA của β–subunit xuất hiện sớm trong quá trình phát triểncủa trái cây(10 ngày sau khi thụ phấn) và tăng đến mức tối đa trong 30 ngày, cũng

là lúc trái cây chín Sau đó, lượng mRNA của β-subunit giảm nhanh chóng, trongkhi lượng mRNA của PG tăng một cách đáng kể

Vì tất cả các kết quả nghiên cứu đạt được ở trên, ta có thể cho rằng enzyme PG2 được hình thành trong các giai đoạn sớm của quá trình chín phải đượcchuyển về PG1 do sự có mặt của β–subunit Sự tích lũy của PG2 trong các giaiđoạn sau của quá trình chín là do β–subunit bị cạn kiệt Vai trò của quá trìnhchuyển đổi này là nhằm điều hoà hoạt động của PG trong các giai đoạn của quátrình chín β–subunit phản ứng và neo phân tử PG2 vào thành tế bào, tạo ra phân tửPG1 dưới dạng hoạt động để phân hủy pectin Một số nghiên cứu khác cũng chứngminh được rằng PG1, chứ không phải PG2 có chức năng trong việc làm phân huỷ

endo-và ổn định polyuronide, có nghĩa là sự phân hủy của polyuronide dưới tác độngcủa enzyme PG là nguyên nhân dẫn đến quá trình mềm của cà chua.Tuy nhiên, khinghiên cứu về sự xen đoạn và biểu hiện của gen PG trong cà chua chuyển gen thìkết quả cho thấy polyuronide bị phân hủy nhưng không làm cho trái cà chua mềmđi

Cơ chế và kiểu tác dụng

Exo-PG thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic, tạo ragalacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm ưu thế Sự thủy phân polymer này

bị gián đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất Mức độ thuỷ phântăng tỉ lệ với kích thước cơ chất, đạt tối đa với mức polymer hoá 20 đối với cácexo-PG ở cà rốt và đào Hoạt động của các exo-enzyme làm tăng nhanh sự tạothành các nhóm khử và làm tăng chậm độ nhớt của dung dịch cơ chất Sự phân hủypolyuronide trong quá trình chín không gây ra sự tích lũy galacturonic acid, và chỉ

có endo-enzyme PG là có liên quan

Các endo-PG phân hủy pectic acid từ bên trong mạch, làm giảm nhanh độnhớt của dung dịch cơ chất Tính đặc hiệu và kiểu tác dụng của endo-enzyme đượcxác định bởi trạng thái của điểm hoạt động Mức độ thủy phân của endo-PG ở nấmmen giảm cùng với sự giảm độ dài mạch cơ chất Vị trí liên kết của endo-PG ởAspergillus niger được cấu thành từ 4 điểm và sự phân cắt xảy ra giữa các điểm 1

và 2 Một cơ chất tetramer chịu sự phân cắt (3+1) thành trigalacturonic acidgalacturonic Một cơ chất pentamer cho ra hai sản phẩm phức tạp hơn, cả hai đềuđáp ứng sự chiếm giữ hoàn toàn của 4 điểm liên kết, tạo sự phân cắt (4+1) và(3+2) Cũng tương tự, đối với cơ chất là hexagalacturonic acid, sản phẩm sẽ tạothành lối phân cắt (5+1), (4+2) và (3+3) Trigalacturonic acid bám vào điểm hoạtđộng để tạo thành các phức hợp hữu ích hoặc không hữu ích Liên kết hữu íchtrong trường hợp này làm sinh ra sự phân cắt (2+1) Liên kết không hữu ích đượctạo thành khi ba đơn vị đơn lẽ bám vào ba điểm 2, 3 và 4 là không hề tương tác vớicác nhóm xúc tác định vị bên trong điểm 1 và 2 Cơ chất trong trường hợp nàyđóng vai trò là một chất ức chế cạnh tranh (K = 0,67mM)

c Pectate lyase (PEL):[1]

PEL xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị ester hoá Cả haienzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4-α-D-galac turonide) lyase) và endo-PEL (endo-poly(1,4-α-D-galacturonic lyase) đều tồn tại Pectate và pectin có lượng methoxylTác động phân hủy của Polygalacturonase

thấp là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzyme này Nói chung, cả haienzyme này đều có khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+

để hoạt động Pectate lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vikhuẩn và nấm Các enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọngtrong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làmmềm và làm mục mô thực vật

Pectate lyase (PEL) là các enzyme VSV ngoại bào Các enzyme của giốngErwina và Bacillus được biết đến là tác nhân gây ra triệu chứng soft-rod ở thực vật.Tuy nhiên, chúng cũng được tìm thấy phổ biến ở Aeromonas, Pseudomonas,Xanthomonas, Aspergillus và Fusarium

Erwinia chrysanthemi sinh ra các enzyme pectate lyase ở dạng isoenzyme cóthể được phân thành các nhóm trên cơ sở điểm đẳng điện của chúng: acid (pH 4-5),trung hoà (pH 7-8,5) và kiềm (pH 9-10) Số lượng các isoenzyme trong mỗi nhóm

Cơ chế hoạt động của enzyme Lyase phân cắt pectin

có thể thay đổi tùy theo loài Đa số các loài được nghiên cứu cho năm hay ít nhấtbốn isoenzyme: một acid (PELA), hai trung hoà (PELA và C), hai kiềm (PELD vàE) Tất cả các isoenzyme này đều cần Ca2+ để làm tăng độ hoạt động và có pH tối

ưu 8-10 Các nghiên cứu trên chủng EC16 cho thấy rằng tất cả 4 isoenzyme trênđều là endo-enzyme (PELA(pI 4,2), PELA (pI 8,8), PELC (pI 9,0), và PELD (pI10,0)) Các PEL kiềm rất đặc hiệu trong việc gây ra sự giầm nước của các mô thựcvật, tiếp theo là các isoenzyme trung hoà, trái lại các PEL acid không gây ảnhhưởng gì

Ở các chủng Erwinia carotovara, có ít nhất ba PEL được tiết ra, tất cả đều cóđiểm đẳng điện ở pH kiềm: PELI (pI 9,7), PELII (pI 10,2), và PELIII (pI 10,35)

Cả ba isoenzyme này đều có pH tối ưu là 9,0 Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động củaPELII và PELIII là 50 và 60oC, theo thứ tự PELI có độ bền nhiệt thấp Ở chủngGIR726, có bốn loại endo-PEL isoenzyme với các điểm đẳng điện ở các pH rấtkiềm (10,0, 10,6, 10,3 và 10,9) và khối lượng phân tử nằm trong khoảng từ 28-33

kD pH tối ưu cho hoạt động là 9,3 cho PELII 9,5 cho PELIV và 9,7 cho PEL I vàIII Cũng như với các PEL từ các nguồn khác, những isoenzyme này được kíchhoạt bởi Ca2+ Hoạt độ enzyme tăng 50-70% khi có mặt của Ca2+ ồng độ 0,5mM.Isoenzyme với pI>10 chứa 2,5-4.8% đường trung tính Các PEL từ một số loàiBacillus cũng có khả năng gây ra sự giảm nước ở mô thực vật

4 Lợi ích khi sử dụng enzyme pectinase [2]

Từ khi phát hiện ra enzym và khả năng chuyển hóa của enzym loài người đãtăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzym trong công nghiệp Số lượngenzym phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzym được ứng dụng vào côngnghiệp cũng ngày càng nhiều

Trong sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng các chế phẩm pectinasedưới dạng tinh khiết Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng canh trường nấmmốc sấy khô Tỉ lưởng chế phẩm pectinase cô đặc trên lượng nguyên liệu đem chếbiến vào khoảng từ 0.03 – 0.05 đến 0.10%

Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiếp thực phẩm sau:

 Sản xuất rượu vang

 Sản xuất nước quả và nước uống không có cồn;

 Sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt nhừ, mứt đông,

 Sản xuất nước giải khát

 Sản xuất cà phê và cà phê hòa tan

Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các nướcuống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách rất hiệu quả Nhờ tácdụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và lọc dịch quả rất dễ dàng, do

đó làm tăng hiệu suất sản phẩm Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền quả, sẽlàm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép lên tới 15 – 25% Bởi lẽ khi có pectin thìkhối quả nghiền sẽ có trạng thái keo, do đó khi ép dịch quả không thoát ra được.Nhờ pectinase phân giải các cơ chất pectin, làm các chất chiết trong dịch bào dễthoát ra ngoài hơn, làm tăng hiệu suất chất chiết, hơn nữa dịch quả trong suốtkhông bị vẩn đục và lọc rất dễ dàng Không những vậy, enzym pectinase còn gópphần chiết rút được các chất màu, tanin và những chất hòa tan nữa, do đó làm tăngthêm chất lượng của thành phẩm

C.Qui trình sản xuất enzyme pectinase:

I Nuôi cấy bề sâu

1 Khái niệm [3]

Lên men chìm là phương pháp được phổ biến nhất trong quy trình lên mencông nghiệp, vì có thể kiểm soát được toàn bộ các khâu trong quá trinh một cách

dễ dàng Thường sử dụng môi trường lỏng thực hiện trong thùng lên men trong đó

có lắp đặt các hệ thống điều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, điều chỉnh

pH, nồng độ chất dinh dưỡng

Phương pháp này dùng được cho cả vi sinh vật hiếu khí và kị khí Đối vớinuôi vi sinh vật kị khí trong quá trình nuôi không cần sục khí chỉ thỉnh thoảngkhuấy trộn còn với vi sinh vật iếu khí phải sục khí liên tục

Ưu điểm:

Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyền

Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho một đơn vị sản phẩmthấp

Dễ tổ chức được xí nghiệp có sản lượng lớn

Các thiết bị lên men chìm đễ cơ khí, tự động hóa

Lượng cơ chất sót thấp nhờ đó tiết kiệm chi phí sản xuất

Ít sinh ra các enzyme tạp nên giảm bớt chi phí cho quá trình tinh sạch

Nhược điểm:

Đời hỏi trang bị kĩ thuật cao, dễ nhiếm trùng toàn bộ

Phải sục khí liên tục vì vi sinh vật chỉ sử dụng được oxy hòa tan trong môitrường

5 Phân loại

a Phương pháp hiếu khí [1]

Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của visinh vật gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hoá mạnh và khi lượngphospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn, pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ6-7.2 là thích hợp

Đối với nấm mốc, pH kìm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích luỹ enzymepectinase Khi pH dịch về phía acid, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4.5-5.0, tuy

sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bịkìm hãm

Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48h tuổi và với hàm lượng từ

2-10% Đối với A.niger và A.awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ

trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử, thời gian ủ sơ

bộ thường là 38-42h Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2% Trong quá trìnhnuôi cấy, hàm lượng các chất hoà tan trong môi trường giảm từ 6% xuống còn 1.5-1.8%

Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng Cô đặc chânkhông canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trênthiết bị sấy phun Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180oC và đi ra đạt 60-70oC Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấyphun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá40oC Chế phẩm thu được cần phải đóng gói kín để tránh hút ẩm

Ngoài ra có thể thu bằng cách kết tủa enzyme trong dịch lọc canh trườngetanol theo tỉ lệ 4:1, với aceton theo tỉ lệ 2:1 và isopropanol theo tỉ lệ 1,3 :1 hoặcvới muối amoniumsulfate(50-80%) Nếu kết tủa bằng etanol thì hoạt độ pectinase

trong kết tủa sẻ khoảng 88-90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu, nếukết tủa bằng muối amoniumsulfate, cần tách muối ra khỏi enzyme bằng phươngpháp thẩm tích sau đó sấy khô Khi độ bão hòa amoniumsulfate bằng 0.5 thì sẻ kếttủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp( chiếm 0.25% trọng lượng khô) nhưng nếukết tủa bằng amoniumsulfate có độ bão hòa 0.1 sẻ kết tủa được đoạn chỉ chiếm0.11% nhưng có hoạt độ pectinase cao.

e Phương pháp yếm khí [1]

Môi trường: bã củ cải 2%; (NH4)2HPO4 0.75%; KH2PO4 0.1%; CaCO3 0.3%;nước chiết ngô 0.5%

Clostridium pectinofermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách

mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tíchluỹ sinh khối Sự tích luỹ enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinhtrưởng qua 55-60h, pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng là 6.5-7.0 Vật liệugieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở trạng thái canh trường chứa bào tử và được cấyvới lượng 4% theo thể tích Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35oC

Cl.felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase Thành phần môi

trường gồm có: lactose 2%; pectin củ cải 1%; (NH4)2HPO4 0.4%; K2HPO4 0.7%;

KH2PO4 0.3%; NaCl 0.1%; MgSO4 0.025%; FeSO4 dạng vết; CaCO3 0.5%; dịchnấm men tự phân 0.05%; ascorbic acid 0.5%

Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủaenzyme với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfat Nếu kết tủa bằngdung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lý là 6.5-6.8 Nếu kết tủa bằng 2-2.5 thểtích aceton thì hoạt độ enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu.Khi kết tủa ammonium sulfat có độ bão hoà bằng 0.2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉchứa pectinesterase và pectintranseliminase, khi độ bão hoà là 0.9-1.0 thì sẽ thuđược chế phẩm chỉ chứa pectintrenseliminase và exopolygalacturonase

f Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzyme: [1]

Khử muối bằng phương pháp lọc gel( Biogel P100)

Tách protein bằng phương pháp trao dổi anion(DAEA Biogel A) hoặccation( CM Biogel A)

Tách enzyme pectinase bằng alginate liên kết ngang Alginate liên kết nganghoạt động bằng cách kết hợp ái lực, ảnh hưởng tỉnh điện và thay thế pectate bằngliên kết ngang

sẽ có tác dụng nâng cao sinh tổng hợp amylase ở Asperrgillus, nhưng lại có tác

dụng xấu đối với các enzyme khác

Thành phần môi trường có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật, từ đóảnh hưởng đến khả năng tổng hợp một enzyme nào đó Không những vậy, thànhphần dinh dưỡng môi trường còn tác động đến chế phẩm enzyme thu nhận được

Với chế phẩm enzyme Pectinase thu được khi nuôi cấy Aspergillus niger trên môi

trường dinh dưỡng khác nhau sẻ khác nhau về pH tối ưu trên cơ chất

Ngoài ra nguồn C, N, P cũng có tác động rất quan trọng đến sự hình thànhemzyme này

Khảo sát ảnh hửng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợpenzyme Pectinase ta thu được kết quả tên môi trường 6 cám gạo/ 4 vỏ bưởi thìenzyme có hiệu suất thu hồi cao nhất với hoạt lực chung là 0.9612 UI/ ml chếphẩm.

g Ảnh hưởng của chất cảm ứng và nguồn cacbon:

Nhóm enzyme pectinase một mặt là các enzyme bản thể, nhưng mặt kháccũng là các enzyme cảm ứng Do đó, một trong những yếu tố quan trọng của sựsinh tổng hợp enzyme pectinase là phải có cơ chất đặc hiệu.Ví dụ pectine đượcthêmvào môi trường sẽ cảm ứng để tổng hợp enzyme pectinase

h Ảnh hưởng của nguồn nitơ:

Nguồn nitơ cũng có vai trò rất quan trọng trong sự tăng tổng hợp enzymepectinase, người ta thêm nitơ vào môi trường dưới dạng muối nitrat và muối amôn.Ngoài cacbon và nitơ, các yếu tố vô cơ cũng ảnh hưởng tới sự sinh tổng hợp cácenzyme pectinase của vi sinh vật Trong đó phốt pho là cấu tử vô cơ cần thịết củamôi trường.Nói chung hàm lượng phốt pho trong môi trường phải không được íthơn 8- 10 mg (tính theo %)

i Tỉ lệ giống cấy

Tỉ lệ giống cấy ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng và lượng sinh khối trongcanh trường từ đó ảnh hưởng đến năng suất và hiệu suất sinh tổng hợp các sảnphẩm trao đổi chất

Tỷ lệ giống nằm trong khoảng 2 – 5%, nhưng đối với một số chủng tỷ lệ nàycòn giảm hơn nhiều, có khi tới 0,5 – 0,6%

Cấy giống mốc bào tử theo phương pháp chìm sẽ kéo dài thời gian nảy mầm

và cũng kéo dài toàn bộ quá trình nuôi cấy

j Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ nuôi cấy phải được kiểm soát chặt chẽ và điều chỉnh đến nhiệt độtối thích cho nấm sợi phát triển Nhiệt độ quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng quátrình sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme trong tế bào

Mặc khác, nhiệt độ còn ảnh hưởng đến độ hoà tan của oxy trong canh Nhiệt

độ càng thấp thì độ hoà tan của oxy càng cao Nhưng nếu nhiệt độ quá thấp (dười

25oC) sẽ làm chậm quá trình sinh trưởng của nấm sợi, từ đó, kéo dài thời gian nuôicấy

Trong thời gian nuôi cấy nên giữ độ ẩm môi trường 50-60% và thông khí90-100%, nhiệt độ thích hợp là 30-32oC

k pH môi trường

Trong quá trình nuôi cấy nấm mốc sinh enzim theo phương pháp chìm pHmôi trường có một ý nghĩa rất lớn Chỉ số pH thích hợp cho sinh tổng hợppectinase là 7 – 8

Trong môi trường khi dùng các muối amon làm nguồn nitơ môi trường sẽ bịkiềm hóa Để điều chỉnh pH trong quá trình nuôi cấy người ta dùng NaOH vàH2SO4

l Độ ẩm môi trường

Trong quá trình nuôi cấy, nên giữ độ ẩm môi trường 50-60% và thông khí90-100% nếu độ ẩm môi trường quá 60% thì dễ phát sinh tạp khuẩn và môi trườngkhó thông khí

Nhưng nếu độ ẩm môi trường khoảng 45-50% thì môi trường sẽ khô nhanh,làm giảm thời gian sinh trưởng của nấm mốc Lúc này nấm mốc sẻ sinh bào tử, sựtổng hợp enzyme sẽ bị trì trệ, làm giảm hoạt tính của enzyme tạo thành

m Sự sục khí và khuấy trộn.

Sự tăng cường chế độ sục khí và khuấy trộn trong quá trình nuôi cấy có khảnăng làm tăng hiệu suất thu nhận pectinase mà không ảnh hưởng đến hình thái củasợi nấm

Điển hình nuôi cấy nấm sợi Aspergillus niger A138 trong bình nuôi cấy

dung tích 10L cho thấy, nếu tại thời điểm tốc độ sinh trưởng đạt cực đại, tốc độ sụckhí tăng lên từ 0.5vvm đến 1.2vvm và tốc độ khuấy tăng từ 300rpm đến 500rpm thìhoạt tính pectinase thu được tăng lên 2 lần so với trường hợp giữ nguyên chế độcũ

Tác dụng của việc thổi khí:

Là xáo trộn môi trường, tăng khả năng tiếp xúc giữa vi sinh vật và cơ chất.Cung nguồn oxy hòa tan vào môi trường

Giải phóng chất khí sinh ra trong quá trình vi sinh vật phát triển khỏi môitrường nuôi cấy

Tác dụng của hệ thống khuấy trộn:

Tăng khả năng tiếp xúc giữa môi trường và vi sinh vật

Tăng khả năng hòa tan oxy từ ngoài vào môi trường

Tăng khả năng sinh sản vô tính do tác nhân cơ học

n Thời gian nuôi cấy

Sinh tổng hợp enzyme theo phương pháp chìm trong các thùng lên men cókhí thổi và khuấy liên tục kéo dài trong khoảng 2 – 4 ngày Đa số các enzyme thủyphân do nấm mốc, xạ khuẩn tạo thành được vào môi trường xung quanh, phần cònlại trong hệ sợi sau 3 ngày nuôi cấy khoảng 10 – 15%

Tạp chất

Nhân giống giai đoạn phòng thí nghiệm :

Sau khi chuẩn bị môi trường, tiến hành tiệt trùng môi trường ở 1210C trong

20 phút Môi trường sau khi tiệt trùng được lắc đều và làm nguội đến nhiệt độphòng

Giống được nuôi liền trong môi trường đã được làm nguội , và giữ ở nhiệt

độ phòng

Nhân giống giai đoạn phân xưởng :

Sử dụng thiết bị nhân giống hình trụ đứng có cánh khuấy , bộ phận sục khí

và có lớp vỏ áo để điều nhiệt

Sau khi đã chuẩn bị , môi trường được phối trộn trong thùng phối trộn cócánh khuấy

Thiết bị : Thùng phối trộn có cánh khuấy

Thống số công nghệ :

Nhiệt độ phối trộn

Tốc độ cánh khuấy

b Tiệt trùng môi trường

Mục đích : vô hoạt enzyme, ức chế vi sinh vật

Thiết bị : Thiết bị tiệt trùng

dạng bản mỏng

Thông số công nghệ :

Nhiệt độ : 121oC

Thời gian : 20 – 30 phút

Lưu ý : Sau khi tiệt trùng ,

môi trường được làm nguội bằng

thiết bị trao đổi nhiệt

dạng bản mỏng để đưa môi trường về nhiệt độ thích hợp để lên men

c Lên men

Mục đích :Tạo điều kiện cho mốc phát triển đều trên môi trường nuôi cấy đểhình thành hệ enzyme pectinase

Các yếu tố ảnh hưởng :

Môi trường lên men : Hàm lượng chất khô , pH môi trường

Điều kiện lên men : Lượng giống cấy , nhiệt độ , thời gian lên men , cungcấp oxy

Thiết bị lên men dạng đứng [3]

Thiết bị lên men dạng trao đổi khối mạnh ΦBO - 40 - 0,6:BO - 40 - 0,6:

1- Ống cung cấp khí đểthổi; 2- Bộ dẫn động kín; 3- Nắp; 4- Cơ cấu khử bọt; 5- Miếng đệm với buồng trao đổi nhiệt; 6- Hộp không khí; 7- Khối trụ đứng; 8- Cơ cấu chuyển đảo; 9- Ống để nạp nước lạnh; 10- Động cơ; 11- Bánh đai; 12- Truyền động bằng đai hình thang; 13- Cơ cấu tháo dỡ; 14- Ống để thải nước; 15- Các ống trao đổi nhiệt; 16- Ống thải không khí; 17- Ống để khử bọt;18- Cửa quan sát