ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE TRONG SẢN XUẤT NƯỚC MẮM NGẮN NGÀY

Nước mắm là dung dịch đạm mà chủ yếu là các acid amin, được tạo thành do quá trình thủy phân protein cá nhờ hệ enzym protease có trong cá và ruột cá làm cho nước mắm có mùi vị đặc trưng.Để rút ngắn thời gian chế biến nước mắm, người ta sử dụng enzyme từ bên ngoài đưa vào để tăng quá trình thủy phân protein nhằm rút thời gian sản xuất nước mắm từ 6 tháng đến một năm xuống còn 30 đến 60 ngày. Tuy nhiên phương pháp này còn hạn chế vì chưa đáp ứng được mùi vị của nước mắmCó thể sử dụng enzyme dạng thô, dạng tinh hoặc bán tinh chế để cho vào chượp, thông thường thường sử dụng enzyme protease từ chủng nấm mốc Asp.Oryaze để bổ sung vào nước mắm ngắn ngày.Bản chất của quy trình sản xuất nước mắm là: Cá + muối nước mắm.Bản chất của quá trình này chính là quá trình thủy phân protein trong cá nhờ hệ enzyme: Enzyme protease pepton polypeptid peptid acid amin.1. Ứng dụng của enzyme proteaseProtease không những được ứng dụng nhiều trong y dược, hóa học, trong nông nghiệp, mà trong công nghiệp Protease chiếm vai trò quan trọng, việc sử dụng enzyme trong công nghiệp là đa dạng, phong phú và đã đạt được nhiều kết quả to lớn.Một số lĩnh vực như: công nghiệp thịt, công nghiệp chế biến cá, công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh mì, bánh kẹo, công nghiệp bia, công nghiệp sản xuất sữa khô và bột trứng, công nghiệp hương phẩm và mỹ phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công nghiệp y học…Sau đây là những ứng dụng mà Protease mang lại trong công nghiệp thực phẩm:a) Trong công nghiệp chế biến thịtProtease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn.Từ đó chất lượng thịt được nâng cao và thời gian chín của thịt được rút xuống nhiều lần. Để làm mềm thịt, ta có thể: •Ngâm thịt trong phức hệ enzyme cần thiết ở pH và nhiệt độ xác địnhphương pháp này phổ biến và thuận lợi nhất•Rải lên bề mặt thịt chất làm mềm dạng bột có chứa enzyme và chất phụ gia •Tiêm dung dịch enzyme vào mô•Đưa dung dịch enzyme vào máu động vật trước khi giết thịtb) Trong chế biến thủy sảnKhi sản xuất nước mắm thì thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá.Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme Protease để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm.

MỤC LỤC

I Khái quát về enzyme 2

1.1 Enzym 2

1.2 Đặc tính chung của enzym 2

1.3 Cấu tạo của enzym 3

II Tổng quan về enzyme protease 3

1.1 Giới thiệu 3

1.2 Đặc điểm chung 4

1.3 Phân loại 5

1.4 Cơ chế tác dụng 7

1.5 Nguồn cung cấp 7

III Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae 14

1.1 Tổng quan về Aspergillus oryzae 14

1.2 Quy trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 21

1.1.1 Sơ đồ quy trình 21

1.1.2 Thuyết minh quy trình 22

IV ENZYME PROTEASE 28

1.1.Ứng dụng của enzyme protease 28

V Ứng dụng của protease trong sản xuất nước mắm ngắn ngày 30

1 Giới thiệu về nước mắm 30

2 Phân loại nước mắm 31

VI Quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày 32

1 Giải thích quy trình 33

VII Sản phẩm 46

I Khái quát về enzyme.

1.1 Enzym

- Enzym có bản chất là protein được sinh vật tổng hợp nên, tham gia vào các phảnứng hóa sinh học

1.2 Đặc tính chung của enzym

- Enzym được tạo ra trong tế bào sinh vật, không độc hại, thân thiện với môitrường

- Enzym tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi được tách khỏi tế bàosống

- Enzym có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạnđầu đến giai đoạn cuối giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóahọc Trong chuỗi chuyển hóa hở hay chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm của phản ứngtrước là cơ chất cho phản ứng sau

- Enzym có thể được thực hiện một phản ứng: xảy ra ngoài tế bào (như trong ốngnghiệm)

- Phản ứng enzym tiêu hao năng lượng rất ít, hiệu suất và tốc độ cao

- Enzyme tính chọn lọc cao

- Enzym chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng

1.3 Cấu tạo của enzym

Nhóm enzym đơn cấu tử : Thành phần cấu tạo chỉ có protein.

Nhóm enzym đa cấu tử :

- Gồm 2 phần:

+ Phần I: protein thuần : apoprotein hay apoenzym

+ Phần II: thành phần không phải protein : cofactor – chúng có thể gắn chặt(prosthetic) hoặc lỏng lẻo với phần protein (coenzym)

Ngoài ra còn có một số kim loại giữ vai trò liên kết giữa enzym và cơ chất, giữaapoenzym và coenzym, tham gia vận chuyển điện tử

II. Tổng quan về enzyme protease

1.1 Giới thiệu.

Protease là chất xúc tác thủy phân protein tạo thành những phân tử thấp và cácamino acid.Chúng không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinhvật mà còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học,trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường.Protease là một trong những enzyme được ứngdụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực Đặc biệt là công nghiệp thực phẩm, protease đã cónhững đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ và nâng cao đời sống của con người Hiệnnay trên thế giới, công nghệ thu nhận protease từ vi sinh vật hiện còn đang phát triển, tìmtòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng vô vàn của enzyme protease Ở Việt Nam cũng cónhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng Protease, chủ yếu tập trung vào cácprotease thực vật và động vật còn protease vi sinh vật chỉ được nghiên cứu trong hơnchục năm trở lại đây

1.2 Đặc điểm chung.

Ezyme protease là enzyme thủy phân các liên kết pectid (-CO-NH-) trong phân tửprotein giải phóng các acid amin, pepton hoặc dittripepton

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tếbào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật(vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ) Sovới protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt.Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rấtgiống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạngtinh thể đồng nhất Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinhvật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.

Hình1.2: Cấu trúc không gian enzyme protease

1.3 Phân loại

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)

Hình 1.3: Sơ đồ phân loại protease

Với enzym protease thì có nhiều cách phân loại nhưng ta chỉ dựa vào hai đặc điểmsau để phân loại chúng:

• Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các peptide trong phân tử protein,người ta chia protease làm 2 nhóm chính:

• Exopeptidase: (Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptid,) được phânthành 2 loại:

• Amino peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu N tự do của chuỗi

poly peptid để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptid

• Carboxy peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi

poly peptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một đipepti

• Endo peptidase: (Dựa vào động lực học của cơ chế xúc tác) được chia thành

4 nhóm:

• Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong

trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác củaenzyme Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ chymotripsin và subtilisin Nhóm chymotripsinbao gồm các enzyme động vật như chymotripsin, tripsin, elastase Nhóm subtilisin baogồm 2 loại enzyme vi khuẩn như subtilisin carlsberg, subtilisin BPN Các serineproteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện đặc hiệu cơ chất tươngđối rộng

• Cyteim proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt

động Cystein protease bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vàiproteinase động vật và proteinase ký sinh trùng Các Cystein proteinase thường hoạt động

ở vùng PH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

• Aspatic proteinase: hầu hết các asportic proteinase thuộc nhóm pepsin.

Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin….Các asportic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạtđộng mạnh ở PH trung tính

• Metallo proteinase metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở

vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thườnghoạt động ở vùng PH trung tính và giảm hoạt động mạnh dưới tác dụng của EDTA

• Dựa vào thành phần amimo acid và vùng pH tối ưu của protease, người tachia làm các nhóm:

• Protease acid: pepsin, renin,… hoạt độngở vùng pH acid 2-4.

• Protease kiềm: tryssin, chymmotrysin, … hoạt độngở vùng pH kiềm 9-11.

• Protease trung tính: như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa, …

hoạt độngở vùng pH trung tính 7-8

• Ngoài ra có thể phân làm 2 loại khác:

• Enzyme protease nồi bào là những enzyme được tiết ra từ bên ngoài hoặcngoại biên màng protein và được trích ly vào môi trường bằng kĩ thuật trích ly

- Enzyme protease ngoại bào được thu nhận từ quá trình lên men hoàn tất hoặcngay quá trình lên men đang diễn ra.

1.4 Cơ chế tác dụng

Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc tác sinh họccủa enzym người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng đều thống nhất ở chỗ quátrình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzym và cơ chất thành hợp chất trung gian

E (enzym) + S (cơ chất)→ES(hợp chất trung gian)

1.5 Nguồn cung cấp

Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc táccho mọi phản ứng sinh học Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận

để sản xuất enzyme Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính: các mô và cơ động vật, mô

và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật

• Nguồn Động vật

Hai protease acid quan trọng trong tuyến tiêu hóa ở người và động vật, có nhiềuứng dụng và được quan tâm là pepsin và rennin, đặc biệt về khả năng đông tụ sữa Haienzym này được thu nhận chủ yếu từ dạ dày động vật (heo, bê, bò…)

Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều ezymenhất Trypsin là men phân giải các protein hỗn hợp men này do tuyến tụy tiết ra, tiền thâncủa nó là Trypsiogen, được hoạt hóa bởi Entorokiaza của ruột Trypsin là một enzym cóchức năng phân cắt các protein

Ngoài ra tuyến tụy còn tiết ra enzyme Chymotrypsin, enzym này góp phần phângiải protein trong ruột non và được chiết xuất từ tụy bò

Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhómProtease tên là renin Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệphomat.Renin làm biến đổi các casein thành paracazein có khả năng kết tủa trong môitrường sữa có nồng độ Ca2+ (sự đông tụ sữa chua)

Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như: ởcác loài Eudothia parasitica và Mucor purillus

• Nguồn thực vật

Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin Papain thu được từnhựa của lá, thân, quả đu đủ (Caria papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa(Pineapple plant) Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng củabia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein Những ứng dụng khác củaprotease thực vật này là trong công nghệ chế biến thịt nó làm mềm thịt và trong mục tiêutiêu hóa.

Ngoài ra còn thu nhận ezyme Ficin tách từ dịch ép thân cây sung Ezyme được sửdụng để phân hủy protein tự nhiên

Hình 1.4: Mô hình phân tử enzyme papain

Hình 1.5: Nguồn thu nhận ezyme Protease từ thực vật

• Nguồn vi sinh vật

Hai nguồn nguyên liệu trên không để dùng làm nguyên liệu sản xuất công nghiệpquy mô lớn do những hạn chế về nguyên liệu và công nghệ Vì dùng enzyme từ vi sinhvật sẽ khắc phục được các hạn chế sau:

• Nguồn nguyên liệu vô hạn

• Hệ enzyme phong phú

• Hoạt tính mạnh.

• Có khả năng tăng cường sinh tổng hợp enzyme nhờ chọ giống

• Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực nhanh

• Thức ăn nuôi dễ kiếm, rẻ tiền

Ezyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn gồm nhiều loàithuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại nấmmen

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillussubtilis, B Mesentericus, B Thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.Trong đó, B Subtilis có khả năng tổng hợp mạnh nhất Các vi khuẩn thường tổng hợpcác protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu

Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 – 6) và cókhả năng chịu nhiệt thấp.Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm

ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng Các protease trung tính

có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm Chúng được sinh ra nhiềubởi B Subtilis, B Mesentericus, B Thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chiClostridium

Hình 1.6: Clostridium

Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ20.000 – 30.000.Ổn định trong khoảng pH 6 – 12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7 –12

Hình 1.7: Bacillus

• Nấm

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụngtrong công nghiệp thực phẩm là các chủng Aspergillus oryzae, A Terricola, A.Fumigatus, Penicillium chysogenum, Các loại nấm mốc có khả năng tổng hợp cả baloại protease: acid, kiềm, trung tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid,

có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3

Một số nấm mốc khác như: A Candidatus, P Cameberti, P Roqueforti cũng cókhả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat

Hình 1.8: Nấm mốc

• Xạ khuẩn

Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn nấm mốc.Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease caonhư: Streptomyces grieus, S Fradiae,

Hình 1.9: Xạ khuẩn

Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ởquy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi íchnhư sau:

• Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật

• Chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16 – 100 giờ nên có thể thu hoạch nhiềulần trong năm

• Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng

sử dụng và tăng hiệu suất thu hồi)

• Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sảnxuất

Tuy nhiên, trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gâybệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp

Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật cótrong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp

ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết

III Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae.

1.1 Tổng quan về Aspergillus oryzae

a Đặc điểm cấu tạo

Aspergillus gồm hơn 185 loài, khoảng 20 loài cho đến nay đã được báo cáo là tác

nhân gây bệnh nhiễm trùng cơ dùng để sản xuất thực phẩm, hóa chất và các enzyme

Trong số này, Aspergillus fumigatus là phổ biến nhất, tiếp theo là Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus clavatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus terreus, versicolor, Aspergillus oryzae…

Nấm Aspergillus orzae có cấu tạo đa bào, thuộc loại vi hoàn khuẩn, các khuẩn ty

có nhiều vách ngăn, khi khuẩn ty mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màuxanh nhạt có ít vàng

Nấm Aspergillus oryzae có hình dáng là đính bào tử, màu thay đổi từ xanh vôi

sang màu xanh thẩm dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia

Nấm mốc Aspergillus oryzae sinh ra các enzym amylase, invertase, maltoase,

protease và catalase có khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin. 

Nấm mốc Aspergillus oryzae là tác nhân lên men chủ yếu trong sản xuất nước

tương theo phương pháp vi sinh vật Trong công nghiệp, người ta nhân giống nấm mốcnày để sản xuất tương

• Một số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi nấm Aspergillus oryzae.

• Protease: Ứng dụng trong công nghiệp da giày, y học, công nghiệp chế

biến thức an gia súc

• Amylase: Ứng dụng trong công nghiệp dệt, sản xuất các chế phẩm sinh học

bổ sung vào thức ăn gia súc, sản xuất glucose, dixtrin, malt…

• Cellulose: ứng dụng trong công nghiệp dệt,công nghệ giấy, xử lý ô nhiễm

môi trường…

b Vai trò của giống

Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đóng vai trò quyết định đến: Năngsuất của nhà máy, chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính của enzyme), vốn đầu

tư cho sản xuất, giá thành sản phẩm và có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ visinh vật

c Yêu cầu của giống

Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sảnxuất theo qui mô công nghiệp Do đó, giống vi sinh vật ứng dụng trong công nghệenzyme cần có những yêu cầu và mục đích nhất định Giống vi sinh vật phải cho ra sảnphẩm mà ta mong muốn Sản phẩm phải có số lượng và chất lượng cao.Vì trong quá trìnhtrao đổi chất, để chuyển hóa một lượng sinh khối khổng lồ gấp hàng ngàn lần cơ thể mìnhtrong khoảng thời gian ngắn thì cơ thể vi sinh vật cần tổng hợp rất nhiều chất Giốngdùng sản xuất phải thỏa mãn các tính chất sau :

+ Phải cho năng suất sinh học cao

+ Giống phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sảnxuất công nghiệp

+ Giống vi sinh vật phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếmtại địa phương

+ Giống sử dụng trong quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh vật thuầnkhiết, có tốc độ sinh sản nhanh

+ Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh các sản phẩm mong muốn, dễ dàng táchchiết, tinh sạch

+ Dễ dàng bảo quản và ổn định

Để tạo thuận lợi lớn nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho quá trình lênmen công nhiệp, ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết.

d Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae

Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc, do khả năng pháttriển nhanh, mạnh nên ít bị tạp nhiễm Khi nuôi, nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạtchất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đậm sâu vào lòng môi trường đã đượctiệt trùng, làm ẩm Người ta thường dùng môi trường: cám mì, cám gạo, ngô mảnh,trấu Cám, trấu có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gâyảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc Tỷ lệ các chất phải đảm bảo sao cho hàmlượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20% có thể bổ sung thêmnguồn nitơ vô cơ (NH4)2 SO4, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt,nước chiết ngô, nước lọc bã rượu Với phương pháp này nồng độ enzyme cao hơn nhiềulần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật.Chế phẩm dễ dàng sấykhô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế phẩm khô dễ bảo quản, vậnchuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme,tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện quy mô gia đình.Nuôi cấy trong điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễmtrùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó.Tuy nhiên, phươngpháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ giới hóa, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chếphẩm ở các mẻ không đồng đều

Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng, với chất chủ yếu trong đa sốtrường hợp là tinh bột Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùng nguồn cơ chất cacbon làđường glucoza, saccharoza Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được vô trùngtuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôicấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy Các giai đoạn của quá trình nuôi cấychìm gồm: chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nuôi cấy nấm men giống, nuôi cấy nấm mốcsản xuất Phương pháp nuôi cấy hiện đại, dễ cơ giới hóa, tự động hóa, năng suất cao, dễ

tổ chức sản xuất Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinhtổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy,

enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện vệ sinh vô trùng Tuy nhiên do thuđược canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thànhcao Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt,toàn bộ, gây tổn thương lớn.

e Nguyên liệu sản xuất

Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởngtrực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Trong thành phần môitrường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật vàtổng hợp enzyme Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vàohiện tượng cảm ứng Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thìchất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm hãm củachất kìm hãm nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở Chấtcảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường thường là cơ chất tương ứng củaenzyme cần tổng hợp

Thành phần chính của môi trường: C, H, O, N Ngoài ra còn có các chất vô cơ:

Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác

Đối với Asp.oryzae: frucfoza saccroza maltoza glucoza manit

arabinoza glactoza

Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme

protease Chẳng hạn như: vi khuẩn Bac Subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở

môi trường tinh bột lớn hơn 8%

Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonos pora vulgaris 42, mọc tốt và sinh

tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột Tăng nồng độ tinh bột từ 0,25 – 1,5%sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp enzyme

Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH4, H2PO4 là tốt hơn cả Các nguyên liệu đãchuẩn bị làm môi trường tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch épquả, rau, khô dầu, bã rượu, rỉ đường, sản phẩm phân hủy, nấm, men bia, trấu, lõi ngô Khi

lựa chọn sử dụng môi trường cần chú ý đến các chất có tác dụng điều hòa sinh tổng hợpenzyme, đặc biệt các chất cảm ứng.

f Phương pháp phân lập

Vi sinh vật phân bố rất rộng trong tự nhiên, đâu đâu cũng có vi sinh vật Ở nhữngnơi giàu chất hữu cơ, trong không khí, trong cơ thể động vật, thực vật….Chính vì vậy mà

vi sinh vật có khả năng tồn tại và phát triển ở những điều khắc nghiệt nhất

Thông thường chủng vi sinh vật để thu nhận enzyme thường có 3 cách phân lập:+ Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên

+ Phân lập giống trong điều kiện sản xuất

+ Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng

Tùy thuộc vào khả năng và điều kiện thực tế mà chọn cách phân lập phù hợpnhất.Mỗi cách có những ưu điểm riêng

• Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên

Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệtđáng kể các giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện tự nhiên,được gọi là các chủng vi sinh vật hoang dại Chúng đã quen với các điều kiện tự nhiên,khi chúng ta đưa chúng vào điều kiện sản xuất công nghiệp với điều kiện môi trường cốđịnh đòi hỏi các loài vi sinh vật cũng có thời gian thích nghi Huấn luyện chúng thíchnghi với điều kiện sản xuất công nghiệp là điều kiện rất cần thiết

• Phân lập giống trong điều kiện sản xuất

Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điềukiện sản xuất.Nhờ đó sau khi phân lập các giống này không qua giai đoạn huấn luyện

Các giống này đã được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có nhữngđặc điểm sinh hoá hơn hẳn các giống vi sinh vật hoang dại

Mật độ tế bào vi sinh vật thường rất cao, do đó khả năng thu nhận đã sinh tổnghợp cao

• Phân lập giống trong điều kiện hư hỏng

Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản Do bị nhiễm nhiều tế bào visinh vật đã bị thoái hoá nhưng cũng có nhiều tế bào không bị thoái hoá

Quy trình lấy mẫu: khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất.Sau 8 ngày lấy nhữngmiếng khoai tây lên cho vào bao nilon và mang về phòng thí nghiệm

Tiến hành thí nghiệm: Mẫu khoai tây đã xay nhuyễn cho vao 90ml nước cất vôtrùng và trộn đều mẫu.Lấy pipet hút 10ml từ dung dich ban đầu sang ống nghiêm khácchứa 90ml nước cất vô trùng Tiếp tục pha loãng tới nồng độ 10-3, 10-4

• Hút 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào môi trường PDA

• Dùng que trang trang đều mãu trên bề mặt thạch

• Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên sẽ xuất hiện những quầngsáng quanh khuẩn lạc

• Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy

• Cấy chuyền những mớc đặc trưng vào trong môi trường Pda trong ốngthạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong vòng 72h

• Nhân giống vi sinh vật trong bình tam giác: cho10ml nước cất vo trùng vàoống thạch nghiêng có chứa bào tử Lắc đều cho bào tử trộn lẫn với môi trường

• Hút 0,1ml dung dịch cho vào bình tam giác chứa môi trường sinh trưởngcủa nấm

• Phương pháp bảo quản

Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng đã đượckiểm tra đầy đủ về các đặc tính hoá sinh, vi sinh và cần đặc biệt lưu ý đến điều kiện bảoquản giống Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có thể tạo ra các biến dịngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyền và kiểm tra lại các đặc tínhban đầu

• Phương pháp cấy chuyền

Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môitrường thạch (thạch nghiêng, hợp petri…) với thành phần môi trường nuôi cấy và điềukiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo quản

ở nhiệt độ lạnh 3 – 4 và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại.Khi cấy chuyền chỉ lấy bào tửhoặc khuẩn lạc mà không chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thểgây biến đổi bất lợi không thể lường hết được)

Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà nên giữtrong đất để khử trùng.Để kéo thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến một năm,người ta phủ một lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự pháttriển của nó Cần lưu ý chỉ phủ một lớp đầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chín sinh

lý Phương pháp cấy chuyền rất có hiệu quả để bảơ quản các giống nấm men, vi khuẩn vàrất hữu hiệu dễ dàng triển khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến có thể dẫn đến

hư hỏng giống gốc

• Phương pháp làm khô

Bằng cách giữ giống trên cát đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đềuđược khử trùng cẩn thận).Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục củagiống khi bảo quản Phương pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạkhuẩn, một vài loại nấm men, vi khuẩn thời gian giữ giống có thể được một năm Phươngpháp làm khô cũng thực hiện đơn giản không cần dụng cụ đắt tiền Tuy nhiên, giống nhưphương pháp cấy chuyền thời gian bảo quản tương đối ngắn

• Phương pháp đông khô

Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạngthái lạnh sâu Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm

lạnh trong môi trường chân không Thiết bị động khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu đượclàm khô đến mức nhất định.Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chânkhông Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các nấm men, vikhuẩn và một số virut Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng, đối với tảo, độngvật nguyên sinh và tế bào động vật.

• Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môitrường dịch thế và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độlạnh sâu (-1960C đến -800C) Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trìnhlàm lạnh và làm tan mẫu.Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chấtđiện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào Để khắc phụcnhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tannhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfo xide) Việc bảo quản theo phương pháp lạnhsâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như: -200C, - 300C, -400C, -700C, -

400C và -1960C Nói chung mức nhiệt cao hơn - 300C cho hiệu quả thấp do tế bào chịunồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải Phương pháp bảo quản này có hiệu quảvới nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn vàvirut

1.2 Quy trình sản xuất protease từ chủng nấm mốcAspergillus oryzae

Quy trình thu nhận enzyme protease

Trong sản xuất các chế phẩm protease, người ta thường chia làm hai giai đoạn: Thunhận protease thô và tinh sạch protease

Thu chế phẩm protease thô: Với nguồn động vật và thực vật thì tiến hànhnghiền ,

trích ly sau đó đem ly tâm.Còn đối với nguồn vi sinh vật thì ta nuôi cấy, phá vỡ tế bàosau đó đem ly tâm

Tinh sạch protease: Sửdụng các phương pháp hóa lý đểloại dần các thành phần không

phải proteasera khỏi thành phần protease Sản phẩm cuối cùng là protease tinh khiết

Hình 2.1: Quy trình tổng quát thu nhận protease

Ly tâm

Thu nhận kếttủa

Sấy

Tinh chế enzyme tinhChế phẩm

khiết

Sử dụngenzyme thô

Asp.oryzae

Nuôi cấy

Hình 2.2: Quy trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

1.2.2 Thuyết minh quy trình

a Môi trường

Mục đích: Chuẩn bị môi trường cho nuôi cấy cho phép vi sinh vật phát triển tốtCách tiến hành: Nguồn tinh bột như cám gạo, chứa khoảng 20% tinh bột, 10- 20%chất béo, 10–14% protein, 8 – 16% cellulose, các chất hòa tan không chứa nitơ 37–59%.Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20%, không có vị chua hay đắng,không hôi mùi mốc, độ ẩm không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%, có thể bổsung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chấtkích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu Các phụ phẩm thêmvào để thoáng khí cho môi trường nuôi cấy bề mặt như trấu , mùn cưa

b Nuôi cấy

Mục đích: Tạo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phát triển và sinh enzyme

Cách tiến hành: Sau khi đã trộn giống, môi trường được rải đều ra các khay với

chiều dài 2 -3cm, rồi được vào phòng nuôi cấy, đặt trên các giá đỡ Các giá đỡ này đượcthiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên.Phòng nuôi cấy phải có

hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí, nhiệt độ thích hợp cho sợi nấm pháttriển là từ 280C – 32oC.Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng đến sự phát triểncủa sợi nấm

Trong quá trình nuôi cấy ta không cần phải điều chỉnh pH Môi trường bán rắn làmôi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít ảnh hưởng đến cả khối môitrường

Thời gian nuôi sợi nấm thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ Điều này còn phụ

thuộc vào chủng mốc Asp.oryza, điều kiện môi trường cùng như kĩ thuật nuôi cấy

Thiết bị: Khay nuôi cấy bề mặt

Hình 2.3 Khay nuôi cấy Thông số kĩ thuật: + Dày 4-5cm

+ Cao 1-1,2m

Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài từ 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy.

Ở giai đoạn này có những thay đổi sau như nhiệt độ tăng rất chậm, sợi nấm bắt đầu hìnhthành có màu trắng hoặc màu sữa, thành phần chất dinh dưỡng cũng bắt đầu thay đổi,khối môi trường còn rời rạc, enzyme mới bắt đầu được hình thành Trong giai đoạn nàykhông được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt độ

Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài từ 14-18 giờ Trong giai đoạn này có những

thay đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và phát triển mạnh tạothành những mạng chằng chịt bao quanh các hạt môi trường, có thể nhìn rõ sợi nấm màutrắng xám bằng mắt thường, môi trường kết lại khá chặt, độ ẩm môi trường giảm dần,nhiệt độ môi trường có thể tăng nhanh lên 40-500C, các chất dinh dưỡng giảm nhanh do

sự đồng hóa của sợi nấm, enzyme prorease được tổng hợp mạnh, lượng O2 trong khôngkhí giảm và lượng CO2 tăng dần, cần phải thông khí mạnh và duy trì mức nhiệt độ từ 29-

300C là tốt nhất

Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài từ 10-20 giờ Trong giai đoạn này có những

thay đổi như sau Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ tiêu hao chất dinh dưỡng

sẽ giảm lại, nhiệt độ của môi trường giảm, lượng enzyme tạo ra sẽ giảm xuống Do đócần xác định thời gian để thu nhận enzyme hiệu quả nhất

c Chế phẩm thô

Mục đích: Thu được chế phẩm enzyme protease, chế phẩm này được gọi là

enzyme thô vì ngoài thành phần enzyme chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phầnmôi trường và nước

Cách tiến hành: Để đảm bảo enzyme không bị mất hoạt tính nhanh người ta

thường sấy enzyme đến một độ ẩm thấp (Thường dùng là máy sấy chân không).Nhiệt độsấy vào khoảng 38-400C,enzyme protease bị mất hoạt tính ở 60-760C, độ ẩm sau khi kếtthúc sấy nhỏ hơn 10%

Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà ta có thể sử dụng ngay enzyme này mà khôngcần phải tinh sạch.Trong những trường hợp khác ta phải tiến hành tinh sạch enzyme đểbảo quan lâu hơn

d Trích ly

Mục đích: Tách enzyme ra khỏi khối môi trường.

Cách tiến hành: Sau khi nghiền mịn người ta cho nước vào để trích ly enzyme.

Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta sử dụng chúng nhưdung môi hòa tan Cứ 1 phần chế phẩm thô cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và lọc lấy dịch,phần bã được loại bỏ để làm thức ăn cho gia súc

Thiết bị: Thiết bị trích ly kiểu thùng quay

Hình 2.4 Máy trích ly

Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ trích ly 250C

+ Thời gian 40-60 phút

e Kết tủa enzyme

Mục đích: Thu nhận dung dịch enzyme

Cách tiến hành: Trong công nghiệp tinh chế enzyme người ta sử dụng cồn hoặc

sunfatmon Trong quá trình này người ta làm lạnh cả dung dịch thô và các tác nhân kếttủa để tránh làm mất hoạt tính của enzyme Cứ 1 phần dung dịch enzyme thô cho 2-2.5phần cồn hoặc sunfat amon, cần nhẹ nhàng để tránh hiện tượng biến tính, khuấy nhẹ và

để trong điều kiện lạnh từ 4-70Ctrong một thời gian, các enzyme tạo thành kết tủa và lắngxuống, người ta thu nhận kết tủa (Độ ẩm > 70%) Người ta tiếp tục sấy kết tủa ở 400C và

độ ẩm giảm xuống 5-8%

Thiết bị: Thiết bị kết tủa

Hình 2.5 Thiết bị kết tủa

Thông số kĩ thuật:

+ Nhiệt độ:tiến hành ở nhiệt độ phòng

+ Muối:amoni sunfat 80%

+ Thời gian: 10-18 giờ

+ Hoạt độ riêng: 162 IU/mg

+ Hiệu suất: 74%

f Ly tâm

Mục đích : Tách sinh khối vi sinh vật và bã của canh trường

Các biến đổi:Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch, sự

thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn-lỏng, tách huỳnh phù rathành 2 pha rắn-lỏng

Các yếu tố ảnh hưởng: Sự chênh lệch khối lượng riêng của 2 pha rắn lỏng:chênhlệch nhiều thì quá trình diễn ra dễ dàng hơn, tốc độ quay của roto: Tốc độ càng nhanh quátrình diễn ra càng tốt

Thiết bị: Thiết bị ly tâm lắng

Hình 2.6 Thiết bị ly tâm lắng