Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng thực vật methyl jasmonate lên khả năng tích lũy asiaticoside trong nuôi cấy huyền phù tế bào rau má (centella asiatica l )

Đã có nhiều công trình nghiên cứu vấn đề trên như nghiên cứu tăng sản xuất silymarin trong nuôi cấy tế bào của Silybum marianum bằng các chất kích kháng thực vật dịch chiết nấm men YE và

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

======

TRĂ THỊ KHÂNH NHI

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA METHYL

JASMONATE LÊN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASIATICOSIDE TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO

RAU MÁ (Centella asiatica L.)

NGÀNH: SINH HỌC GIẢNG VIÍN HƯỚNG DĐ̃N: PGS TS TRĐ̀N QUỐC DUNG

ThS NGUYÍ̃N THANH GIANG

HUẾ, KHÓA HỌC 2011 - 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập và hoàn thành khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ các thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Huế Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý giá đó Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS Trần Quốc Dung và ThS Nguyễn Thanh Giang, hai thầy giáo đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế, các cán bộ của Viện, đặc biệt là TS Hoàng Tấn Quảng, và KS Trịnh Hữu Tấn đã có nhiều sự giúp đở quý báu cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập cho đến khi hoàn thành khóa luận này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Huế, tháng 5 năm 2015

Tác giả Trà Thị Khánh Nhi

YE : yeast extract (dịch chiết nấm men)

ĐHST : điều hòa sinh trưởng

MS : môi trường nuôi cấy cơ bản

µM : micromol

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Sản phẩm thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật so với cây tự

Bảng 1.2 Các hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy mô và tếbào thực vật (Mulbagal and Tsay 2004). 13

Bảng 1.3 Một số chất kích kháng sinh học được sử dụng để cải thiện

hiệu suất của các hợp chất thứ cấp 15Bảng 3.1 Sinh khối tế bào thu được sau 24 ngày nuôi cấy (g) 27

Bảng 3.2 Sinh khối tươi thu được sau khi bổ sung MeJA ở các nồng

Bảng 3.3 Sinh khối khô thu được sau khi bổ sung MeJA ở các nồng

Bảng 3.4 Tỷ lệ khối lượng sinh khối sau khi bổ sung MeJA so vớiđối chứng (%). 32

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ MeJA lên khả năng tích lũy

asiaticoside của tế bào (g) 33Bảng 3.6 Sinh khối tươi thu được sau khi bổ sung 100 µM MeJA ởcác nồng độ khác nhau (g). 37

Bảng 3.7 Sinh khối khô thu được sau khi bổ sung 100 µM MeJA ở

các nồng độ khác nhau (g) 38Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung MeJA lên khả năng tích

lũy asiaticoside của tế bào rau má 40

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Biểu đồ thể hiện sinh khối khô tươi của tế bào rau má

sau khi bổ sung MeJA vào các nồng độ khác nhau 31Biểu đồ 3.2 Biểu đồ thể hiện sinh khối tưoi của tế bào rau má saukhi bổ sung MeJA vào các nồng độ khác nhau. 32

Biểu đồ 3.3

Biểu đồ thể hiện sinh khối khô tươi của tế bào rau másau khi bổ sung 100 µM MeJA vào các thời điểm khácnhau

38

Biểu đồ 3.4

Biểu đồ thể hiện sinh khối khô của tế bào rau má saukhi bổ sung 100 µM MeJA vào các thời điểm khácnhau

39

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Các loại callus sau 21 ngày nuôi cấy 26Hình 3.2 Huyền phù tế bào rau má sau 24 ngày nuôi 27Hình 3.3 Phổ HPLC chuẩn 1mg/mL 29Hình 3.4 Phổ HPLC đối chứng 29

Hình 3.5 Phổ HPLC của asiaticoside khi bổ sung vào môi trường

nuôi cấy 50 µM MeJA 35Hình 3.6 Phổ HPLC của asiaticoside khi bổ sung vào môi trườngnuôi cấy 100 µM MeJA. 35

Hình 3.7 Phổ HPLC của asiaticoside khi bổ sung vào môi trường

nuôi cấy 150 µM MeJA 36Hình 3.8 Phổ HPLC của asiaticoside khi bổ sung vào môi trường

nuôi cấy 200 µM MeJA 36Hình 3.9 Phổ HPLC của dịch chiết asiaticoside từ tế bào nuôi trên

môi trường bổ sung 100 µM MeJA ở thời điểm 5 ngày 41Hình 3.10 Phổ HPLC của dịch chiết asiaticoside từ tế bào nuôi trên

môi trường bổ sung 100 µM MeJA ở thời điểm 10 ngày 41Hình 3.11 Phổ HPLC của dịch chiết asiaticoside từ tế bào nuôi trênmôi trường bổ sung 100 µM MeJA ở thời điểm 15 ngày. 40

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay, con người đang chống chọi với một loạt các bệnh tật mangtính thời đại như béo phì, tiểu đường, tim mạch, ung thư, HIV/AIDS… Côngnghệ sản xuất dược phẩm cũng vì vậy mà được quan tâm đầu tư nhiều hơn.Vấn đề quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng dược phẩm lànguồn cung cấp nguyên liệu thiên nhiên sạch, đủ và an toàn Một trong nhữngđối tượng cung cấp nguyên liệu hiệu quả nhất là thực vật Có khoảng hơn30.000 hợp chất được chiết xuất từ thực vật như alkaloid; terpenoid; phenolic;được biết đến như là các hợp chất thứ cấp Các hợp chất này thường chỉ đượctạo ra ở một số loại tế bào nhất định với hàm lượng rất nhỏ [6] Mặc dù, hóahọc tổng hợp các chất hữu cơ đạt nhiều thành tựu quan trọng tuy nhiên nhiềuhợp chất có hoạt tính sinh học vẫn còn khó tổng hợp hoặc có thể tổng hợpđược nhưng chi phí rất đắt Trên thế giới, vào cuối thế kỷ XIX, con người đã

sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất các chất có hoạt tínhsinh học đã giải quyết được vấn đề nan giải trên

Trong đời sống của thực vật, hợp chất thứ cấp là sản phẩm của các phảnứng hóa học của nó với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại visinh vật và động vật gây bệnh [4] Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor)báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp Vì vậy để tăng quá trình sảnxuất hợp chất thứ cấp thì giải pháp tối ưu nhất là sử dụng các chất kích khángcủa bộ máy bảo vệ cây Đã có nhiều công trình nghiên cứu vấn đề trên như

nghiên cứu tăng sản xuất silymarin trong nuôi cấy tế bào của Silybum

marianum bằng các chất kích kháng thực vật dịch chiết nấm men (YE) và

methyl jasmonate (MeJA) [23]

Rau má (Centella asiatica L.) là cây thân thảo, thường được dùng để

thanh nhiệt, lợi thấp, giải độ, điều trị các bệnh ở gan, tì và thận, chữa lành vếtthương, kháng viêm, tổn thương ở niêm mạc da… [3] Một số thành phần hóahọc quan trọng có trong nó như nhóm triterpens chứa asiatic acid, madecassic

acid, madecassoside, chất chống oxi hóa phenolic và đặc biệt là asiaticoside.Asiaticoside có tác dụng lớn trong việc chống suy nhược cơ thể, liền vết bỏng

và vết thương tổn ở niêm mạc da, có hoạt tính diệt bào ngăn chặn được sựphát triển của một số dòng tế bào ung thư [3]

Từ trước đến nay, rau má được khai thác chủ yếu từ nguồn hoang dại,thô sơ, mang tính riêng lẻ, nên nguồn nguyên liệu cung cấp để chiết xuất cáchợp chất thứ cấp cho việc sản xuất dược liệu còn hạn chế vì thế cần tìm ra cácphương pháp để cải thiện Nuôi cấy tế bào rau má có bổ sung chất kích khángthực vật là một trong những phương pháp tối ưu nhất [11]

Xuất phát từ ý nghĩa trên, tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng

của chất kích kháng thực vật methyl jasmonate lên khả năng tích lũy asiaticoside trong nuôi cấy huyền phù tế bào rau má (Centella asiatica L.).

Nhằm ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật để tăng nhanh quá trình sảnxuất asiaticoside, từ đó cung cấp nguồn dược chất tự nhiên cho các nghiên cứutrong lĩnh vực y học Kết quả của đề tài sẽ làm cơ sở cho việc hoàn chỉnh quytrình sản xuất asiaticoside từ sinh khối tế bào để ứng dụng trong lĩnh vực dượcphẩm sau này

2 Mục tiêu của đề tài

Tăng cường khả năng tích lũy asiaticoside trong quá trình nuôi cấyhuyền phù tế bào rau má bằng cách bổ sung chất kích kháng MeJA

PHẦN 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nuôi cấy mô, tế bào thực vật

1.1.1 Cơ sở khoa học của việc nuôi cấy mô, tế bào thực vật

1.1.1.1 Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là gì?

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật (plant tissue culture) là kỹ thuật đưa một bộphận, mô hoặc tế bào của thực vật vào trong một hệ thống vô trùng có thểkiểm soát về thành phần chất khoáng, điều hòa sinh trưởng, các chất hữu cơcung cấp cho sự sống của cây, các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, độ pH…

để điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có địnhhướng Kỹ thuật này dựa vào hai nguyên tắc chính là tính toàn năng của tế bào

và khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào [7]

1.1.1.2 Tính toàn năng của tế bào

Mỗi tế bào bất kì nào trong cơ thể thực vật đều mang đầy đủ thông tin ditruyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khigặp điều kiện thuận lợi [1]

1.1.1.3 Sự biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào

Một cơ thể thực vật bao gồm rất nhiều loại tế bào, chúng cấu tạo nêncác bộ phận khác nhau của cơ thể với những chức năng đặc trưng riêng.Toàn bộ các tế bào này đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử)

Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưamang riêng biệt (chuyên hóa) Sau đó các tế bào phôi này tiếp tục được biếnđổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu riêng cho các mô, cơ quan khácnhau Đó chính là sự biệt hóa tế bào Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóathành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất đikhả năng biến đổi này của mình Trong điều kiện thích hợp chúng có thể trở

về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là quá trìnhphản biệt hóa tế bào

Dựa vào hai đặc tính trên, con người đã ứng dụng vào khoa học thực tiễnvào tạo nên kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật.

1.1.2 Quy trình nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Từ việc hiểu biết về các nguyên tắc của nuôi cấy tế bào thực vật trongđiều kiện hoàn toàn sạch vi sinh vật, vô trùng, trên môi trường dinh dưỡngnhân tạo, con người đã hình thành nên nhiều lĩnh vực ứng dụng quan trọng

Trong đó, nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống

(micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng hiệu quả nhất Nó bao gồm:

- Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành

- Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh

- Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành

- Nuôi cấy mô sẹo (callus)

- Nuôi cấy huyền phù tế bào

- Nuôi cấy tế bào trần

Trong đề tài nghiên cứu này, chúng sử dụng hai quy trình nuôi cấy mô,

tế bào đó là nuôi cấy mô sẹo và huyền phù tế bào rau má

1.1.2.1 Nuôi cấy mô sẹo (callus)

Nuôi cấy callus cho phép các khối tế bào không có hình dạng nhất địnhtăng lên từ sinh trưởng không phân hóa của mẫu vật trên môi trường dinhdưỡng rắn vô trùng [7] Môi trường nuôi cấy là môi trường dinh dưỡng cơ bản

có chất làm rắn là agar Môi trường dinh dưỡng cơ bản này chứa các chất dinhdưỡng khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn carbon và nhiều loại chất ĐHSTthực vật như: auxin, cytokinin, giberelin… Để đạt được hiệu quả nuôi cấycallus tối đa, cần đánh giá chính xác các ảnh hưởng của thành phần môitrường dinh dưỡng hoặc loại, nồng độ chất ĐHST Các thông số phổ biến nhấtdùng trong đánh giá sinh trưởng trong nuôi cấy callus bao gồm khối lượngtươi, khối lượng khô và chỉ số sinh trưởng

Mẫu vật thường là cơ quan nhỏ hoặc mẫu mô Các khối tế bào này khôngtương ứng với bất kì một mô đặc trưng nào của cây hoàn chỉnh [13]

1.1.2.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào

Nuôi cấy huyền phù tế bào nuôi cấy các tế bào hay khối tế bào, sinhtrưởng phân tán trong môi trưởng lỏng, ở điều kiện vô trùng,( hình 3) Thườngđược khởi đầu bằng cách đặt các khối mô callus dễ vỡ vụn trong môi trườnglỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy), vì thế quy trình phải thực hiện theo thứ tựthực vật đến mẫu vật, tới callus, và cuối cùng tới huyền phù Trong quá trìnhnuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáycủa môi trường Sau một thời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bàođơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu nuôi cấy còn thừachưa phát triển và các tế bào chết Ở đây, có sự biến đổi màu sắc môi trườngnuôi cấy, từ trong trở nên đục do sự xuất hiện của các tế bào đơn Mức độ sinhtrưởng và mức độ tách rời tế bào phụ thuộc vào khả năng tạo nhiều tế bào vỡvụn (friability) và được điều khiển bởi thành phần môi trường, đặc biệt là cácchất điều hoà sinh trưởng [4] Các bình chứa mẫu được đặt trên máy lắc vớitốc độ 50-200 vòng/phút hoặc có thể nuôi cấy trong hệ lên men có hệ thốngkhuấy và sục khí có tác dụng tạo thuận lợi cho sự trao đổi khí, sự lưu thôngcủa môi trường dinh dưỡng trong bình nuôi cũng như gia tăng sự tiếp xúc giữa

tế bào nuôi cấy với môi trường [4]

1.1.3 Môi trường nuôi cấy

Tương ứng với mỗi loại nhóm thực vật, sẽ có các nhu cầu thành phầnchất dinh dưỡng đặc trưng riêng, nhưng để nuôi cấy mô, tế bào thực vật đềucần xuất phát chung từ môi trường cơ bản MS (Phụ lục 2.1) Các nguyên tố đalượng bao gồm các loại muối của nitrogen, potassium, calcium, phosphorus,magnesium, sulfus Các nguyên tố vi lượng bao gồm các loại muối của sắt,kẽm, mangan, boron, copper, acid, pyridoxine, các amino acid, các phụ giahữu cơ (dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein…) Các chất kích thíchsinh trưởng thực vật chủ yếu là các chất ĐHST như các auxin (2,4 D,NAA…), các cytokinin ( BAP, KIN…)

Nguồn carbon sucrose chính là chất thay thế cho nguồn cacbon đượcthực vật cố định từ khí quyển bằng quang hợp Ngoài ra glucose cũng thườngđược đưa vào môi trường và cho hiệu quả mong muốn cao Chất làm rắn môitrường thường được sử dụng là agar.

1.2 Hợp chất thứ cấp, ứng dụng nuôi cấy tế bào để sản xuất hợp chất thứ cấp 1.2.1 Hợp chất thứ cấp là gì?

Khi thực vật chống lại với các tác nhân gây hại từ môi trường chẳng hạnnhư sự tấn công của động vật, vi sinh vật, stress do thay đổi điều kiện môitrường sống…chúng sẽ tạo nên các hợp chất có hoạt tính sinh học được gọi làhợp chất thứ cấp Thường thì thực vật sản xuất chúng với nồng độ rất nhỏ vàchức năng trao đổi chưa biết được đầy đủ [14]

Những nghiên cứu về hợp chất thứ cấp (HCTC) của thực vật phát triển

từ những năm 1950 Có khoảng hơn 30.000 hợp chất được chiết xuất từ thựcvật có hoạt tính và rất có giá trị đối với cuộc sống Những hợp chất này có thểxếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside [7]

1.2.1.1 Các alkaloid

Có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý trêntất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược Họ alkaloid bao gồmcodein, nicotine, caffeine và morphine Một số loài thực vật chứa nhiềualkaloid như: cây thuốc phiện, thuốc lá, cà độc dược…Hoạt tính sinh học củachúng rất đặc biết tác dụng lên hệ thần kinh (caffein), tác dụng lên cơ(veratin), mạch máu (hydastrin)…[8]

1.2.2 Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất hợp chất thứ cấp

Những năm gần đây, những nghiên cứu về tác dụng của các HCTC táchchiết từ thực vật được tiến hành rộng rãi và đạt nhiều thành quả cao Conngười đang dần thay thế nguồn nguyên liệu dược phẩm là các chất hóa họcnhân tạo bằng những HCTC Tuy nhiên, nguồn cung cấp HCTC tách chiếttrong quá trình sinh trưởng của thực vật lại cho năng suất không cao và tốnkém nhiều thời gian Ngoài ra, các nhóm sinh vật khác như vi sinh vật, độngvật lại không thể tạo nên các HCTC này Vì vậy, cần tìm ra giải pháp khắcphục các tình trạng trên, kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất hợp chấtthứ cấp là tiêu biểu cho việc cải thiện chất và lượng của HCTC ứng dụngtrong y dược, gia vị, hương liệu

Ưu thế về mặt nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thểcung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạtchất từ tế bào thực vật nuôi cấy [10] Bằng nhiều nghiên cứu, người ta đã kếtluận được rằng, nồng độ sản xuất hợp chất thứ cấp tăng lên trong suốt quátrình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô có khả năngphân hóa cao như rễ, lá và hoa Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thànhkhông xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp có khuynh hướngngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy Vì vậy, giài pháp trong nuôi cấyhuyền phù tế bào là tăng sự tiếp xúc của khối tế bào ở giữa với môi trườngbên ngoài, dẫn đến sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối

để tạo thành các chất thứ cấp [10] Bên cạnh nuôi cấy tế bào huyền phù, nuôicấy callus có ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫunhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy bé nên khó phát triển ở quy mô côngnghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn dinh dưỡng,những sản phẩm do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụxung quanh dẫn đến làm chậm sự sinh trưởng của tế bào Vì thế, nuôi cấy tếbào huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì cóthể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật ngậpchìm trong môi trường lỏng

1.2.2.1 Sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy

Nuôi cấy tế bào thực vật được nghiên cứu từ năm 1960, có rất nhiềuthuận lợi, và được xem như là một phương pháp để sản xuất các hợp chất thứcấp ở thực vật hiệu quả nhất Một số chất khó tổng hợp bằng phương pháp hóahọc, hoặc khó thu được lượng sản phẩm lớn bằng vi sinh vật thì có thể sửdụng bằng phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật như caffein, morphine… Sở

dĩ, phương pháp này được đánh giá cao vì nó không bị giới hạn bởi yếu tốngoại cảnh như môi trường, sự thay đổi thời tiết… so với khi trồng một cá thểthực vật ở ngoài điều kiện thường [10] Ta có thể so sánh dễ dàng từ bảng 1.2.Cải thiện hiệu suất, chất lượng các sản phẩm có hoạt tính sinh học là mộttrong những hướng đang được ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật

Ưu điểm của chúng bao gồm:

- Con người điều khiển các yếu tố của môi trường nuôi cấy một cách chủđộng trong quá trình tổng hợp các hợp chất thứ cấp Điều này có ý nghĩa rấtquan trọng tạo môi trường tối ưu nhất, đánh giá quá trình ảnh hưởng của cácyếu tố môi trường một cách cụ thể

- Loại đi hay hạn chế ảnh hưởng sinh học (vi sinh vật và côn trùng) đếncác sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tự nhiên

- Tùy thuộc vào tính chất sản phẩm và nồng độ sản xuất HCTC mà conngười chủ động tìm kiếm các loài thực vật phù hợp nhất

- Chủ động tăng nồng độ các chất đang được sản xuất tùy theo mục đích

nhiều thành quả đáng tự hào Một số HCTC đang được sản xuất theo phươngpháp này như taxol từ cây thông đỏ, curcumin ở cây nghệ đen, bilobalit từcây bạch quả Người ta mong đợi nhiều hợp chất có giá trị sử dụng với giá

thành thấp và các sản phẩm nuôi cấy in vitro được thương mại hóa trong thời

16 4 24

10 0,3 1,5

1,6 13,3 16

Berberine Coptis japonica Thalictrum minor 1310 0,014 10003,3

1.1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp của tế bào nuôi cấy

Nguyên tắc sản xuất một hợp chất hóa học nào từ bất kì quá trình sinhhọc nào đều cần phải hiểu rõ các con đường sinh tổng hợp và các yếu tố ảnhhưởng đến nó Từ đó, con người đã nghiên cứu và tìm ra các hướng cải thiệnnăng suất sản xuất của các HCTC từ nuôi cấy tế bào [8] HCTC chỉ được tíchlũy với nồng độ cao và khi thỏa mãn những điều kiện nuôi cấy như sau:

- Chọn lựa đúng và đủ thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấythích hợp

- Các dòng tế bào nuôi cấy phải có năng suất cao

- Luôn bổ sung tiền chất nuôi cấy và các chất kích kháng thực vật

a Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong câytrồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu (ví dụ ginsenoside từ cây

nhân sâm P ginseng, bilobalit từ cây bạch quả…) Thông số của các nhân tố

hóa họ và vật lý như thành phần môi trường, chất kích thích sinh trưởng, pH,nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng ảnh hưởngđến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều [15] Chẳnghạn khi nuôi cấy callus rau má, độ pH của môi trường ban đầu là 5.8; câynghệ đen là 5.9 [9] Tốc độ lắc của nuôi cấy huyền phù tế bào rau má là 120vòng/ phút nhưng với nghệ đen là 150 vòng/ phút [13]

b Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao

Kỹ thuật chọn dòng tế bào đã ra đời rất sớm trong nghiên cứu vi sinh vật.Nhưng ở thực vật bậc cao, kỹ thuật này mới được ứng dụng cách đây khoảnghơn 20 năm Người ta có thể tiến hành xử lý và chọn lọc tế bào thực vật ở bamức độ chính

- Mô sẹo (callus)

- Tế bào đơn (single cell)

- Tế bào trần (protoplast)

Mục đích chọn lọc in vitro có thể khái quát ở những điểm sau:

- Chọn dòng tế bào chống chịu các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh, ví

dụ chống chịu nóng, lạnh, phèn, mặn, khô hạn

- Chọn dòng tế bào kháng các độc tố ví dụ kháng độc tố do nấm bệnhtiết ra, các loại kháng sinh

- Chọn dòng tế bào sản xuất dư thừa (over production) các loại sảnphẩm chủyếu là amino acid

- Chọn các đặc điểm chỉ thị để nghiên cứu di truyền (genetic markers) [8].Năm 1985, Berlin và Sasse đã công bố thành quả việc chọn lọc tế bàodựa vào khả năng tổng hợp một vài chất có giá trị cao trong nuôi cấy tế bào

thực vật Cụ thể, một dòng tế bào của cây bát tiên (Euphorbia milli) sau 24 lần

chọn lọc đã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được tích luỹ từ nuôicấy tế bào bố mẹ [8].

Yu và cs (2005) đã nghiên cứu sự tích luỹ jaceosidin và siringin trongnuôi cấy tế bào của Saussurea medusa bằng chất kích kháng thực vật là SA,kết quả thu được jaceosidin (95 mg/L) cao gấp 2,5 lần và siringin (631 mg/L)cao gấp 2,7 lần so với mẫu không bổ sung SA [26] và còn rất nhiều nhữngnghiên cứu khác.

1.2.2.3 Một số công trình nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy tế bào

Sản xuất hợp chất bằng nuôi cấy tế bào là một hướng nghiên cứu đầytriển vọng trong việc cung cấp các hợp chất thứ cấp trong công nghiệp sảnxuất dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm Trên thế giới đã có nhiều công trìnhnghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy tế bào

Điển hình như việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào các loài Taxus đã

trở thành một trong những ứng dụng rộng rãi của nuôi cấy tế bào thực vật vàđang tạo ra các giá trị thương mại to lớn Sở dĩ, taxol có thể được sử dụngđiều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú Ngoài ra, taxolcũng có tác dụng đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và cácdạng u bướu khác và nó được xem như là chất đầu tiên của một nhóm mớitrong hóa trị liệu ung thư [9]

FettNeto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng

và một số yếu tố khác lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào Taxus

cuspidata Srinivasan và cs (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng

nuôi cấy tế bào của T baccata Lee và cs (1995) đã nghiên cứu sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây T mairei, một loài được tìm thấy tại

Đài Loan ở độ cao 2000 m so với mực nước biển Các dòng tế bào thu được từcallus có nguồn gốc thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổsung các tiền chất vào môi trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịchhuyền phù tế bào sẽ có khoảng 200 mg taxol [7]

Imperatorin được xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các

bệnh về da Nếu sản xuất cây Angelica dahurica var formosana bằng phương

pháp nhân giống truyền thống sẽ mất một thời gian dài mới có thể đáp ứngđược nhu cầu Vì vậy, phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù sản xuấtimperatorin đã được chọn lựa sử dụng Nghiên cứu đã cho thấy, sử dụngBenzylamino purine ở nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợpimperatorin, một tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate và nitrate (2:1) cũng nhưtăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin Bổ sungvanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhấtsau 10 ngày nuôi cấy Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7vào môi trường, quá trình tổng hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôicấy thứ 10 Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi phương thức này đạt 46,0mg/L, cao hơn đối chứng 140 lần [10]

Berberine chloride luôn được biết đến với công dụng chữa bệnh rối loạn

tiêu hóa Nó là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis

japonica và vỏ của cây Phellondendron amurense Để thu được nguyên liệu

thô từ rễ cây C japonica phải mất 5-6 năm Yamada và Sato (1981) đã

nghiên cứu thành công quy trình tách chiết berberine bằng nuôi cấy huyền phù

tế bào C japonica Sau đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải thiện

được năng suất bằng cách thêm 10-8mM gibberellic acid vào môi trường nuôicấy, hiệu suất cao hơn tới 1,66 g/L [7]

Bảng 1.2 Các hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy mô và tế

bào thực vật (Mulbagal and Tsay 2004)

Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo

vệ chống lại các yếu tố gây bệnh Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báohiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp Sử dụng các chất kích kháng của bộmáy bảo vệ cây, tức là sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thuđược các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quảnhất Dựa vào nguồn gốc, chất kích kháng thực vật gồm hai loại là chất kíchkháng sinh học (biotic) và chất kích kháng phi sinh học (abiotic) [9]

Chất kích kháng sinh học bao gồm những chất kích kháng có nguồn gốc

từ cơ thể sinh vật, được phân thành hai loại,chất kích kháng có nguồn gốc nộisinh và chất kích kháng có nguồn gốc ngoại sinh Những chất kích kháng cótrong tế bào thực vật là các polysaccharides như pectin, pectic acid, cellulose.Các chất kích kháng có nguồn gốc từ thành tế bào vi sinh vật như chitin,chitosan và glucans

Chất kích kháng phi sinh học bao gồm các hợp chất được tổng hợp bằngphương pháp hóa học như MeJA, jasmonic acid, salicylic acid (SA),arachidonic acid, Al3+, Cu2+, Mn2+… và một số tác nhân vật lý như sóngsiêu âm [9]

Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng các chất kíchkháng trong nuôi cấy tế bào thực vật (Bảng 1.3), đã cho thấy vai trò quantrọng của chất kích kháng đối với mục đích tăng khả năng tích lũy hợp chấtthứ cấp trong nuôi cấy tế bào [9], [15]

Thời gian bổ sung chất kích kháng vào môi trường nuôi cấy ảnh hưởngđến khả năng tích lũy hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào Tuy nhiên, đểđạt được mục đích nuôi cấy, việc lựa chọn thời điểm bổ sung chất kích khángđòi hỏi phải có sự hiểu biết về con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp

mong muốn Chong và cs (2005) cho rằng, mẫu tế bào Morinda elliptica nuôi

cấy có bổ sung 50µM jasmonic acid tại thời điểm giữa pha log của chu kỳsinh trưởng tế bào, thu mẫu sau 3 ngày, hàm lượng anthraquinone thu được39,6 mg/g khối lượng khô gấp 2,1 lần so với mẫu đối chứng và hai mẫu được

bổ sung cùng nồng độ jasmonic acid ở đầu pha log và pha ổn định Mẫu tế bào

có bổ sung 100µM jasmonic acid ở đầu và giữa pha log, sau 5 ngày thu mẫu,hàm lượng anthraquinone đạt 26,6 và 21,9 mg/g khối lượng khô cao gấp 2,9

và 1,4 lần so với mẫu không bổ sung jasmonic acid [16]

1.3.2 Vai trò chất kích kháng trong nuôi cấy tế bào thực vật

Sử dụng chất kích kháng trong nuôi cấy tế bào thực vật để cải thiện hiệusuất tích lũy các hợp chất thứ cấp là một hướng đi phù hợp trong việc sản xuấtcác tiền chất cho y học, thực phẩm và mỹ phẩm Hầu hết những nghiên cứucho thấy khi bổ sung chất kích kháng vào môi trường nuôi cấy tế bào thực vậtđều làm tăng hàm lượng hợp chất thứ cấp tích lũy được

Janusz Malarz và cs (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của MeJA và SAvào sự tích lũy sesquiterpene lactone trong lông hút ở rễ cây rau diếp xoăn

Cichorium intybus Kết luận bổ sung 100 µM MeJA sau 72 giờ làm tăng gấp

đôi lượng sesquiterpene lactone tích lũy trong tế bào lông hút ở rễ cây raudiếp xoắn so với thí nghiệm đối chứng [23]

Seung- Mi- Kang và cs (2008) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của MeJA và(SA) đến quá trình sản xuất hoạt chất Bilobalit và Ginkgolides trong tế bào

cây Ginkgo biloba Kết quả bổ sung 0.01mM MeJA , mức độ sản xuất

ginkgolides tăng 4.3- và 8,2 lần, bổ sung 0.01 mM SA, mức độ sản xuấtginkgolides trong tế bào tăng lên 5,4 lần so với thí nghiệm đối chứng [25].Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một sốchất kích kháng thực vật lên khả năng tích lũy asiaticoside của tế bào rau mánuôi cấy in vitro, kết luân nồng độ và thời điểm bổ sung tối ưu nhất của YE và

SA để tăng quá trình sản xuất CAS lần lượt là 4 g/L, 100 µM sau 10 ngàynuôi cấy huyền phù tế bào rau má [4]

Bảng 1.3 Vai trò của các chất kích kháng lên việc sản xuất hợp chất thứ

cấp tương ứng ở thực vật (Mulbagal and Tsay 2004)

1.4 Khái quát về cây rau má

1.4.1 Phân loại rau má (Centella asiatica L.)

Rau má, hay còn gọi là tích tuyết thảo hoặc lôi công thảo, là loài cây mộtnăm thân thảo trong họ Hoa tán (Apiaceae) [3]

1.4.2 Phân bố và đặc điểm hình thái

1.4.2.1 Phân bố

Rau má có nguồn gốc từ Australia, Ấn Độ và các đảo Thái BìnhDương… Rau má là loài thực vật thân thảo phổ biến được sử dụng trong y tế,thức ăn và trong công nghiệp mỹ phẩm Ở Việt Nam, rau má mọc hoang khắp

nơi, thường gặp ở các bãi cỏ, bờ ruộng, ven suối, sườn đồi, quanh các làngbản, những vùng ẩm ướt [8]

1.4.2.2 Đặc điểm hình thái

Thân cây rau má gầy và nhẵn, là loại thân bò lan, màu xanh lục hay llụcánh đỏ, có rễ ở các mấu Nó có các lá hình thận, màu xanh với cuống dài vàphần đỉnh lá tròn, kết cấu trơn nhẵn với các gân lá dạng lưới hình chân vịt.Các lá mọc ra từ cuống dài khoảng 5–20 cm Bộ rễ bao gồm các thân rễ, mọcthẳng đứng Chúng có màu trắng kem và được che phủ bằng các lông tơ ở rễ.Hoa rau má có màu trắng hoặc phớt đỏ , mọc thành các tán nhỏ, tròn gầnmặt đất Mỗi hoa được bao phủ một phần trong 2 lá bắc màu xanh Các hoalưỡng tính này khá nhỏ (nhỏ hơn 3 mm), với 5-6 thùy tràng hoa Hoa có 5 nhị

và 2 vòi nhụy Quả có hình mắt lưới dày dặc, đây là điểm phân biệt nó với cácloài trong chi Hydrocotyle có quả với bề mặt trơn, sọc hay giống như mụncơm Quả của nó chín sau 3 tháng và toàn bộ cây, bao gồm cả rễ, được thu háithủ công

1.4.3 Thành phần hóa học

Các phân tích cho thấy thành phần hóa học của rau má gồm: nước88,2%, protein 3,2%, carbohydrate 1,8%, cellulose 4,5%; theo mg%: calcium2,29%, phosphorus 2%, iron 3,1%, β-caroten 1,3%, vitamin B1 0,15% vàvitamin C 37% [8], [19]

Trong cây rau má chứa tinh dầu, dầu béo Chất béo chủ yếu là glyceridecủa các acid: oleic, linolic, linolenic, lignoceric, palmitic và stearic Trong rau

má còn chứa một lượng alkaloid hydrocotylin, chất đắng vellarin và đặc biệt

là glucoside asiaticoside Lượng asiaticoside này khi thủy phân cho asiaticacid và glucose, rhamnose

Ngoài ra, còn có vitamin B và C Thành phần asiaticoside trong mô rau

má chiếm các tỷ lệ như sau: trong lá chiếm 82,6%, trong cuống chiếm 15,9%,trong rễ chiếm 1,5%

1.4.4 Tác dụng dược lý và công dụng của rau má

Đối với các bệnh về tim mạch ở người, rau má có thể giúp giảm sưng vàcải thiện lưu thông trong cơ thể, nhất là với các bệnh liên quan đến tĩnh mạchnhư giãn tĩnh mạch và suy tĩnh mạch [3], [4]

Với các vết thương, rau má có chứa hóa chất được gọi là triterpenoidscócông dụng tăng tốc độ chữa lành vết thương, tăng cường chất chống oxy hóatại vị trí vết thương, tăng cường da và tăng cung cấp máu cho khu vực bịthương, điều này đã được thử nghiệm trên chuột [3], [4]

Triterpenoids trong rau má cũng có thể làm giảm sự lo lắng và tăngcường chức năng tâm thần trong một số cá nhân Theo một nghiên cứu, xuấtbản trong tạp chí Journal of Clinical Psychopharmacology năm 2000, nhữngngười tiêu thụ rau má có thể giảm sự giật mình đi rất nhiều [3], [4]

Ngoài ra, rau má còn có rất nhiều công dụng khác Từ xa xưa, các thầylang đã biết dùng rau má để điều trị cho các bệnh như bệnh vẩy nến, eczema,nhiễm trùng hô hấp, viêm loét, cảm lạnh, viêm gan, động kinh, mệt mỏi, sốt,hen suyễn và bệnh giang mai

Trong y học Trung Quốc, rau má cũng được biết đến là loại thảo dược

"nguồn mạch sự sống" bởi vì nó giúp làm tăng tuổi thọ Mặc dù nghiên cứukhoa học vẫn chưa chứng minh hiệu quả của của loại thảo dược này đối vớicác rối loạn trong cơ thể, nhưng người ta cũng không phủ nhận tác dụng củarau má trong việc điều trị chứng mất ngủ, xơ cứng bì, ung thư, rối loạn tuầnhoàn, tăng huyết áp, mất trí nhớ, liền sẹo và giảm nốt cục trên da cellulite [3],[4] Một số bài thuốc từ rau má điều trị các bệnh như: chữa mụn nhọt, chữavàng da, kiết lỵ, chảy máu cam

1.5 Khái quát asiaticoside

1.5.1 Khái niệm

Một trong số hoạt chất chiết xuất từ rau má là asiaticoside, công thứcphân tử là C48 H78O19 Tên gọi hóa học đầy đủ là:

oxan2-yl) oxyoxan-2-yl]oxymethyl]-3, 4, 5-trihydroxy-oxan-2-yl](1S, 2R, 4aS,6aS, 6bR, 9S, 10R, 11R, 12aS, 14bR)-10, 11-dihydroxy-9-(hydroxymethyl) 1, 2,

[6-[[3,4-Dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-(3,4,5-trihydroxy-6-methyl-6a, 6b, 9, 12 ahexa-methyl 2,3,4,5,6,[6-[[3,4-Dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-(3,4,5-trihydroxy-6-methyl-6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydro-1H-picene4a-carbo-xylate [19]

2,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydro-1.5.2 Tính chất lý hóa của asiaticoside

Asiaticoside tan tốt trong cồn, sản phẩm tinh thể hình kim màu trắng,nhiệt độ nóng chảy là 230 đến 2330C [19]

1.5.3 Tác dụng dược lý của asiaticoside

Từ những năm 1940, y học hiện đại bắt đầu nghiên cứu những tác dụngcủa rau má Những hợp chất chính có giá trị ở rau má là asiaticoside,madecassoside và asiatic acid đã được phát hiện, nghiên cứu và ứng dụng.Trong đó, asiaticoside là một triterpene glycoside và phân loại như một khángsinh Asiaticoside là 1-O-acyl-D-glucose pyranose được tìm thấy trong tựnhiên, nó là trisacharide ester của acid asiatic Người ta cho rằng, trong cơ thểasiaticoside thủy phân thành đường và asiatic acid- sản phẩm trao ñổi chấtchịu trách nhiệm trong việc chữa bệnh Asiaticoside có khả năng khángkhuẩn và hoạt tính diệt nấm chống lại được mầm bệnh và nấm

Asiaticoside giúp chữa lành vết thương nhanh chóng nhờ vào cơ chế kíchthích tạo collagen và sự tổng hợp glycosaminoglycan

Hoạt chất asiaticoside cũng đã được ứng dụng trong điều trị bệnh phong

và bệnh lao Người ta cho rằng trong những bệnh này, vi khuẩn được bao phủbởi một màng ngoài giống như sáp khiến cho hệ kháng nhiễm của cơ thểkhông thể tiếp cận Chất asiaticoside trong dịch chiết rau má có thể làm tanlớp màng bao này để hệ thống miễn dịch của cơ thể tiêu diệt chúng

Maquart và cs (1990) đã công bố công trình nghiên cứu về khả năng làmlành vết thương bị lở loét của asiaticoside Dược tính đáng kể của hoạt chất này

là giảm bớt kích thước của vùng vết thương trên da ở lưng chuột sau 9 ngày thửnghiệm Theo nghiên cứu của Inhee và cộng sự (1999) cho thấy, các dẫn xuấtcủa chất asiaticoside có khả năng bảo vệ thần kinh, chống lại độc tố βamyloidgây hại ñối với nơtron thần kinh…Asiaticoside giúp tế bào da chống oxy hóa,phát triển mô liên kết, nên làm mạnh tế bào da, mô da căng trẻ, và giúp cho vết

mổ, vết loét mau lành Asiaticoside có trong dịch chiết đã làm giảm bớt bàn

chân phình của chuột thử nghiệm Cơ chế tích cực của asiaticoside có thể liênquan ñến việc ngăn chặn sự tăng nhanh của bạch cầu [5].

1.5.3 Con đường sinh tổng hợp asiaticoside

Asiaticoside là một hợp chất trong nhóm triterpenes Dựa vào mối quan

hệ về bộ khung carbon với α-amyrin và β-amyrin mà người ta chia thành 2loại asiaticoside: asiaticoside (có bộ khung carbon của α-amyrin) vàasiaticoside B (có bộ khung carbon của β-amyrin) Con đường sinh tổng hợpasiaticoside trải qua nhiều giai đoạn với sự tham gia của nhiều enzyme và cácchất chuyển hóa trung gian Trong đó, đã có nhiều công trình nghiên cứu vềcon đường này, chủ yếu là mức độ biểu hiện của các gen mã hóa cho cácenzyme tham gia trong chu trình Kim và cs (2010) phân tích mức độ biểuhiện gen mã hóa cho enzyme farnesyl diphosphate synthase (FPS) và gen mãhóa enzyme β-amyrin synthase (bAS) trong nuôi cấy rễ tơ rau má có bổ sungchất kích kháng MeJA Kết quả cho thấy hai enzyme FPS và bAS ảnh hưởngđến sự tổng hợp triterpenens, mức độ biểu hiện của hai gen này tăng sau 12 h

bổ sung bằng MeJA còn hàm lượng triterpenes tăng sau đó 15 ngày Bonfill

và cs (2010) nghiên cứu mức độ biểu hiện gen mã hóa cho enzyme: bAS,cycloartenol synthase (cYS) và squalene synthase (SQS) trong con đường sinhtổng hợp centelloside và phytosterol khi nuôi cấy tế bào rau má có bổ sungMeJA Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự tương quan về mặt hàm lượngcentelloside và mức độ biểu hiện của hai gen mã hóa cho hai enzyme bAS vàSQS Tuy nhiên, có sự chậm trễ giữa hoạt động của gen mã hóa enzyme bAS(sau 12 h nuôi cấy kể từ khi bổ sung MeJA) so với thời gian thu được hàmcentelloside cực đai (sau 15 ngày nuôi cấy) Như vậy, bAS không phải là mộtenzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp centelloside nói chung vàasiaticoside nói riêng

Điều này có thể được giải thích rằng bộ khung carbon của asiaticoside cómối quan hệ với α-amyrin hơn là β-amyrin (Kim và cs 2010; Hernández-Vázquez và cs 2010) Trong khi đó, vai trò của enzyme MFS (multifunctionaltriterpene synthase) có liên quan mật thiết đối với con đường sinh tổng hợpasiaticoside vẫn chưa được nghiên cứu [13], [18 ], [19]

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Rau má (Centella asiatica L.) hay còn gọi là tích tuyết thảo, lôi công thảo, liên tiền thảo [6].

Loài Centella asiatica L.

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Công nghệ sinhhọc, Đại học Huế

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 10/ 2014 đến tháng 5/2014

2.3 Nguyên liệu và trang thiết bị

2.3.1.Nguyên liệu nghiên cứu

Callus của rau má (Centella asiatica L.), do nhóm nghiên cứu GS.

Nguyễn Hoàng Lộc cung cấp

2.3.2 Hóa chất

KNO3; KH2PO4; NH4NO3; MgSO4.7H2O; H3BO4; MnSO4.4H2O;CuCl2.6H2O; MeJA; CuSO4.5H2O; ZnSO4.4H2O; Na2MoO4.2H2O; KI; cồn; agar

2.3.3 Môi trường

2.3.3.3 Môi trường nuôi cấy callus

- Môi trường cơ bản (Phụ lục 2.1) Tùy vào loại, tính chất tế bào nuôicấy mà ta bổ sung các chất kích thích sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau

- Môi trường R1: MS + 1 mg/L NAA + 2 mg/l BAP + 30 g/L sucrose +9g/L agar