Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng phòng trừ nấm gây bệnh hại hạt giống lúa

Xác định thành phần bệnh nấm hại hạt giống lúa thu thập năm 2010 tại khu vực Hà Nội và phụ cận. Thử nghiệm một số chất kích kháng nhằm tạo miễn dịch phòng chống bệnh nấm hại hạt giống lúa trong điều kiện nhà lưới và phòng thí nghiệm.

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực chính của hơn một nửa dân số

thế giới, tập trung tại các nước châu Á, châu Phi và châu Mỹ La tinh Lúa gạo

có vai trò quan trọng trong việc đảm bảo an ninh lương thực và ổn định xã hội Theo dự báo của FAO (Food and Agricuture Organization), thế giới đang

có nguy cơ thiếu hụt lương thực do dân số tăng nhanh, sức mua lương thực, thực phẩm tại nhiều nước tăng, biến đổi khí hậu toàn cầu gây hiểm họa khô hạn, bão lụt, quá trình đô thị hoá làm giảm đất trồng lúa, nhiều nước phải dành đất, nước để trồng cây nhiên liệu sinh học vì sự khan hiếm nguồn nhiên liệu rất cần thiết cho nhu cầu đời sống và công nghiệp phát triển Chính vì vậy, an ninh lương thực là vấn đề cấp thiết hàng đầu của thế giới ở hiện tại và trong tương lai

Vấn đề bệnh trên cây lúa là một trong những vấn đề có ảnh hưởng không nhỏ tới năng suất và phẩm chất cây lúa, trong đó nhóm bệnh hại do nấm là một trong những đối tượng gây hại rất đáng quan tâm trong sản xuất lúa

Để phòng trừ những bệnh này, cho đến nay thì biện pháp hóa học vẫn

là phổ biến Tuy nhiên, biện pháp này vẫn còn nhiều hạn chế, một mặt do đặc điểm phát triển của nấm bệnh, mặt khác do nông dân chỉ sử dụng thuốc khi bệnh quá nặng, ngoài ra biện pháp này còn gây ô nhiễm môi trường và để lại

dư lượng trên nông sản

Biện pháp sử dụng giống kháng bệnh cũng gặp trở ngại vì nấm bệnh dễ phát sinh ra nòi mới phá vỡ tính kháng (Kiyosawa S, 1989; Way và Heong, 1994; Noda và ctv, 1998)

Hiện tượng kích thích tính kháng bệnh lưu dẫn (system acquired resistanca, SAR), gọi tắt là kích kháng, giúp kích thích phản ứng tự vệ của

cây chống lại bệnh hại, đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu từ năm 1933 (Chester, 1933) và đến nay các nhà khoa học cũng đã hiểu khá nhiều về các cơ chế của tính kích kháng (Phạm Văn Kim, 2006) với nhiều kết quả khả quan Kích kháng là sử dụng một tác nhân, có thể là vi sinh vật hoặc một hóa chất không gây ô nhiễm môi trường, tác động lên một bộ phận của cây thuộc giống nhiễm, qua đó sự kích thích sự hoạt động của các cơ chế kháng bệnh có trong cây kịp thời giúp cây kháng lại bệnh khi bị mầm bệnh tấn công.

Trên cây lúa, các nghiên cứu sự kích kháng giúp cây lúa kháng với bệnh đạo ôn đã được nghiên cứu và tập trung vào 3 lĩnh vực: (i) tìm ra các tác nhân kích kháng, (ii) nghiên cứu các cơ chế kích kháng của các tác nhân có triển vọng trên khía cạnh mô học, (iii) nghiên cứu các cơ chế kích kháng của các tác nhân có triển vọng trên khía cạnh sinh học

Hiện nay nhiều nước trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng chất kháng như clorua đồng và Oxalic Acid và cả các dịch chiết thực vật, kết hợp với việc sử dụng gen kháng để tạo hiệu quả phòng trừ bệnh nấm hại lúa có hiệu quả hơn Xuất phát từ nhu cầu thực tế sản xuất chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng phòng trừ

nấm gây bệnh hại hạt giống lúa”.

1.2 Mục đích-Yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Xác định thành phần bệnh nấm hại hạt giống lúa thu thập năm 2010 tại khu vực Hà Nội và phụ cận Thử nghiệm một số chất kích kháng nhằm tạo miễn dịch phòng chống bệnh nấm hại hạt giống lúa trong điều kiện nhà lưới và phòng thí nghiệm

1.2.2 Yêu cầu

- Xác định thành phần bệnh nấm hại các mẫu hạt giống lúa thu thập năm 2010 tại khu vực Hà Nội và phụ cận

- Thử nghiệm một số chất kích kháng như clorua đồng nồng độ

0.05mM, oxalic acid nồng độ 1mM, 2mM, 4mM và Bion nồng độ 200ppm nhằm hạn chế một số nấm gây bệnh trên hạt lúa

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng đến tỷ lệ nảy mầm và sức sống của mạ

- Xác định hiệu quả của chất kích kháng phòng trừ bệnh nấm hại hạt giống lúa

PHẦN 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cơ chế kháng bệnh ở thực vật

Đến nay kiến thức của nhân loại đã tiến khá sâu vào lĩnh vực miễn dịch của thực vật đối với bệnh Bên cạnh việc tiến rất sâu vào khía cạnh phân tử của các gen kháng bệnh, các nhà khoa học còn đi sâu dần vào cơ chế của sự kháng bệnh để từ đó đưa ra được biện pháp kích thích tính kháng bệnh tự nhiên của cây trồng

Sau khi tìm hiểu về cơ chế kháng bệnh ở thực vật người ta phân thành hai nhóm: Nhóm cơ chế thuộc về sinh hóa học và nhóm cơ chế thuộc cấu trúc

mô học

Cơ chế kháng bệnh thuộc về sinh hóa học.

Sau khi bị vi sinh vật tấn công để gây bệnh, nơi bị xâm nhiễm tiết ra một loạt các hợp chất chống vi sinh vật, các protein liên quan đến bệnh, các enzim để làm giảm hoạt động của mầm bệnh và nhiều chất khác

Về hợp chất chống vi sinh vật có thể chia ra 2 nhóm: Nhóm phytoanticipins và nhóm phytoaleuxins Phytoaleuxins do ký chủ tiết ra để chống lại với mầm bệnh, trong khi đó phytoanticipins không phải do ký chủ trực tiếp tiết ra mà do sự tương tác giữa các chất của ký sinh và ký chủ tạo ra Hai nhóm này có thể tìm thấy trong các giống có tính kháng bệnh cao

Bên cạnh đó một loạt các protein có liên quan đến bệnh cây cũng được

tế bào tiết ra Các protein này có vai trò làm giảm sự phát triển của mầm bệnh bằng cách tác động lên vách tế bào, màng nguyên sinh chất hoặc lên ribosom của vi sinh vât Các protein này được xếp vào 18 họ protein trong đó 12 protein được biết đến với tên là PR-1, PR-2, PR-3, PR-4, PR-5, PR-8, PR-11, protein bất hoạt ribosom, protein chuyển hóa chất béo nsLTPs, AMPs , thionins, Vai trò của các protein này được tóm lược như sau: PR-2 (β-1,3-glucanase) có vai trò trong phân hủy thành β-1,3glucan và β-1,6 glucan của

vách tế bào vi sinh vật Hai nhóm enzim β-1,3-glucanase và chitinase có tác động hỗ trợ nhau làm tăng hiệu quả trong sự phân hủy vách tế bào của mầm bệnh.

Bên cạnh đó một loạt các enzim khác cũng được hình thành trong tế bào bị nấm bệnh xâm nhiễm với vai trò chuyển hóa các chất độc do mầm bệnh tiết ra hoặc trung hòa độc tính của các chất do tế bào cây tiết ra khi phản ứng lại mầm bệnh, các chất này khi ở nồng cao có thể gây hại cho tế bào cây Trong đó có thể kể đến 2 enzim có liên quan đến bệnh cây như PAL (phenylalanine ammonia lyase), peroxidase PAL có vai trò thúc đẩy sự sinh tổng hợp các hợp chất polyphenol, là chất quan trọng trong sự chống bệnh của cây trồng Còn peroxidase có nhiều vai trò trong đó có vai trò khử H2O2

và vai trò phối hợp với PAL trong việc giúp lignin hóa vách tế bào bị tấn công qua đó ngăn cản cơ học sự lan ra xa hơn của nấm gây bệnh H2O2 được tích tụ trong tế bào với nhiệm vụ oxy hóa các chất độc do nấm tiết ra, Oxy hóa các polyphenol làm cho các polyphenol không còn độc đối với tế bào, nhưng H2O2 với nồng độ cao lại gây hại cho tế bào Do đó Peroxidase làm giảm bớt tính độc của H2O2 đối với tế bào ký chủ

Bên cạnh sự ra tăng hoạt tính của các enzim còn xuất hiện các tín hiệu

do sự kích kháng gợi lên Các tín hiệu bao gồm: salycilic acid, Jasmonic acid

và etylen

Cơ chế kháng bệnh thuộc về cấu trúc mô học.

Có 4 cơ chế kháng bệnh về mặt mô học, tùy thuộc vào 4 cách xâm nhập của nấm gây bệnh

- Sự tạo ra lớp vách tế bào mới chung quanh vết thương để bao vây và ngăn cản sự xâm nhập tiếp theo của các nấm có tính ký sinh yếu, chỉ xâm nhập qua vết thương

- Sự rắn chắc hóa vách tế bào bằng cách lignin hóa vách tế bào bị nấm xâm nhiễm

- Sự hình thành papillae (vách dầy) bên dưới đĩa áp để ngăn cản sự xâm nhập của nấm gây bệnh.

- Tích tụ hợp chất phenol đưa đến phản ứng tự chết của tế bào để cô lập nấm gây bệnh Là phản ứng kháng bệnh ở mức cao của thực vật

* Quan sát sự thay đổi của mô để đánh giá hiệu quả của kích kháng

- Để khảo sát sự tăng cường lignin hóa vách tế bào, nơi bị mầm bệnh xâm nhiếm, số vách tế bào phát sáng được đếm dưới kính hiển vi huỳnh quang:

+ Lúa sau khi lây bệnh nhân tạo 24h và 48h: cắt từng đoạn ngắn 4 -5

cm sau đó tẩy diệp lục tố bằng dung dịch ethanol – acid acetic (3:1) và tồn trữ trong trong lactoglyceron (lactic acid: 1; glyceron: 1; nước cất: 1) mẫu được quan sát bằng dung dịch Evans blue 0,01% và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang bước sóng 400 – 440 nm

+ Các chỉ tiêu được quan sát: Dưới kính hiển vi huỳnh quang, những tế bào có phản ứng phát sáng sẽ có màu vàng sáng Các chỉ tiêu được quan sát bao gồm phần trăm phát sáng đơn và đa tế bào, diện tích và số vách tế bào phát sáng trung bình trên mỗi đĩa áp và các mức độ phát sáng của tế bào (+, ++, +++) ( 2002)

Sự so sánh số liệu giữa thí nghiệm kích kháng và đối chứng giúp chúng ta thấy được cơ chế tăng cường lignin hóa do kích kháng gợi ra

- Khảo sát sự tích tụ polyphenol

Thí nghiệm nhằm khảo sát phản ứng của tế bào thông qua sự tổng hợp polyphenol Thí nghiệm được bố trí tương tự như thí nghiệm khảo sát phản ứng phát sáng của tế bào được mô tả ở phần trên Mẫu lá được quan sát vào thời điểm 24, 48, 72, 96h sau khi lây bệnh nhân tạo Hợp chất phenol được chỉ thị bằng màu xanh lá cây sau khi lá cây được nhuộm với Toluidine Blue O (0,05% ph 6,8) ở nhiệt độ 400C trong 4h quan sát dưới kính hiển vi thường Chỉ tiêu ghi nhận bao gồm số lượng đĩa áp có sự tích tụ Polyphenol, và diện

tích vùng tế bào có sự tích tụ polyphenol được tính theo công thức tính diện tích hình chữ nhật.

- Khảo sát sự tích tụ H2O2: Bố trí thí nghiệm tương tự như các thí nghiệm trên Mẫu thu thập ở các thời điểm 4h trước khi nấm xâm nhiễm và thời điểm 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 36 và 48h sau khi nấm xâm nhiễm, sau đó nhuộm với dung dịch 0,05% DAB (3,3’ – diaminobenzidine, D – 8001, Sigma) Theo phương pháp của Thordal – Christensen et al (1997) Ghi nhận phần trăm đĩa áp tích tụ H2O2, diện tích vùng tế bào có sự tích tụ H2O2 và mức

cơ chế tự vệ tự nhiên trong mô cây Chất kích kháng có thể là một loài vi sinh vật không gây bệnh, không mang tính độc đối với cây trồng hoặc có thể là một loại hóa chất nào đó không độc và không có tác động trực tiếp diệt mầm bệnh như hóa chất được dùng trong nông dược (Phạm Văn Kim, 2002) Theo

Tuzun và Kuc (1991) được Ngô Thành Trí và ctv (2004) cho rằng sự kích

thích tính kháng đã được tìm thấy trên 25 loại cây trồng khác nhau khả năng kích kháng của cây có thể biểu hiện về mặt cấu trúc hay sinh hóa, có thể tác động tại chỗ hay lưu dẫn đến các bộ phận khác của cây (Agrios, 1997)

2.2.2 Cơ chế kích kháng.

Ở cây trồng, trong tế bào cây có các gen giúp tế bào cây tiết ra các chất

có khả năng kháng lại với một loại bệnh nào đó Trong điều kiện bình thường, các gen này luôn bị một gen ức chế nằm bên cạnh ức chế

Khi ta tác động các tác nhân gây kích kháng bằng cách ngâm hạt, rễ, hay phun lên lá, tác nhân này tác động lên bề mặt lá, kích thích các thụ thể này tạo ra tín hiệu (là những dòng ion hay tín hiệu điện tử trong cây) (Steiner, 1995) sau đó, chuyển tín hiệu này vào nhân của tế bào và tác động vào gen ức chế, làm cho gen ức chế không còn ức chế các gen giúp tế bào cây tiết ra các chất kháng bệnh Nhờ các chất kháng bệnh này mà cây trồng từ nhiễm bệnh trở thành kháng bệnh (Phạm Văn Kim, 2002)

2.2.3 Các loại kích kháng.

Kích kháng tại chỗ (local induced restance).

Hiệu quả kích thích tính kháng chỉ xảy ra tại vị trí được xử lý bởi các tác nhân kích kháng Có nghiên cứu về hiện tượng này rất phong phú trên nhiều loại cây trồng khác nhau Xử dụng chất syringolin tiết ra từ vi khuẩn

Pseudomonas syringae pv syringae kích thích tính kháng tại chỗ với nấm gây bệnh cháy lá lúa Pyricularia oryzae (Waspi U và ctv., 2000) Phun

monopotassium phosphat (KH2PO4) 1% lên ớt kích thích tính kháng với bệnh

phấn trắng do Leveillula taurica (Reuveni và ctv, 1998)

Kích kháng lưu dẫn (systemic acquired resistance: SAR)

Tính kháng không chỉ thể hiện tại vị trí được xử lý bởi tác nhân kích kháng mà còn truyền đến những mô cây cách xa nơi được xử lý kích kháng

(Ryal và ctv, 1996) Những tác nhân này có cả tác nhân sinh học và không

phải sinh học Khi xử lý kích kháng bằng biện pháp ngâm hạt nhưng cây có khả năng tự vệ kháng lại các bệnh trên lá cũng thể hiện kích kháng lưu dẫn Kích kháng lưu dẫn khác với kích kháng tại chỗ ở những tín hiệu có khả năng truyền đến các mô của cây khác cách xa điểm xử lý kích kháng và làm nâng

cao khả năng tự vệ trong cây (Van Loon và ctv, 1998) Manandhar và ctv

(1998) kích thích tính kháng lưu dẫn chống bệnh cháy lá lúa bằng cách sử

dụng dòng nấm Pyricularia oryzae không độc tính và nấm Bipolaris sorokiniana không những làm giảm bệnh đạo ôn mà còn làm tăng năng suất

lúa

2.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng

2.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Kỹ thuật kích kháng tính kháng lưu dẫn trong cây trồng là kỹ thuật sử dụng một loài vi sinh vật nào đó không gây hại cho môi trường hoặc là một hóa chất nào đó không có tác dụng diệt vi sinh vật gây bệnh cũng như không gây ô nhiễm môi trường nhưng có tác dụng kích thích cây trồng tạo ra tính kháng bệnh Kỹ thuật đã được nghiên cứu ứng dụng thành công trên thế giới

và trên một số loài cây trồng như dưa leo, cà chua, lúa mạch, lúa (Hammerschmidt at al., 1995; Ozeretskovskaya, 1995; Jorgensen et al., 1990; Manandhar et al., 1998)

Trên thế giới việc nghiên cứu kích thích tính kháng bệnh bắt đầu nghiên cứu từ năm 1936 (Mauch-Mani và Metraux, 1997; Van loon, 2001) sau đó rất nhiều tác giả đã nghiên cứu sâu vào cơ chế kích kháng bệnh trên nhiều loài cây ngắn ngày và đã phát hiện ra nhiều tác nhân kích kháng khác nhau Thông thường mầm bệnh thuộc chủng yếu đối với giống ấy, thường tạo được phản ứng kích kháng (Fink và ctv.,1990) và được rất nhiều tác giả sử dụng trong nghiên cứu kích kháng Tuy nhiên tác nhân này chỉ để nghiên cứu không thể áp dụng được, vì chủng mầm bệnh này có thể trở nên độc đối với giống khác có ngoài sản xuất

Theo Ebrahim và Schonbeck (1985) được Trịnh Ngọc Thúy (2000)

trích dẫn cho rằng chủng nấm Erysiphe graminis trên lá lúa mạch, sau 2 ngày cây có tính kháng đối với nấm Erysiphe graminis f.sp hordei gây bệnh phấn

trắng

Theo Ouyang và ctv (1987), xử lý mạ bằng độc tố nấm Magnaporthe grisea làm cho hoạt động của enzyme phenylalanine ammonia lyase và CoA lyase trong cây tăng, giúp tạo tính kháng đối với Magnaporthe grisea.

Theo Sengupta và Sinha (1987), xử lý hạt với cupric chloride kiểm soát tốt bệnh cháy lá trong các mùa vụ khác nhau

Sawati và ctv (1988), chủng Acrocylindirum oryzae vào cây lúa làm

tăng hoạt động của enzyme peroxidase và polyphenol oxydase giúp cây có khả năng hạn chế bệnh

Theo Doubrava et al (1988), thấy rằng oxalic acid có khả năng kích

kháng bệnh do C.lagenarium trên cây dưa leo.

Pelcz (1989), chủng vào lúa mạch dòng nấm Erysiphe 75202 không

đọc, cây tạo tính kháng đối với các dòng nấm phổ biến

Kunoh và ctv (1989), chủng nấm Erysiphe pisi vào lúa mạch trước nấm Erysiphe graminis với khoảng thời gian 30 phút, 1 giờ, 2 giờ sẽ làm giảm độ độc của nấm Erysiphe graminis lần lượt là 35%, 22% và 5,8%.

Theo Gregerson và Smedegaad (1989) được Ngô thành Trí và ctv (2004) trích dẫn thấy rằng ở loài nấm hoại sinh Cladosporium macrocarpum

cũng có khả năng gây kích kháng, giúp lúa mạc chống lại bệnh phấn trắng

Theo Vilich và Neltrien (1990) được Trịnh Ngọc Thúy (2000) trích

dẫn, chủng hợp Erysiphe graminis f.sp avenae và Puccinia coronata f.sp avenae vào lúa mạch, làm giảm độ độc của nấm Erysiphe graminis f.sp hordei 38%.

Yamada và ctv (1990), đã sử dụng methanol trích từ hạt lúa mì và lúa mạch để chống nấm Pyricularia oryzae rất mạnh.

Yokoyama và ctv (1991), chủng nấm Erysiphe graminis f.sp hordei vào

cây lúa mạch, làm cây lúa mạch tạo ra các papilla bên dưới đĩa áp của nấm gây bệnh, giúp chống lại sự xâm nhập của nấm này

Theo Van Peer (1991) do Tuzun và Klopper (1995) trích dẫn nhận thấy,

xử lý vi khuẩn vùng rễ Pseudomonas sp Chủng WCS 417 lên cây hoa cẩm

chướng, giúp cây tăng tính kháng chống lại bệnh héo rũ

SA, acetyl salicytic acid (ASA), di-potassium photphate (K2HPO4), CuCl2, sodium salicylate … cũng được ghi nhận có khả năng kích kháng bệnh

cháy lá lúa (Manandhar et al 1998, Kloepper et al 1992).

Phun SiO2 dạng bột mịn (SiO2) cho thấy kích kháng SAR do gia tăng hoạt động của phân hóa tố đối với chitin (Schneider và Ulrich, 1994)

Song và ctv (1994), cho rằng sử dụng hai acid béo 11(s), 12(s),

trihydroxy-(9z,15z)-octadecadienoic acid và 11(R)-hydroxy-12(s), epoxy-(9z, 15z)-octadecadienoic acid, phun qua lá trước hay sau khi nhiễm bệnh giúp tăng tính kháng bệnh của lúa đối với bệnh cháy lá lúa và giúp giảm bệnh hơn 50%

13(s)-Theo Kristen và ctv do Steiner và Schonbecj (1995) trích dẫn cho rằng, các chất chiết từ bào tử Erysiphe graminis f.sp hordei có khả năng kích kháng

chống lại bệnh mốc sương trên cây lúa mạch

Hammerschmidt và Kuc (1995), trên cây lúa mạch được xử lý với dịch trích thực vật từ những loài cây có tính chất dùng trong mỹ phẩm, giúp cây lúa mạch giảm hơn 90% bệnh mốc sương

Theo Arvind và ctv (1995) do Nguyễn Minh Kiệt (2003) trích dẫn thấy rằng khi tiêm chủng vi khuẩn X campestris pv oryzae đã bị giết chết lên cây

lúa có tính nhiễm với bệnh bạc lá, 7 ngày sau, ông tiêm chủng lại cho cây lúa

ấy với vi khuẩn sống, cây lúa tỏ ra kháng với bệnh

Salicylic acid (SA) trong cây lúa và cây thuốc lá được tổng hợp từ cinnamic acid qua benzoic acid Khi tiêm chủng vi khuẩn không gây bệnh

Pseudomonas syrinae D20 hoặc chủng nấm gây bệnh Magnaporthe grisae trong cây thì thấy có tương quan đến tính kháng bệnh (Silverman và ctv,

1995)

Theo Thieron và ctv (1995) cây lúa được xử lý bằng chất PAL và cinnamyl-alcoho-dehydrogenase sẽ có tính kháng với nấm Magnaporthe grisea.

Theo Rajoppan và ctv (1995), xử lý nickel nitrate trên callus ở cây lúa có

tác dụng làm tăng hoạt động của Phenylalanine amonialyase và peroxidase, sẽ

kích kháng đối với bệnh bạc lá lúa do Xanthomonas campestris pv oryzae …

SA bảo vệ cây lúa ở giai đoạn mạ chống lại bệnh đạo ôn lúa (Cai và Zheng, 1996), và giúp cây lúa mạch chống lại bệnh mốc sương

Phun SA 0,01mM lên lá mạ, thì SA kích thích làm cho hai chất phenylalanine amonialyase (PAL) và peroxidase (POD) hoạt động trong cây tăng lên, khi đó hàm lượng lignin cũng tăng lên và tích lũy độc tố monilactone, là một chất kháng sinh thực vật giúp kìm hãm sự nảy mầm

Magnaporthe grisea theo Cai và ctv (1996).

Cai (1996 và 1997) xử lý mạ bằng salicylic acid (SA) 0,01mM, sau 2 –

5 ngày thì chủng bào tử nấm Magnaporthe grisea lên cây lúa giúp giảm bệnh

đạo ôn lúa từ 24 – 59%

Agrios (1997) cho rằng, có thể xử lý bằng Protein hay glycoprotein

trích từ vi khuẩn Pseudomonas solanacearum, lipid trích từ nấm Phytophthora infestans, hay polysaccharide từ nấm để kích kháng cây trồng.

Theo Krishnamurthy và Gnanamanickam (1997), vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens 7 – 14 và P patida v14 sống trong mô thực vật gây

cảm ứng hệ thống kháng làm giảm bệnh đốm vòng

Theo Manandhar và ctv (1998) cho rằng, cây lúa được chủng lên với nấm Bipolaris sorokiriana không độc, giúp cây lúa giảm bệnh đạo ôn và làm

tăng năng suất lúa

SA cũng kích thích tính kháng bệnh trên dưa leo chống lại nấm

Colletotrichum và trên lúa mạch chống lại bệnh phấn trắng do nấm Erysiphe

graminis f.sp hordei theo Manandhar (1998) Cũng theo tác giả này, K2HPO4

gây ra tính kháng bệnh trên cây dưa leo, nho và bắp

Theo Manandhar (1998), xử lý cây lúa với chất ferric chioride, KH2PO4, probenazole và SA thì các chất này có khả năng làm cho cây lúa tiết

ra chất kháng sinh thực vật gây kích kháng chống lại nấm Magnaporthe grisea.

Manandhar và ctv (1998), nói rằng Yoshida (1992) đã sử dụng chất

2,6-dichloro-iso-nicotinitinamid là tác nhân làm tăng hoạt động của jasmonic acid trong cây lúa nhằm kìm hãm sự phát triển của bệnh cháy lá lúa và cho rằng chất này là chất có khả năng kích kháng chống lại bệnh do nấm

Theo Ishii và ctv (1999) do Ngô Thành Trí và ctv (2004) trích dẫn cho

rằng, acibenzolar-S-methyl có hiệu quả kích thích tính kháng trên cây dưa leo chống lại bệnh thán thư, bệnh ghẻ, bệnh gỉ sắt

2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước.

2.3.2.1 Nghiên cứu về sử dụng chất kích kháng.

Ở nước ta, lĩnh vực bệnh hại hạt giống cây trồng nông nghiệp nói chung và trên cây lúa nói riêng chưa được đi sâu nghiên cứu Trong nhiều năm qua chủ yếu chúng ta vẫn đi sâu nghiên cứu thành phần bệnh hại trên cây lúa ở các giai đoạn sinh trưởng và phát triển ngoài đồng ruộng Trong những năm gần đây, do sự phát sinh gây hại đáng kể của một số loại bệnh trên lúa

như bệnh đen lép hạt, bệnh biến màu hạt…, cùng với sự tài trợ của UNDP và sự đầu tư của Chính phủ thông qua dự án VIE/86/002, có sự giúp đỡ của Viện Bệnh hạt giống của Chính phủ Đan Mạch, một số cơ quan nghiên cứu trong nước như Viện Bảo vệ thực vật, Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội , Trung tâm Khảo Kiểm nghiệm giống cây trồng Trung ương đã triển khai điều tra, giám định thành phần và bước đầu nghiên cứu một số bệnh nấm và vi khuẩn truyền qua hạt giống của một số loại cây lương thực, cây thực phẩm chúng ta đã phân lập được thành phần một số nấm, vi khuẩn trên các mẫu hạt giống lúa, ngô, đậu tương, rau.

Theo Phạm Văn Dư và ctv (1997) xử lý mạ bằng cách chủng vào cây

mạ nguồn bệnh Magnaporthe grisea đã bị làm yếu đi, 2 ngày sau chủng

nguồn bệnh cháy lá thì lúa có khả năng giảm bệnh từ 35 – 38%

Theo Lê Thanh Phong, Trịnh Ngọc Thúy, Diệp Đông Tùng, Võ Bình Minh

và Phạm Văn Kim (1999), sử dụng hóa chất như ethrel 800ppm, saccharine 0,05mM, Bion 200ppm, natrium silicate 4mM và CuCl2 0,05mM cho hiệu quả kích kháng bệnh cháy lá lúa kéo dài đến 18 ngày sau khi phun lên lá lúa Ngoài ra, các hóa chất chitosan glucosamine, napthalence acetic acid 30ppm, KH2PO4 5mM, Aspirin (acetylsalicylic acid) 0,4mM, SA 0,4mM, ascorbic acid 1mM và benzoic acid cũng gây kích kháng bệnh nhưng không kéo dài được lâu

Theo Lăng Cảnh Phú (2000), dịch nuôi cấy của vi khuẩn Flavimonas oryzuhabitans sau khi được xử lý hạt hoặc phun lên lá lúa, giúp cây lúa có

khả năng chống lại bệnh cháy lá

Theo Phạm Văn Dư và ctv (2000), SA, ASA, KH2PO4 và chitosan được

xử lý 1 và 2 giờ trước khi chủng bệnh với P.grisea trên 2 giống OM 269 và

OM 1723, cho thấy có ảnh hưởng đến tính kháng lưu dẫn

Theo Diệp Đông Tùng (2000), sử dụng acibenzolar-s-methyl kích kháng bệnh cháy lá lúa khi xử lý hạt, thì có thể kéo dài tính kháng đến 30 ngày sau khi sạ

Tính kháng bệnh đạo ôn ở cây lúa được ghi nhận khi xử lý hạt với KH2PO4 20 – 23mM thì không gây hại đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, phát triển chồi và KH2PO4 15mM phun lên lá ở giống lúa CMK 39 (Khao Dawk Mali) vào các ngày 10, 35 và 65 ngày sau khi sạ thì có thể làm tăng tính kháng qua việc giảm số vết bệnh đang phát triển, tổng vết bệnh trên lá và tỷ lệ

đạo ôn cổ bông (Du et al, 2000).

Theo Trịnh Ngọc Thúy (2000), xử lý hạt lúa bằng cách ngâm với CuCl2 0,05mM, cây lúa có khả năng kích kháng bệnh cháy lá lúa từ 9 – 24 ngày sau khi sạ và khi phun trên lá vào 20 ngày sau khi sạ thì làm giảm đến nhỏ hơn 50% tỷ lệ bệnh trên lá lúa và có thể kéo dài đến 43 ngày sau khi sạ

Trần Vũ Phến và ctv (2000), đã phát hiện ra một chủng nấm Colletotrichum sp gây bệnh trên cỏ lồng vực trong ruộng lúa tại Đồng Tháp,

không gây hại cho lúa và có khả năng kích kháng, giúp cây lúa giảm bệnh đạo

ôn từ 58 – 72% so với đối chứng

Clorua đồng còn cho thấy biểu hiện kích kháng chống lại bệnh cháy lá

lúa khi khảo sát ở mức độ sinh hóa (Ngô Thành Trí và ctv, 2001) và mô học (Huỳnh Minh Châu và ctv, 2001).

Theo Phạm Văn Dư và ctv (2001), sử dụng Oxalic acid 1mM, Oxalic

acid + natritetraborac làm tăng chiều cao, giảm bệnh cháy lá, giảm bệnh thối

cổ gié từ 50 – 60% và tăng năng suất từ 16 – 20%

Theo Nguyễn Thị Thanh Xuân và Phạm Văn Kim (2001), ngâm hạt với clorua đồng và xịt bổ sung với K2HPO4 hoặc Na2SiO3 có khả năng kích kháng bệnh cháy lá đến 30 ngày sau khi gieo trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ruộng

Hạt lúa được xử lý với Na2B4O7 thì có khả năng làm giảm diện tích bệnh trên lá từ 19 – 27% trong thí nghiệm nhà lưới và 7% bệnh trên bông ở

thí nghiệm đồng ruộng (Phạm Văn Dư và ctv, 2001).

Theo Trịnh Ngọc Thúy (2001) và Nguyễn Hữu Anh Nhi (2002), clorua đồng với nồng độ 0.05mM xử lý hạt, giúp giảm bệnh 60 – 62% và kéo dài hiệu quả đến 34 ngày sau khi gieo.

Cũng theo Trịnh Ngọc Thúy (2001), saccharin, chitosan và glucosamin phun lá cũng có tác dụng kích thích tính kháng bệnh trên cây lúa

Trần Vũ Phến (2002), đã thử nghiệm hiệu quả kích kháng chống bệnh

cháy lá lúa của nấm Colletotrichum sp ở nồng độ 106 bào tử/ml đạt từ 45,2%

- 49,3% so với đối chứng

Nguyễn Hữu Anh Nhi (2002), cho rằng xử lý hạt với vi khuẩn

Flavimonas oryzihabitans dòng 9 – E2, nồng độ 108/ml không ảnh hưởng đến

sự nảy mầm của hạt lúa, làm gia tăng chiều dài của rễ, đã kích thích lưu dẫn giúp cây lúa chống lại bệnh cháy lá, có hiệu lực ngay 7 ngày sau khi tấn công (74,96%) và kéo dài cho đến 28 ngày sau khi tấn công (44,34%)

Nguyễn Minh Kiệt (2003) và Vương Tuấn Tài (2003), đã thí nghiệm

khả năng kích kháng của vi khuẩn Flavimonas oryzihabitans trên đồng ruộng

bằng cách ngâm hạt và phun lên lá với clorua đồng hoặc natrium silicate, kết quả đã cho thấy giúp cây lúa giảm bệnh trên lá kéo dài đến 55 ngày sau kích kháng

Theo Nguyễn Ngọc Trì (2004) khi xử lý SA (1.000ppm) hoàn toàn bảo

vệ cây ớt ở giai đoạn 6 lá khỏi sự tấn công của nấm Colletotrichum sp với

khả năng bảo vệ đạt tới 100%

Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Hoàng Oanh và ctv (2006), Nguyễn

Minh Thùy (2006) ghi nhận ba hóa chất Salicylic acid (SA, 1.000ppm), CuCl2 (0,05mM) và KH2PO4 (5mM) đều có khả năng kích kháng bệnh thán thư trên ớt

Phạm Hoàng Oanh, Nguyễn Thị Khánh Vân và Trần Thị Thu Thủy (2009), đã thí nghiêm khả năng kích kháng của 3 chất là Salicylic acid, CuCl2

và KH2PO4 đối cới bệnh thán thư ớt Colletotrichum sp., kết quả cho thấy trong

3 chất SA cho hiệu quả kích kháng sớm nhất và keo dài đến 144 GSP,

KH2PO4 có hiệu quả kéo dài đến 96 GSP, còn CuCl2 có hiệu quả kéo dài đến

72 GSP thể hiện qua phần trăm đĩa áp tạo phát sáng tế bào

2.3.2.2 Nghiên cứu về bệnh nấm hại trên hạt giống lúa.

Kết quả bước đầu về kiểm tra bệnh hạt giống (Trần Đình Nhật Dũng, 1996) trên 88 mẫu hạt giống thu thập tại Hà Nội, Hà Tây, Nam Hà, Thái Bình, Hà Bắc, Hòa Bình, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Nghệ An… đã phát hiện

thấy tất cả các mẫu đều nhiễm nấm bệnh, điển hình là các loài Bipolaris oryzae (tiêm lửa hại lúa), Alternaria padwickii (cháy lá lúa),Fusarium moliniforme (lúa von), Microdochium oryzae (khô đầu lá lúa) và Sarocladium oryzae (thối bẹ lá lúa) Trong đó các mẫu bị nhiếm nâm Bipolaris oryzae là

cao nhất với tỷ lệ mẫu nhiễm trung bình đạt 79.5%, tỷ lệ hạt bị nhiễm trung bình là 5.9%, nhiễm nặng nhất trên giống lúa Mộc Tuyền

Trong 4 mẫu giống ngô thu thập ở phía Nam cho thấy cả 4 mẫu đều có

nấm bệnh ký sinh, điển hình là 2 loại: Fusarium moliniforme gây bệnh mốc hồng và Claphalosporium gây bệnh phấn đen với tỷ lệ giống nhiễm trung

bình là 70.2%, các mẫu đậu tương thu thập ở phía Nam đã phát hiện thấy tỷ lệ

hạt giống bị nhiễm bệnh là 34.5%, điển hình là các loài: Phome sojae (13.0%) gây bệnh thối thân và thối quả, Fusarium semitectum (15.5%) gây bệnh thối rễ, Macrophominam phaseolina gây bệnh đen rễ (8.5%), Cercospora kikuchi

gây bệnh đốm tím hạt (5.9%)

Cũng theo Trần Đình Nhật Dũng và cộng tác viên cho biết: với 300 mẫu kiểm tra trong 2 vụ Đông Xuân năm 1995 – 1996 và 1996 – 1997 đại diện cho hơn 3000 tấn lúa giống (chủ yếu CR203, IR17494 và IR38) đã phát hiện được 7 loài nấm bệnh, trong đó có 4 loài phân bố phổ biến trên các mẫu

là: Bipolaris oryzae, Microdochium oryzae, Fusarium moliniforme, Alternaria padwickii, tỷ lệ hạt bị nhiễm bệnh ở các giống lúa tại các điểm

điều tra đều rất cao, tỷ lệ nhiễm trung bình là 14.4 – 30% số hạt trong các mẫu giống kiểm tra Tỷ lệ hạt giống bị nhiễm bệnh cao nhất là các lô hạt

giống ở Quảng Nam – Đà Nẵng, Thừa Thiên Huế, riêng ở Quảng Ngãi trong vụ Đông Xuân năm 1995 – 1996 tỷ lệ hạt giống bị nhiễm lên đến 39.5% Nấm

gây bệnh tiêm lửa (Bipolaris oryzae) xuất hiện nhiều nhất trong các lô hạt

giống ở Quảng Ninh (16.6%), Thừa Thiên Huế (15.9%), Quảng Nam – Đà Nẵng (7.6%) và Quảng Ngãi (14.7%)

Kết quả kiểm tra nấm bệnh trên một số lô giống lúa nhập khẩu và sản xuất tại một số tỉnh ven biển phía Bắc, duyên hải miền Trung (Trần Đình Nhật Dũng, Nguyễn Thị Hoa, Phạm Thị Thoa, 1996) cho thấy: tỷ lệ nhiễm bệnh ở tất cả các lô hạt giống đều rất cao, trung bình từ 11.6 – 51.6% số hạt, trong đó cao nhất ở Quảng Ninh (51.6%), Thanh Hóa (41.3%), Thái Bình (37.2%), Nam Định (28.6%), Quảng Ngãi (27.1%), Thừa Thiên Huế (25.1%), Nghệ An (21.8%) và Hà Tĩnh (12.9%) Các giống bị nhiễm với tỷ lệ khá cao đó là giống Mộc Tuyền (47.7%), các giống lúa thuần Trung Quốc bị nhiễm với tỷ lệ 34.2% và chủ yếu là nấm gây bệnh đốm lá

Kết quả nghiên cứu bệnh trên hạt giống lúa trong giai đoạn chuyển đổi

cơ cấu cây trồng ở miền Bắc Việt Nam (Nguyễn Văn Tuất, 1998 – 1999) đã

xác định được 5 loại nấm gây biến màu hạt là Bipolaris oryzae, Alternaria padwickii, Fusarium moniliforme, Microdochium oryzae, Rhizoctonia solani Trên các giống lúa Trung Quốc đã phân lập được 5 loại: Bipolaris oryzae, Alternaria padwickii, Fusarium moniliforme, Microdochium oryzae và Sarocladium oryzae.

Để đánh giá mức độ nhiễm nấm trên một số lô hạt giống lúa được sản xuất ở Việt Nam, Olga Kongsdal và Phạm Thị Thoa (1996) cho biết: mức độ nhiễm nấm trên hạt giống lúa Việt Nam khá cao: 96% số mẫu kiểm tra bị

nhiễm nấm Alternaria padwickii, 87% số mẫu kiểm tra bị nhiễm nấm Bipolaris oryzae, 52% số mẫu kiểm tra bị nhiễm nấm Microdochium oryzae, 39% số mẫu bị nhiễm nấm Sarocladium oryzae Trong đó tỷ lệ nhiễm nấm Bipolaris oryzae trung bình là 8.0%.

Các kết quả kiểm tra nấm bệnh năm 2001 (Phạm Thị Thoa và CTV,

2001), trong các lô hạt giống kiểm tra, tỷ lệ hạt bị nhiễm nấm Bipolaris oryzae cao nhất ở các mẫu giống lúa thu thập từ Nam Định, Thanh Hóa, Nghệ

An và Quảng Bình, tỷ lệ nhiễm trung bình từ 4.57% - 6.67%, ở Đà Nẵng là

14.9% Cũng theo kết quả này: tỷ lệ nhiễm nấm Bipolaris oryzae cao nhât ở

các mẫu hạt giống được sản xuất tại các Trạm, Trại và các Công ty giống cây trồng Nghệ An, trong khi đó các mẫu hạt lúa giống được sản xuất tại các nông

hộ ở Nghệ An có tỷ lệ nhiễm nấm Bipolaris oryzae thấp hơn với tỷ lệ nhiễm

trung bình là 3.78%

Kết quả kiểm tra nấm bệnh trên một số mẫu hạt lúa giống được sản xuất tại các nông hộ ở Hải Dương, Nam Định vụ Mùa năm 2002 (Trần Thị

Hưng và CTV): tỷ lệ hạt lúa giống nhiễm nấm Bipolaris oryzae cao nhất ở các

mẫu thu thập tại Chí Linh – Hải Dương với tỷ lệ nhiễm nấm trung bình từ 4.4 – 6.3% Tỷ lệ nhiễm cao nhất trên giống DT10 (17.0%)

Kết quả điều tra thành phần nấm bệnh trên hạt giống lúa Q5 và Khang Dân vùng đồng bằng Sông Hồng (Trần Thị Hưng, 2002) cho thấy tỷ lệ hạt lúa

giống Khang Dân nhiễm nấm Bipolaris oryzae trung bình là 0.71% và Q5 là

0.9%, tỷ lệ truyền bệnh sang cây con vẫn cao nhất ở mẫu bị nhiễm nấm

Bipolaris oryzae, trung bình là 90%, tỷ lệ truyền bệnh thấp nhất là mẫu bị nhiễm nấm Microdochium oryzae (30%) Tác giả cũng cho biết: hai chỉ tiêu

độ ẩm và nấm bệnh có liên quan chặt chẽ đến nhau và ảnh hưởng đến chất lượng hạt giống khá rõ, trong trường hợp một mẫu cùng có hai chỉ tiêu này ảnh hưởng theo chiều hướng bất lợi sẽ dẫn đến chất lượng cây mầm giảm đáng kể

Kết quả tìm hiểu một số loài nấm bệnh tồn tại trên hạt giống lúa lai

(Hoàng Thị Thu Trang, 2000): tỷ lệ nhiễm nấm Bipolaris oryzae trung bình

trong 15 mẫu kiểm tra trên giống Shan ưu 63 là 0.47%, Nhị ưu 63 là 0.6%,

Nhị ưu 838 là 0.5% và ở các mẫu có tỷ lệ nhiễm nấm Bipolaris oryzae cao đã

làm giảm tỷ lệ nảy mầm của hạt giống

Kết quả điều tra thành phần nấm và vi khuẩn trên hạt giống một số giống lúa chính năm 2001 vùng đồng bằng sông Hồng (Bùi Thị Khơi, 2002) đã phân lập được 19 loài nấm và 5 loài vi khuẩn trên hạt giống lúa sản xuất ở

9 vùng đồng bằng sông Hồng

Hạt giống bị nhiễm bệnh đã làm giảm đáng kể tỷ lệ nảy mầm, nếu bị nhiễm nặng, hạt giống có thể không nảy mầm được, gây thiệt hại cho sản xuất nông nghiệp Kết quả đánh giá ảnh hưởng của bệnh tới tỷ lệ nảy mầm của hạt giống lúa (Phạm Thị Hoa, 1997) đã thông báo mẫu giống IR17494 đạt tỷ lệ nảy mầm cao là mẫu có tỷ lệ nhiễm nhẹ (<10%), mẫu nhiễm đồng thời cả hai

nấm Bipolaris oryzae và Alternaria padwickii với tỷ lệ nhiễm cao dẫn đến có

tỷ lệ cây mầm không bình thường cao

Trong danh mục thành phần dịch hại trên lúa gạo năm 1977 đã công bố cho các nước trên thế giới biết: lúa gạo Việt Nam có 14 loại nấm và 1 loại vi khuẩn

Kết quả khảo nghiệm và kiểm nghiệm hạt giống cây trồng (Nguyễn Đức Huy và CTV, 2002) cho biết khi hạt giống lúa bị nhiễm nấm von

(Fusarium moniliforme) thì xử lý bằng thuốc Cacbendazime 50WP nồng độ

0.3% cho hiệu lực phòng trừ bệnh rất tốt

Tóm lại các kết quả điều tra nghiên cứu bệnh hại trên hạt giống lúa ở nước ta đã chứng tỏ rằng các lô hạt giống được sản xuất tại các tỉnh trung du, miền núi, các tỉnh vùng duyên hải ven biển có tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn so với ở vùng đồng bằng sông Hồng và những vùng có điều kiện đất đai thuận lợi cho sự sinh trưởng, phát triển của cây lúa Các kết quả thu được chủ yếu vẫn là điều tra thành phần và tỷ lệ hạt bị nhiễm bệnh mà chưa có các giải pháp cụ thể để phòng trừ hoặc xử lý các lô hạt giống bị nhiễm bệnh

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Giống lúa:

Sử dụng giống lúa Q5 và Khang dân

3.1.2 Chất kích kháng:

Oxalic acid 1mM, oxalic acid 2mM, oxalic acid 4mM, CuCl2 0.05 mM, Bion 200ppm

Bảng 3.1 Thành phần chất kích kháng thu thập được

Stt Tên chất kích

kháng

Nồng độ thích hợp Giai đoạn xử lí 1.

Axit Oxalic 1mM Hạt giống, 7 ngày sau cấy

Tên thương phẩm: Bion

Tên hoạt chất: Acidbenzolar-S-methyl

Hình 3.1: Công thức cấu tạo của Acidbenzolar-S-methyl

Nguồn: Wikimedia Common s

* Đồng Clorua:

- Công thức cấu tạo: CuCl2

Hình 3.2 : Cấu trúc tinh thể đồng khan (II) clorua

Nguồn: Wikimedia Commons

Đồng clorua đã được ứng dụng trong kích kháng rất nhiều bệnh hại cây trồng Đồng clorua là hoạt chất chính trong phân bón lá cropsar-3 ĐHCT, nồng độ 0.05mM chất có khả năng kích thích tính kháng bệnh lưu dẫn giúp cây lúa giống nhiễm bệnh trở nên kháng với bệnh đạo ôn lúa Sử dụng Cropsar-3 ĐHCT để xử lí hạt giống trước khi phun sạ và phun lên lá lúa vào

25 ngày sau khi sạ, giúp giảm bệnh đạo ôn trên lá

Cơ chế của hiện tượng kích kháng do cropsar-3 ĐHCT tạo ra được là

do có sự gia tăng hoạt tính của các enzim β-1,3 glucanase, chitinnase, Phenylalanine ammonia-lyase (PAL), peroxidase, catalase va còn có sự gia tăng ligin hóa vách tế bào lá lúa, đồng thời có gia tăng sự tích lũy chất Polyphenol và Hydrogen peroxide trên vết bệnh hơn (Phạm văn Kim, Trần Thị Thủy, Ngô Thành Trí, Trần Vũ Phến, 2009)

* Oxalic acid

Công thức phân tử: HOOC-COOH (khan)

Hình 3.3, 3.4: Dạng khan và công thức cấu tạo của Oxalic acid.

Nguồn: Wikimedia Commons

Acid oxalic và các muối oxalat có mặt khá phổ biến trong nhiều loài

thực vật, đáng chú ý là rau muối (Chenopodium album) và chua me đất (chi Oxalis) Rễ hoặc lá của đại hoàng (chi Rheum), kiều mạch (Fagopyrum esculentum) cũng được liệt kê như là có chứa nhiều axít oxalic.

Các loại thức ăn chứa một lượng đáng kể axít oxalic, theo trật tự giảm

dần, bao gồm: khế (Averrhoa carambola), hồ tiêu (Piper nigrum), mùi tây (Petroselinum crispum), hạt các loại anh túc (các chi Meconopsis, Papaver, Romneya, Eschscholzia), thân cây đại hoàng (chi Rheum), rau dền (chi Amaranthus), rau bina (Spinacia oleracea), một số thứ và giống củ cải đường (Beta vulgaris), ca cao (Theobroma cacao), phần lớn các loại quả hạch hay

quả mọng và các loài đậu, đỗ Cảm giác có sạn ở miệng khi uống sữa chứa hương vị đại hoàng là do sự kết tủa của oxalat canxi gây ra Vì thế thậm chí

cả một lượng rất loãng axít oxalic cũng có thể nhanh chóng "phá vỡ" cazein tìm thấy trong nhiều loại sản phẩm sữa

Lá của chè (Camellia sinensis) cũng chứa một lượng lớn axít oxalic so

với nhiều loài thực vật khác

Ứng dụng của Oxalic acid trong nông nghiệp: Đã được sử dụng

3.1.3 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu:

Agar, khoai tây, cà rốt, đường Glucose, cồn 70o và một số hóa chất cần thiết khác

3.1.4 Dụng cụ thí nghiệm:

- Đĩa petri, que cấy, dao cắt nấm, đèn cồn, panh, ống đong, bình tam giác, đũa thủy tinh, lam kính, lamen, giấy thấm (Blotter paper), giấy đặt nảy mầm

- Tủ lạnh, tủ định ôn, tủ sấy, nồi hấp, kính hiển vi quang học, kính hiển

vi soi nổi, chậu vại…

3.1.5 Môi trường nuôi cấy:

Môi trường WA, PDA, PCA, PGA

3.2 Địa điểm nghiên cứu.

Phòng thực tập bệnh cây – Bộ môn Bệnh cây Nông dược Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

Các nghiên cứu trong nhà lưới được tiến hành tại khu nhà lưới – Khoa Nông học – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

3.3 Nội dung nghiên cứu.

3.3.1 Nghiên cứu trong phòng:

- Điều tra, giám định thành phần nấm bệnh trên giống lúa Q5

- Điều tra, xác định tỷ lệ nhiễm nấm Alternaria padwickii đến tỷ lệ nảy

mầm của mẫu bị nhiễm nấm

- Phân lập nấm Alternaria padwickii từ giống lúa Q5 bị nhiễm nấm Alternaria padwickii, nuôi cấy trên môi trường PDA để thu được nấm thuần.

- Quan sát đặc điểm, hình thái, sự phát triển của nấm ở trên hạt và trên môi trường PDA

- Khảo sát hiệu lực của chất kích kháng Bion, CuCl2 0.05mM, Oxalic acid ở các nồng độ 1mM, 2mM, 4mM để xử lý các mẫu hạt lúa giống, sau đó

đặt trên giấy thấm để xác định tỷ lệ nấm Alternaria padwickii sau khi xử lý

thuốc Từ đó xác định được 1 loại thuốc tốt nhất phòng trừ nấm Alternaria padwickii để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.3.2 Nghiên cứu trong nhà lưới:

- Dùng nguồn nấm Alternaria padwickii đã phân lập thuần gây bệnh

nhân tạo lên giống Q5 để đánh giá khả năng nhiễm bệnh của giống

- Gieo các mẫu hạt giống lúa Q5 bị nhiễm nấm Alternaria padwickii ở các mức nhiễm khác nhau để đánh giá sự ảnh hưởng của nấm trên hạt tới sức sống của mạ

3.4 Phương pháp nghiên cứu.

3.4.1 Phương pháp nghiên cứu trong phòng:

3.4.1.1 Phương pháp giám định thành phần nấm bệnh, nấm Alternaria padwickii trên mẫu lúa giống và tỷ lệ nảy mầm của hạt lúa.

Phương pháp giấy thấm – Theo phương pháp của ISTA (International Seed Testing Association, 1996)

- Lấy 200 hạt/mẫu, chia thành 8 phần, mỗi phần 25 hạt

- Chuẩn bị đĩa petri và giấy thấm:

+ Đĩa petri đã được hấp khử trùng, 8 đĩa/mẫu

+ Giấy thấm (Blotter paper) trong hộp đã khử trùng

- Lấy 3 tờ giấy thấm, nhúng vào nước sao cho toàn bộ giấy thấm ướt đều, sau đó đặt vào hộp petri (3 tờ/hộp)

- Cách đặt hạt: 25 hạt/đĩa, đặt thành 3 vòng, vòng ngoài 15 hạt, vòng giữa 9 hạt, 1 hạt ở trung tâm của đĩa, khoảng cách giữa các vòng cách đều nhau Sau khi đặt xong phải ghi mã số mẫu hoặc tên giống, ngày đặt và ngày kiểm tra lên trên mặt đĩa, đem toàn bộ số đĩa hạt đã đặt để trong phòng nuôi cấy (incubation room), điều kiện phòng nuối cây: nhiệt độ 20oC, ánh sáng đèn huỳnh quang hoặc đèn gần cực tím (near untraviolet), thời gian chiếu sáng 12 giờ tối xen kẽ 12 giờ sáng Sau 7 ngày nuôi cấy, đem kiểm tra kỹ từng hạt dưới kính hiển vi soi nổi, khi

phát hiện thấy nấm ở trên hạt tiến hành dùng kim khêu nấm, đặt lên lam kính để kiểm tra dưới kính hiển vi quang học.

- Chỉ tiêu theo dõi: tổng số hạt bị nhiễm nấm Alternaria padwickii trên

tổng số hạt kiểm tra, tỷ lệ nảy mầm

3.4.1.2 Phương pháp nghiên cứu và quan sát, mô tả đặc điểm hình thái của

nấm Alternaria padwickii:

- Chuẩn bị môi trường PDA:

Thành phần gồm có (cho 1 lít môi trường):

+ Khoai tây: 200 gram

+ Glucose: 20 gram

+ Agar : 20 gram

+ Nước cất: 1000 ml

- Môi trường PGA:

Thành phần gồm có (cho 1 lít môi trường)

+ Khoai tây: 200 gram

+ Glucose: 20 gram

+ Agar: 20 gram

+ Nước cất: 1000 ml

- Môi trường PCA (cho 1 lít môi trường)

+ Khoai tây: 20 gram

- Từ các hạt bị nhiễm nấm Alternaria padwickii, tách lấy bào tử nấm

đem cấy trên môi trường PDA đã chuẩn bị, phân lập nấm thuần, sau đó

cấy lại trên môi trường PDA, quan sát sự phát triển của nấm trên môi trường PDA, dùng kim khêu sợi nấm và bào tử nấm dưới kính hiển vi quang học, mô tả đặc điểm hình thái của nấm.

- Cấy nấm Alternaria padwickii trên các môi trường trên và theo dõi sự

phát triển của tản nấm sau khi cây 1,2,3,4,5 ngày bằng cách đo đường kính của tản nấm trên các môi trường, từ đó xác định môi trường thích hợp cho nấm sinh trưởng và phát triển Đơn vị đo (mm)

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu trong nhà lưới.

Bố trí thí nghiệm như sau:

- Thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại với 7 nghiệm thức trên giống lúa Q5 Trong thí nghiệm, các chất kích kháng được sử dụng là Bion (Acibenzolar-S-methyl) 200ppm, Oxalic acid, đồng clorua 0.5 mM Hóa chất được áp dụng xử lý theo 2 cách: ngâm xử lý hạt giống trước khi trồng, vừa ngâm xử lý hạt giống vừa phun lên lá ở giai đoạn 7 ngày sau khi cấy Các nghiệm thức được so sánh với đối chứng: không xử lý kích kháng

- Thí nghiệm thực hiện trong chậu vại, với giống lúa Q5

ĐC: không xử lý kích kháng (Phun nước)

Công thức 1 (CT1): Dùng Bion ngâm ủ hạt giống

Công thức 2 (CT2): Dùng Bion ngâm ủ hạt giống và phun lên cây giai đoạn 7 ngày sau cấy

Công thức 3 (CT3): Dùng CuCl2 ngâm ủ hạt giống

Công thức 4 (CT4): Dùng CuCl2 ngâm ủ hạt giống và phun lên cây giai đoạn 7 ngày sau cấy

Công thức 5 (CT5): Dùng Oxalic acid ngâm ủ hạt giống

Công thưc 6 (CT6): Dùng Oxalic acid ngâm ủ hạt giống và phun lên cây giai đoạn 7 ngày sau cấy

Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 30 cây

3.4.2 Chỉ tiêu theo dõi

Số liệu được xử lý thống kê sinh học theo các chương trình sau:

Theo chương trình IRRISTART 4.0 (Phạm Tiến Dũng, 2003)

Chương trình Exell

Các giá trị trung bình của các nghiệm thức được so sánh bằng F, t, LSD, Duncan ở mức xác suất P = 0,95 (α = 0,05) Các giá trị a, b, c… được ghi các giá trị trung bình có ký hiệu chữ giống nhau thì có giá trị giống nhau

∑ ×100Trong đó: ∑ : Tổng tích số lá

a : số lượng hạt bị bệnh ở mỗi cấp

b : trị số cấp bệnh ở mỗi cấp tương ứngN: tổng số hạt điều tra

T: trị số cấp bệnh cao nhất trong bảng phân cấp

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thành phần nấm bệnh trên hạt giống lúa năm 2010.

Để đánh giá tình hình nhiễm nấm trên hạt giống lúa năm 2010 ở một số vùng lân cận tại Hà Nội, chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu hạt giống từ tỉnh Hưng Yên Kết quả kiểm tra giám định nấm bệnh qua 5 mẫu phân tích trên giống Q5 và Khang dân được thể hiện ở bảng 4.1

Bảng 4.1 Thành phần nấm bệnh trên các mẫu lúa giống

vụ Thu Đông năm 2010.

Sacc And Syd

Tilleticeae Ustilaginales Hyphomycetes

4 Microdochicum

oryzae

Gam And Haw

Tubervulariacae Hyphales Hyphomycetes

5 Sarocladium oryzae

Gam And Haw

Moniliaceae Hyphales Hyphomycetes

6 Rhizopus ssp. Mucoraceae Mucorales Zygomycetes

Moniliaceae Hyphales Hyphomycetes

Chúng tôi đã xác định được 9 loài nấm bệnh xuất hiện trên hạt giống

lúa trong đó có nhiều loài đã được công bố là nấm hại trên lúa như Alternaria padwickii, Fusarium moliniforme, Sarocladium oryzae.

4.2 Mức độ nhiễm nấm phổ biến trên giống lúa Q5 và Khang dân trong

vụ Thu-Đông năm 2010

Ngoài việc kiểm tra,giám định thành phần nấm hại hạt giống, chúng tôi còn tiến hành kiểm tra mức độ nhiễm nấm trên hai giống Q5 và Khang dân Kết quả được trình bày ở bảng 4.2

Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm và mức độ phổ biến của các loài nấm trên hai

giống Q5 và Khang dân STT Tên khoa học

Tỷ lệ hạt nhiễm

TB (%)

Mức độ nhiễm

Tỷ lệ hạt nhiễm

TB (%)

Mức độ nhiễm

Theo kết quả bảng 4.2 cho thấy thành phần nấm hại hạt giống trên hai

giống Q5 và Khang dân là 9 loài phổ biến là: Alternaria padwickii (cháy lá lúa); Curvularia lunata (đốm nâu lúa); Tilletia barclayana (than đen hạt); Microdochicum oryzae (khô đầu lá); Sarocladium oryzae (thối bẹ lá); Rhizopus ssp.; Fusarium moniliforme (lúa von); Bipolaris oryzae (tiêm lửa hại lúa); Pyricularia oryzae (đạo ôn)

Mức độ phổ biến của các loài nấm trên 2 giống Q5 và Khang dân có sự khác nhau Tỷ lệ nhiễm nấm trung bình của từng giống là: 0.5-21.8% (trên giống Q5) và 0.5-22.4% (trên giống Khang dân)

Nấm Alternaria padwidkii, Curvularia lunata, Tilletia barclayana xuất

hiện phổ biến ở cả hai giống trên Cả hai giống đều ít thấy có sự xuất hiện của

nấm Pyricularia oryzae và Bipolaris oryzae.

Tuy nhiên, tỷ lệ hạt nhiễm nấm Alternaria padwickii trên giống Q5 cao

hơn so với trên giống Khang dân, trên giống Q5 là 14.0% với mức độ nhiễm

là phổ biến, còn trên giống Khang dân có tỷ lệ nhiễm thấp hơn (12.0%) với mức độ nhiễm ít phổ biến

Khi kiểm tra, giám định bệnh trên hạt trước khi ủ không nhận thấy sự khác nhau giữa hạt khỏe và hạt bị nhiễm nấm bệnh Do vậy, nhận biết từng loài nấm hại trên để xác định có mặt của nó trên hạt hay không là rất cần thiết Với mục đích đó chúng tôi đã tiến hành giám định từng loài nấm bệnh trên, Kết quả được thể hiện trong bảng 4.3

Bảng 4.3 Kết quả giám định nấm bệnh trên hạt giống lúa vụ Thu Đông năm 2010.

Tản nấm phát triển tỏa ra, mỏng, sợi nấm rất phát triển, mọc lan trên bề mặt môi trường

Ban đầu màu trắng sau đó hơi xám

Kích thước tản nấm: 3.5 – 3.5

µm.

Có hai dạng: dạng sợi phát triển sinh ít bào tử và dạng sợi nấm kém phát triển sinh nhiều bào tử

Thẳng hoặc cong, hình chùy, có cuống dài,có 3 – 5 vách ngăn

Kích thước: 95-168

×11.5-19.5µm.

Mọc thành cụm.Cành bào tử phân sinh đa bào, hơi gãy khúc, màu vàng nhạt

2 Curvularia

lunata

Cành bào tử mọc thành từng chùm có

từ 2-3 bào tử trở lên, khi phát sinh nhiều hạt lúa bị bao phủ bởi lớp bào tử và cành bào tử màu đen

Màu xanh đậm

Kích thước tản nấm: 8.2-8.5µ

m

Hình cong, dạng gù vai trâu,có 3 vách ngăn, một tế bào ở giữa phình to và có màu đậm hơn

Kích thước: 29.8×9.5-16.6µm

18.5-Thẳng hoặc cong đuôi khi có mấu

Đa bào, có mầu nâu đậm đến đen.Kích thước: 630-

mắt lưới.

Đường kính: 23.1µm

16.3-4 Microdochicum

oryzae

Trên hạt thấy có những đám màu vàng cam đục đến sáng của bào tử, sợi nấm kết tụ gần như không phát triển trên hay xung quanh đam bào tử

Sợi nấm kém phát triển Tế bào hình trăng

khuyết, không màu, 2đầu nhọn

Kích thước: 9-14×4.5µm.

3-5 Sarocladium

oryzae

Xốp màu trắngKích thước tản nấm: 1-1.2µm Bào tử không màu,hình trụ và tròn

Tản nấm màu hồng trắng,tạo sắc tố màu hồng đỏ đến tím trên bề mặt môi trường

Hình oval hay elip,

có từ 3-5 vách ngăn,

có chân giả

Kích thước bào tử nhỏ:8-12×2.5-8µm.

Kích thước bào tử lớn:

32-52×3-4.5µm.