Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia quá trình sinh tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (curcuma zedoaria roscoe) tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRƯƠNG THỊ PHƯƠNG LAN NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH KHÁNG LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GEN THAM GIA QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CURCUMINOID Ở TẾ BÀO NGHỆ ĐEN (Curcuma zedoaria Roscoe) TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC THỰC VẬT Mã số: 9420112 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS NGUYỄN HOÀNG LỘC HUẾ - 2019 Cơng trình hoàn thành tại: Khoa Sinh học Trường Đại Học Khoa Học Huế, Đại Học Huế Người hướng dẫn khoa học: GS TS Nguyễn Hoàng Lộc Phản biện 1: GS TS Dương Tấn Nhật Viện nghiên cứu khoa học Tây Nguyên Phản biện 2: PGS TS Lê Thị Thủy Tiên Trường Đại học Bách khoa Thành phố HCM Phản biện 3: PGS TS Võ Thị Mai Hương Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Huế Đại học Huế vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 201… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Trường Đại học Khoa Học, Đại học Huế - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), từ lâu sử dụng y học cổ truyền nhiều nước để điều trị chứng viêm, đau nhức, bệnh da vết thương vết lở loét, bất thường chu kỳ kinh nguyệt Nhóm chất màu curcuminoid bao gồm curcumin dẫn xuất demethoxycurcumin bisdemethoxycurcumin nhóm hợp chất tạo nên hoạt tính sinh học quan trọng củ nghệ Các nghiên cứu gần cho thấy curcuminoid, đặc biệt curcumin, có phạm vi tác dụng dược lý rộng kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa mạnh, chống tia tử ngoại, ức chế phát triển khối u bảo vệ thần kinh (kháng β-amyloid) Hiện nay, gen tham gia q trình chuyển hóa curcuminoid nghệ vàng (C longa) xác định phân tích mức độ biểu hiện, bao gồm hai nhóm gen type III polyketide synthase gen diketide-CoA synthase (DCS) gen curcumin synthase (CURS1, CURS2 CURS3) Tuy nhiên, gen tham gia tổng hợp curcuminoid loài nghệ đen đến chưa công bố Elicitor chất hóa học dùng để tác động vào đường chuyển hóa thứ cấp nhằm tăng cường sinh tổng hợp chất có giá trị dược phẩm dược phẩm thực vật nuôi cấy tế bào thực vật Từ lý trên, thực đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích kháng lên biểu số gen tham gia trình sinh tổng hợp curcuminoid tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)” nhằm xác định loại elicitor nồng độ thích hợp chúng để điều hòa tăng biểu gen type III polyketide synthase đường phenylpropanoid tế bào nghệ đen Kết nghiên cứu cung cấp chứng vai trò SA, YE MeJA chất điều hòa dương tính biểu gen lồi dược liệu có giá trị 4 Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu lý thuyết Cải thiện mức độ biểu gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 CzCURS3 tham gia đường chuyển hóa phenylpropanoid sinh tổng hợp curcuminoid tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro số elicitor Mục tiêu thực nghiệm Tăng hiệu suất sinh tổng hợp curcumin, thành phần nhóm chất curcuminoid ứng dụng nhiều dược phẩm, tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro Nội dung và phạm vi nghiên cứu Nội dung nghiên cứu - Nuôi cấy sinh khối tế bào nghệ đen in vitro hiệu suất cao cách bổ sung AgNO3 vào môi trường ni cấy quy mơ phòng thí nghiệm - Phân lập gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 CzCURS tham gia trình tổng hợp curcuminoid (các gen curcuminoid) nghệ đen - Nghiên cứu ảnh hưởng số elicitor YE, SA MeJA lên mức độ biểu gen tổng hợp curcuminoid khả tích lũy curcumin tế bào nghệ đen ni cấy in vitro Phạm vi nghiên cứu Các nghiên cứu tiến hành phạm vi phòng thí nghiệm./ Đóng góp luận án - Các nghiên cứu ni cấy mô tế bào nghệ đen trước chưa sử dụng AgNO3 để tăng hiệu nuôi cấy, nghiên cứu này, bổ sung AgNO3 1,5 mg/L vào môi trường nuôi cấy (bao gồm tạo in vitro, nuôi cấy callus) làm tăng hiệu q trình ni cấy so với nghiên cứu trước - Đã phân lập thành công gen tham gia vào trình tổng hợp curcuminoid, gen tương đồng 99% so với gen tương ứng nghệ vàng đăng ký ngân hàng gen với mã số MF663785, MF402846, MF402847 MF987835 Các gen có biểu củ callus nghệ đen - Gen DCS có vai trò lớn gen tham gia vào trình sinh tổng hợp curcumin nghệ đen, mức độ biểu gen định trực tiếp đến hàm lượng curcumin thu - Đã nghiên cứu ảnh hưởng số loại elicitor (dịch chiết nấm men salicilic acid) lên khả tích lũy curcumin mức độ biểu gen liên quan Giá trị tốt thu xử lý dịch chiết nấm men (1 g/L) sau ngày nuôi cấy, mức độ biểu cao 2,78 lần so với đối chứng Cấu trúc luận án Luận án trình bày trang A4, khơng bao gồm Phụ lục Trong đó, phần Mở đầu trang, phần Tổng quan tài liệu 33 trang, phần Đối tượng Phương pháp nghiên cứu 11 trang, phần Kết nghiên cứu 40 trang, phần Bàn luận 16 trang, Kết luận Kiến nghị trang, Danh mục cơng trình cơng bố trang, Tài liệu tham khảo 21 trang phần Phụ lục 13 trang Luận án có 169 tài liệu tham khảo, có 161 tài liệu tiếng Anh Phần kết nghiên cứu có bảng 26 hình Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Cây nghệ đen Nghệ đen thân thảo sống nhiều năm hàng năm, cao khoảng 1-1,5m; có củ (thân rễ) hình trứng, có khía chạy dọc, củ tỏa theo hình chân vịt; mẫm Cây có nhiều củ, ngồi củ có củ phụ, vỏ củ có màu xám, bên củ có màu vàng lưu huỳnh nhạt vàng sáng, già có nhiều vòng màu xanh tím Củ nghệ khơ có mùi thơm camphor nhẹ có vị đắng cay Nghệ đen lồi thảo dược có củ chứa nhóm chất chủ yếu tinh dầu (sesquiterpene monosesquiterpene) curcuminoid (curcumin, demethoxy-curcumin bisdemethoxycurcumin) Ngồi ra, củ nghệ chứa số hợp chất khác tinh bột, chất dẻo chất có vị đắng tannin, flavonoiod Ni cấy mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật có nhiều triển vọng ứng dụng lâu dài việc sản xuất hợp chất tự nhiên, đặc biệt chất dùng y học Hướng nghiên cứu dẫn đến ổn định mặt chất lượng số lượng sản phẩm, phụ thuộc vào tự nhiên Đồng thời, nguồn nguyên liệu cho thí nghiệm sinh lý, hóa sinh ứng dụng để tách chiết hợp chất thứ cấp khác 6 Elicitor và ứng dụng Elicitor định nghĩa chất mà đưa lượng nhỏ vào hệ thống tế bào sống khởi động cải thiện sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp tế bào Sự kích kháng thực vật (elicitation) trình cảm ứng tăng cường sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp nhờ tác động elicitor, giúp cho chống lại yếu tố bất lợi ngoại cảnh tác nhân gây bệnh điều kiện sinh thái khắc nghiệt Đến nay, có nhiều cơng trình ứng dụng elicitor để kích thích sản xuất hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy in vitro thực vật Các nghiên cứu cho thấy tích lũy chất tăng lên đáng kể so với đối chứng sau xử lý với loại elicitor nồng độ thích hợp chúng Một số lồi ni cấy có bổ sung elicitor Dioscorea zingiberensis, Digitalis lanata, Hypericum triquetrifolium, Portulaca oleracea, Psoralea corylifolia, Silene vulgaris, Alstonia scholaris, Hypericum perforatum, Scrophularia kakudensis, thủy tùng (Taxus baccata), Artemisia annua… Đối với loài thuộc chi nghệ, việc ni cấy có bổ sung elicitor thực nuôi cấy nghệ xanh (C aeruginosa), nghệ vàng (C longa), nghệ C mangga Các gen tham gia tổng hợp curcuminoid Tham gia vào chu trình tổng hợp curcuminoid nghệ vàng có nhiều enzyme xúc tác cho nhiều phản ứng trung gian khác nhau, phần lớn gen/enzyme nghiên cứu đặc điểm, chức biểu tái tổ hợp Trong số đó, enzyme thuộc nhóm polyketide synthase type III đóng vai trò quan trọng Gen diketide-CoA synthase (DCS) mã hóa diketide-CoA synthase enzyme thuộc nhóm polyketide synthase type III xúc tác tạo thành feruloyldiketide-CoA từ feruloyl-CoA malonyl-CoA Gen curcumin synthase (CURS) mã hóa enzyme xúc tác tạo thành curcuminoid từ cinnamoyldiketide-N-acetylcysteamine feruloyl-CoA Hoạt động đồng thời DCS CURS có diện feruloyl-CoA malonyl-CoA tạo nhiều curcumin, CURS cho hiệu tổng hợp curcumin thấp với diện feruloyl-CoA malonylCoA 7 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu biểu gen tham gia vào trình sinh tổng hợp curcuminoid tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nuôi cấy in vitro nghệ đen Tái sinh chồi tạo rễ in vitro Chồi mầm sau khử trùng (1-1,5 cm) cấy lên mơi trường MS có sucrose 20 g/L, agar g/L, bổ sung BAP mg/L, IBA 0,5 mg/L nước dừa 20% (v/v) để tái sinh cụm chồi Chồi in vitro tái sinh chuyển lên môi trường tương tự thêm AgNO3 từ 0,5-2,5 mg/L để thăm dò khả nhân cụm chồi Các chồi in vitro (3-4 cm) nuôi môi trường MS bổ sung NAA mg/L AgNO3 từ 0,5-2,5 mg/L để thăm dò khả tạo rễ Ni cấy callus Gốc (leaf-base) (0,2×1 cm) nuôi môi trường MS bổ sung 2,4-D mg/L BAP mg/L để tạo callus Các callus sơ cấp sau cắt thành khối nhỏ (đường kính ~ mm) cấy chuyển lên mơi trường có 2,4-D mg/L + KIN NAA từ 0,5-2 mg/L AgNO3 từ 0,5-2,5 mg/L để tăng sinh Nuôi cấy tế bào Chuyển g callus tuần tuổi vào bình tam giác 250 mL chứa 50 mL mơi trường MS lỏng có sucrose 20 g/L, bổ sung 2,4-D mg/L BAP mg/L, ni lắc 150 vòng/phút 18 ngày 2.2.2 Phân lập gen tổng hợp curcuminoid Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số từ nghệ đen tách chiết phương pháp CTAB theo Babu cs (2014) có cải tiến Khuếch đại PCR DNA tổng số nghệ đen sử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại gen dựa vào cặp primer đặc hiệu chúng thiết kế dựa gen tương ứng nghệ vàng (Bảng 2.1) 8 Bảng 2.1 Trình tự primer dùng để khuếch đại vùng CDS gen tổng hợp curcuminoid nghệ đen Gen Primer Trình tự nucleotide (5’- 3’) Chiều dài ước tính sản phẩm PCR (bp) DCS-F GTCGTTTCTGTGACCTTCT C CzDCS ~ 1400 DCS-R CTTTTGGATGCAGACTGG AACA CURS1-F CTGCGACTGCGAGAAGAA GC CzCURS1 ~ 1250 CURS1-R CAGATAGACAGCCATACA AACC CURS2-F GCACGCGTTTTCTTGCTAA TC CzCURS2 ~ 1300 CURS2-R GATCGTGTTCATAATTCAC TGG CURS3-F CTAGCTAGCTGCAATTCGT T CzCURS3 ~ 1250 CURS3-R GTGCTAGCTTAGCTTGAC GTA Tạo dòng giải gen Sản phẩm PCR tinh sạch, gắn vào vector pGEM®T-Easy T4 DNA ligase (Promega, Mỹ) biến nạp vào tế bào E coli TOP10 phương pháp sốc nhiệt Trình tự nucleotide sản phẩm PCR xác định phương pháp dideoxy terminator Xây dựng phả hệ Vùng CDS gen DCS, CURS1, CURS2, CURS3 nghệ đen nghệ vàng sử dụng để xây dựng phả hệ thông qua phần mềm MEGA7 2.2.3 Xác định biểu gen tổng hợp curcuminoid Xử lý elicitor Elicitor bổ sung vào môi trường nuôi cấy nồng độ khác (MeJA 25-150 µM, SA 50-150 µM YE 0,1-1,5 g/L) thời điểm khác (thời điểm ban đầu ngày thứ 5) Phân tích RT-PCR Mức độ biểu gen tổng hợp curcuminoid mẫu khác phân tích kỹ thuật PCR phiên mã ngược (RT-PCR) với primer đặc hiệu cho đoạn thị gen Bảng 2.2 Trình tự primer dùng để khuếch đại vùng thị gen tổng hợp curcuminoid nghệ đen Gen Primer Trình tự nucleotide (5’- 3’) ID-F ID-R IC1-F CzCURS1 IC1-R IC2-F CzCURS2 IC2-R IC3-F CzCURS3 IC3-R CzDCS TGCTCCGAGGTCACCGTGC GGTCAGCCCAATTTCGCGG CCGCTGGAAGGAATTGAAAAA GAGCTTGTCCGGGCTCAGCTG CCACCTCCGCGAGGTGGGGCT GCGGTGGCCAGCTTGCTCTGT CACCTGAGGGAAATCGGCTGG GCGAGCTTCCCCTGTTCCAGC Chiều dài Nhiệt độ gắn (bp) (oC) 272 55 286 55 211 55 202 50 2.2.3.3 Phân tích HPLC Tách chiết curcumin tiến hành theo phương pháp Paramapojn Gritsanapan (2009) Hàm lượng curcumin xác định dựa theo đường chuẩn curcumin 2.2.4 Xử lý thống kê Các thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên, thí nghiệm lặp lại lần Kết thí nghiệm tính trung bình phân tích ANOVA Duncan’s test với p