Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men tạo đồ uống từ nhãn (dimocarpus logan)

Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men tạo sản phẩm đồ uống từ nhãn .... Ảnh hưởng của pH môi trường tới quá trình lên men tạo sản phẩm đồ uống từ nhãn.... Ảnh hưởng của hàm lượng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

Người hướng dẫn khoa học

PGS.TS ĐINH THỊ KIM NHUNG

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian em thực hiện và hoàn thiện đề tài em đã nhậnđược sự hướng dẫn và giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cô, đặc biệt là quýthầy cô khoa Sinh – KTNN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xinđược gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung đã hếtlòng hướng dẫn, dạy bảo em nhiều kiến thức quý báu giúp em hoàn thành đềtài tốt nghiệp này Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáotrong trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 trong thời gian em học tập tạitrường đã tận tình giảng dạy cho em những kiến thức chuyên ngành giúp em

có nền tảng kiến thức để thực hiện đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơntới gia đình, bạn bè và người thân, những người luôn động viên, khích lệ emtrong suốt quá trình học tập nghiên cứu đề tài

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Vũ Thị Kiều Oanh

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan những gì em viết trong khóa luận này đều là kết quảnghiên cứu của cá nhân em Tất cả những số liệu trong bảng biểu và hìnhảnh đều được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, không có sốliệu sao chép hay bịa đặt Trong đề tài, em có sử dụng một số dẫn liệu củamột số tác giả khác, em xin phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung chokhóa luận của mình Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Hà Nội, tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Vũ Thị Kiều Oanh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích của nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

5 Điểm mới của đề tài 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1.Tổng quan về nước trái cây lên men 4

1.2 Tổng quan về cây nhãn 5

1.2.1 Vị trí phân loại 5

1.2.2 Đặc tính mùa vụ, năng suất 7

1.2.3 Thành phần dinh dưỡng 7

1.2.4 Ứng dụng 8

1.3 Hệ vi sinh vật 8

1.3.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo của nấm men 8

1.3.2 Sự sinh sản của nấm men 9

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men 9

1.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 10

1.4.2 Ảnh hưởng của pH 10

1.4.3 Ảnh hưởng của hàm lượng men giống 10

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 10

1.5.1 Trên thế giới 10

1.5.2 Tại Việt Nam 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng, thiết bị và hóa chất nghiên cứu 13

2.1.2.1 Thiết bị nghiên cứu 13

2.1.2.2 Hóa chất 13

2.1.3 Môi trường 14

2.1.3.1 Môi trường phân lập và giữ giống (g/l) (MT1) 14

2.1.3.2 Môi trường nhân giống g l MT2 14

2.1.3.3 Môi trường lên men g l MT3 14

2.2 Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Phương pháp vi sinh 15

2.3.1.1 Phương pháp phân lập các chủng VSV 15

2.3.1.2 Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram với nấm men 15

2.3.1.3 Xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đếm 16

2.3.1.4 Bảo quản chủng giống 16

2.3.1.5 Phương pháp hoạt lực lên men 17

2.3.1.6 Phương pháp hoạt hóa giống 17

2.3.1.7 Phương pháp lên men 17

2.3.2 Phương pháp hóa sinh 17

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến quá trình lên men 18

2.3.3.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên men 18

2.3.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH 18

2.3.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng giống 18

2.3.4 Phương pháp cảm quan 18

2.3.5 Phương pháp thống kê toán học 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo sản phẩm đồ uống từ nhãn 23

3.1.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo sản phẩm đồ uống từ nhãn 23

3.1.2 Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men tạo sản phẩm đồ

uống từ nhãn 24

3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men tạo sản phẩm đồ uống từ nhãn 28

3.3 Ảnh hưởng của pH môi trường tới quá trình lên men tạo sản phẩm đồ uống từ nhãn 30

3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng giống bổ sung tới quá trình lên men tạo sản phẩm đồ uống từ nhãn 31

3.5 Lên men tạo sản phẩm đồ uống từ nhãn 33

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ATP Adenozin triphotphat

CFU Colony Forming Unit đơn vị hình thành khuẩn lạcĐBSH Đồng bằng Sông Hồng

HL Hàm lượng

Nxb Nhà xuất bản

STT Số thứ tự

S.cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

Tb Tế bào

VSV Vi sinh vật

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của thịt nhãn 8

Bảng 2.2 Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của sản phẩm 19

Bảng 2.3 Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu 21

Bảng 2.4 Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm 21

Bảng 3.5 Hoạt lực lên men của chủng nấm men 24

Bảng 3.6 Chất lượng cảm quan của các chủng nấm men 25

Bảng 3.7 Động thái sinh trưởng của chủng nấm men S.cerevisiae M2 27

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men tạo sản phẩm đồ uống từ nhãn 38

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men tạo sản phẩmđồ uống từ nhãn 38

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của hàm lượng giống bổ sung tới quá trình lên men tạo sản phẩm đồ uống từ nhãn 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh cây nhãn 6H

ì n h 3 2 Ch ủ n g n ấm m en p h â n l ập đ ư ợ c tr ên m ô i trườ n g t h ạ ch đĩ a 23 Hình 3.3 Chủng nấm men M1 và M2 trên môi trường thạch nghiêng 24H

ì n h 3 4 H ì n h t h á i t ế b ào h ọ c c ủ a c h ủ n g n ấ m m en M2 t r ê n k í n h h i ể n v i

q u a n g h ọ c ( x 1 00 0 l ầ n ) 26 H

ì n h 3 5 Đồ t h ị b i ểu d i ễ n ả n h h ư ở n g c ủ a n hi ệ t đ ộ t ới q u á t r ì n h l ên m en

t ạo s ả n p h ẩm đ ồ u ố n g t ừ n h ã n 28 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên số lượng tế bào trung bình ở các

mức nhiệt độ khác nhau 29Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men tạo

sản phẩm đồ uống từ nhãn 30Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên số lượng tế bào trung bình ở các

độ pH khác nhau 31H

ì n h 3 9 Đồ t h ị b i ểu d i ễ n ả n h h ư ở n g c ủ a h à m lượ n g g i ố n g b ổ su n g t ớ i

q u á t r ì n h l ên m en t ạ o s ản p h ẩ m đ ồ u ốn g t ừ n h ã n 32

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cùng với sự phát triển của các ngành khoa học kỹ thuật, ngành côngnghệ sinh học nói chung và công nghệ lên men nói riêng cũng không ngừngphát triển và ngày càng có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực của đờisống kinh tế - xã hội Theo đó, ngành sản xuất nước trái cây lên men cũng cónhững bước phát triển mới: chất lượng ngày càng cao, số lượng ngày nhiều,mẫu mã ngày càng đẹp, giá thành hợp lý phù hợp với nhu cầu của số đôngngười tiêu dùng; đặc biệt là phụ nữ

Việt Nam là nước có khí hậu khô nóng nên nhu cầu về nước giải khátcủa người dân vô cùng lớn và đang chuyển dần từ loại nước giải khát pha chếthủ công sang sử dụng nước giải khát được sản xuất từ trái cây Tại Việt Nam,bình quân người Việt tiêu thụ nước giải khát là trên 23 lít người năm và theoHiệp hội bia rượu - nước giải khát dự tính đến năm 2020 con số này sẽ tiếptục tăng trưởng mạnh mẽ, đạt khoảng 8,3 - 9,2 tỷ lít năm [18] Theo dự đoáncủa các nhà chiến lược, trong các loại nước giải khát được sản xuất từ trái câythì loại nước giải khát lên men từ trái cây được đánh giá là mặt hàng mạnhtrong tương lai Chính vì vậy để đáp ứng nhu cầu thị trường và người tiêudùng các nhà khoa học đã nghiên cứu ra rất nhiều sản phẩm nước trái cây lênmen tự nhiên bổ dưỡng, có giá trị dinh dưỡng cao nhờ sự lên men của vi sinhvật Mặc dù hiện nay đã xuất hiện nhiều sản phẩm nước uống lên men từnhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như ổi, vải, chanh leo, cam, dâu… nhưngdòng sản phẩm giải khát lên men từ nhãn còn chưa có trên thị trường ViệtNam

Theo báo Nông nghiệp Việt Nam ngày 27 07 2018 , nhãn hiện là cây

ăn quả chủ lực tại các tỉnh miền Bắc, với tổng diện tích năm 2017 khoảng39,5 nghìn ha chiếm 11% diện tích cây ăn quả miền Bắc , tập trung tại một

số tỉnh vùng Trung du miền núi phía Bắc và ĐBSH, trong đó hai tỉnh trồngnhãn lớn nhất là Sơn La và Hưng Yên Sản lượng nhãn cả nước gần đây có xuhướng giảm nhẹ, nhưng biến động không lớn, duy trì ở mức 500 - 550 nghìn

chất lượng nhãn diễn ra rất mạnh Nếu như năm 2005, tổng diện tích nhãn cảnước lên tới 114 nghìn ha thì hiện nay chỉ còn khoảng 75 nghìn ha Mặc dùvậy, năng suất nhãn trung bình cả nước lại tăng từ 6,8 tấn ha năm 2005 lên7,94 tấn ha năm 2017 Một số ưu điểm nổi bật của cây nhãn có thể kể đếnnhư: dễ trồng, ít kén đất và mang lại nhiều giá trị; đặc biệt là cùi nhãn, vừađược dùng làm thực phẩm đồng thời là một vị thuốc thường được dùng trongĐông y chữa các chứng bệnh hay quên, thần kinh kém, suy nhược, hoảnghốt, khó ngủ… Vì vậy nước giải khát lên men từ nhãn là một sản phẩm đầytiềm năng trên thị trường trong và ngoài nước.

Để sản phẩm nước giải khát từ nhãn trước khi đến với người tiêu dùng

có chất lượng tốt thì cần phải tiến hành lên men tạo sản phẩm này trong điềukiện môi trường thích hợp nhất Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên

cứu đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men

tạo đồ uống từ nhãn (Dimocarpus logan)”.

2 Mục đích của nghiên cứu

Xác định được ảnh hưởng của nhiệt độ, độ pH môi trường, hàm lượnggiống bổ sung tới quá trình lên men tạo sản phẩm giải khát từ nhãn Lên men

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men tạo

đồ uống thơm ngon, bổ dưỡng trên môi trường dịch nhãn (Dimocarpus

logan).

3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men tạo sản phẩm đồ uống từ

nhãn (Dimocarpus logan)

3.3 Ảnh hưởng của pH môi trường tới quá trình lên men tạo sản phẩm đồ

uống từ nhãn (Dimocarpus logan)

3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng giống bổ sung tới quá trình lên men tạo sản

phẩm đồ uống từ nhãn (Dimocarpus logan)

3.5 Lên men tạo sản phẩm đồ uống từ nhãn (Dimocarpus logan)

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

4.1 Ý nghĩa khoa học

Dựa trên cơ chế của quá trình chuyển hóa từ đường thành rượu vàchuyển hóa từ rượu thành acid hữu cơ để tạo ra sản phẩm có hàm lượng rượuthấp, có hương thơm và giá trị dinh dưỡng cao

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sử dụng dịch nhãn lên men tạo được đồ uống lên men mới, góp phầnlàm đa dạng các loại sản phẩm nước trái cây lên men trên thị trường, đáp ứngnhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng Tận dụng được nguồn nguyênliệu rẻ, phổ biến lên men tạo đồ uống thơm ngon, có lợi cho sức khỏe conngười đồng thời giúp tạo công ăn việc làm và tăng thu nhập cho người nôngdân

5 Điểm mới của đề tài

Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men tạo đồ

trường là 4 - 4,5; hàm lượng giống bổ sung là 10%V cho chủng

Saccharomyces cerevisiae M2 Đưa ra được quy trình công nghệ lên mentạo đồ uống từ nhãn

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tổng quan về nước trái cây lên men

Nước trái cây lên men là sản phẩm của quá trình lên men rượu chưa kếtthúc Tùy vào nguyên liệu mà có các sản phẩm nước trái cây lên men khácnhau như nước trái cây lên men táo, dứa, chuối, sơri, đào,…

Đặc điểm sản phẩm nước trái cây lên men: nồng chất hòa tan 7 – 9%),

lượng thấp: 3 – 4g/l), thời gian tàng trữ để ổn định chất lượng 3 – 6 tuần), sảnphẩm có mùi thơm nhẹ dễ uống [12]

Giá trị dinh dưỡng của nước trái cây lên men: So với các loại sirô quảhiện nay thường bán trên thị trường thì nước trái cây lên men ngon và có tác

hòa tan vào nước giải khát, sau đó tác dụng với các chất hoặc nguyên tố cótrong thành phần của nước giải khát, tạo ra các este đơn giản và phức tạp nên

có mùi thơm và vị dịu hơn Giải nhiệt tốt hơn khi uống nước giải khát có ga

khoái Trong từ điển bách khoa về thực phẩm của Nga nói rằng: uống nướctrái cây lên men còn an toàn hơn cả uống nước và rất tốt cho sức khỏe, xuatan mệt mỏi, tốt cho tiêu hóa, giúp tăng sức chịu đựng Ngoài việc sử dụng đểgiải khát, nước trái cây lên men còn rất tốt cho những người bị cảm, sốt hay bị

dị ứng mỏi mệt kinh niên, bệnh phù, giúp tăng sức đề kháng cơ thể, ngừabệnh khô da vào mùa đông do trong nước trái cây lên men có khá nhiềukhoáng và vitamin B, C) [12]

● Cơ sở khoa học cả quá trình lên men nước trái cây:

Lên men nước trái cây là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của

Lên men ethanol

Đầu tiên, đường cùng các chất dinh dưỡng khác của môi trường lênmen được hấp thụ trên bề mặt của tế bào nấm men, khuếch tán qua màng bán

thấm vào trong tế bào Đường bị chuyển hóa qua một chuỗi phản ứng theocon đường đường phân để tạo acid pyruvic, acid pyruvic bị decarboxyl dướitác dụng xúc tác của enzyme pyruvate decarboxylase tạo thành acetaldehyde

Dihydroxyacetone phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trìnhđường phân, hợp chất này có thể chuyển hóa thành glycerol Trong môitrường pH acid, glycerol chỉ được tạo ra với hàm lượng nhỏ Ngược lại, trongmôi trường pH kiềm lượng glycerol sinh ra tăng lên rất nhiều và glycerol sẽtrở thành một trong những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men

Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid:

bào chất của nấm men Đây là quá trình trao đổi năng lượng cả nấm men

thải vào môi trường lên men Trong quá trình lên men ethanol, nhiều axit hữu

cơ được tạo thành The Moll, 1990 Một số axit hữu cơ được sinh tổng hợp

từ chu trình krebs nếu như quá trình lên men không diễn ra trong điều kiện kỵkhí nghiêm ngặt, các axit hữu cơ chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lênmen là: axit citric, axit malic, axit acetic, axit lactic…

có màu đỏ, khi chín vỏ quả nhãn có màu vàng da bò Nhãn xuồng cơm vàngthích hợp trên vùng đất cát; nếu trồng trên đất thịt hoặc sét nhẹ nên ghép trêngốc ghép là giống tiêu da bò.

● Nhãn lồng Hưng Yên

Nhãn Hưng Yên có quả to, vỏ gai và dày, vàng sậm Quả trên chùmnhãn có kích thước đồng đều Cùi nhãn dày và khô, mọng nước, hạt nhỏ Vịthơm ngọt như đ ư ờ n g p h è n Đáy quả có hai dẻ cùi lồng xếp rất khít

Hiện nay có một số dòng nhãn ưu tú:

- Dòng chín sớm: PHS99-1-1

- Dòng chín chính vụ: PHT99-1-2; PHT99-2-2; YB28; 2C

- Dòng chín muộn: PHM-1-1; PHM-2.1; HTM-1

● Nhãn tiêu da bò

Có tên gọi khác là "nhãn quế", nguồn gốc từ Huế Quả nhỏ, vỏ mỏng,nhẵn và có màu nâu sáng vàng Ở Việt Nam nhãn được trồng khá phổ biểndọc theo suốt chiều dài của đất nước từ Bắc vào Nam Do thu được hiệu quảkinh tế cao, những năm gần đây diện tích trồng nhãn phát triển khá nhanh.Tuy chưa có số liệu thống kê cụ thể, nhưng ước đoán hiện nay diện tích trồngnhãn ở nước ta vào khoảng 70-80 ngàn ha, trong đó các tỉnh phía Nam chiếmkhoảng 2 3 trong tổng diện tích này.

1.2.2 Đặc tính mùa vụ, năng suất

Giống địa phương nhãn nước có đặc tính dễ trồng thích hợp với đất thịtpha cát và cho năng suất cao, mỗi năm thường có 1 vụ vào khoảng tháng 8đến tháng 9 Một số giống nhãn khác như nhãn long, nhãn Vĩnh Châu có thểcho 2 vụ một năm vào tháng 2 – 3 và tháng 8 – 9

1.2.3 Thành phần dinh dưỡng

Nhãn là trái cây phổ biến của mùa hè ở một số quốc gia châu Á, có thể

ăn tươi hoặc sấy khô Loại quả này có vị ngọt, dễ ăn và chứa nhiều dinhdưỡng tốt cho sức khỏe Nhãn rất giàu giá trị dinh dưỡng như protein, chấtbéo, đường thiên nhiên, các loại vitamin và khoáng chất như: vitamin A, C,B1, B2, kali, photpho, magie, sắt, axit hữu cơ, chất xơ…Trong quả nhãn chứahợp chất có khả năng làm chậm quá trình lão hóa ở con người [22]

Nhãn giúp tăng cường hàm lượng vitamin C trong cơ thể con người.Trong thành phần của quả nhãn có chứa h àm l ượ n g V it a m i n C ca o , chỉ cầnvài quả nhãn thôi cũng đã đủ cung cấp lượng Vitamin C đủ để hoạt độngtrong 1 ngày Cứ 100 gam nhãn có chứa đến 84 mg hàm lượng vitamin C vàcon số này đủ cung cấp 100% nhu cầu vitamin C cần thiết hàng ngày cho nữ

và 93% nhu cầu cho nam giới Trong thành phần của quả nhãn có chứaRiboflavin, đây là một loại vitamin có tác dụng tích cực đối với mắt, nếu nhưthiếu loại vitamin này rất dễ dẫn đến hiện tượng đục thủy tinh thể hay mờ

Thịt quả nhãn có thành phần hóa học được nêu trong bảng sau [10]:

1.3 Hệ vi sinh vật

1.3.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo của nấm men

Nấm men thuộc nhóm sinh vật nhân chuẩn đơn bào, tế bào nấm men cóthành phần và cấu tạo khá phức tạp gồm thành tế bào, màng nguyên sinh chất,

tế báo chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào và các hạt dự trữ…[3]

Cấu tạo chủ yếu của tế bào nấm men là hemicellulose chiếm 70% trọnglượng khô trong đó 31% manman, 29% glucan ngoài ra còn chưa 1-3%kitin, 6-10% protein, 8-8,5% lipid, 7% khoáng

Hình thái tế bào: thường có dạng hình cầu, hình trụ, elip, ovan…, và cókích thước rất lớn gấp từ 5-10 lần tế bào vi khuẩn Chiều dài trung bình từ 9-

10 µm, chiều rộng trung bình từ 2-7 µm Ở mỗi loài, mỗi lứa tuổi và điều kiệnnuôi cấy khác nhau chúng có hình dạng và kích thước khác nhau [3]

Có rất nhiều cách phân loại,nấm men chủ yếu gồm hai lớp là nấm men

thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungiim porfecti)

+ Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công

nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Sacccharomyces; giốngSchizosaccharomyces giống Endomyces

+ Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti) gồm: Crytococus (toscula

tornlopsis); Mycoderma; Candida; Rhodotorula.

Khi cấy nấm men vào môi trường dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấmmen tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều chođến khi cơ chất của môi trường giảm đến mức thấp nhất thì quá trình sinhtrưởng phát triển của chúng chậm và ngừng hẳn Các nấm men sinh sản bằngphương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối rất lớn sau một thời gianngắn Tế bào sẽ già đi khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào khôngcòn khả năng sinh sản nữa Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản bằng phươngpháp nảy chồi nên hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ

1.3.2 Sự sinh sản của nấm men

Một số hình thức sinh sản của nấm men là nảy chồi, phân đôi, sinh sảnbằng bào tử và hình thành bào tử tiếp hợp đẳng giao, tiếp hợp dị giao, sinhsản đơn tính [3]

1.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ lên men, độ cồn đạt được và ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động của nấm men [18]:

thấp

độc cho nấm men

tạo điều kiện cho vi khuẩn hoạt động đặc biệt là vi khuẩn sinh khí chuyển hóađường thành acid acetic gây chua, làm giảm chất lượng sản phẩm [8,13]

Ở nhiệt độ cao nấm men phát triển càng nhanh sẽ tiết ra nhiều chất phụ.Trong suốt quá trình lên men nên giữ nhiệt độ ở mức ổn định do nhiệt

độ ảnh hưởng đến quá trình lên men và các chất hình thành

1.4.2 Ảnh hưởng của pH

Độ pH có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men Nấm men có thểphát triển trong môi trường pH từ 2 – 8 nhưng thích hợp nhất là từ 4 – 4,5.Nếu pH = 8 thì nấm men phát triển rất kém còn vi khuẩn lại phát triển rấtmạnh Vì thế trong quá trình lên men cần điều chỉnh pH phù hợp để nấm mensinh trưởng và phát triển thuận lợi [17] Trong sản xuất nước trái cây lên menngười ta thường sử dụng môi trường dịch quả có pH 3,5 – 5

1.4.3 Ảnh hưởng của hàm lượng men giống

Hàm lượng giống bổ sung là một trong những yếu tố quan trọng ảnhhưởng đến quá trình lên men: nếu hàm lượng quá nhiều sẽ gây cạnh tranhdinh dưỡng ảnh hưởng tới quá trình lên men, ngược lại nếu hàm lượng giốngquá ít thì quá trình lên men sẽ diễn ra chậm

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.5.1 Trên thế giới

Ngành sản xuất nước uống lên men đã có từ lâu đời và đang ngàycàng phát triển với tốc độ rất nhanh Trong số các loại nước giải khát thìđây được coi là mặt hàng chiến lược chủ yếu của thế kỷ XXI nên các quốcgia như Mỹ, Hà Lan, Trung Quốc, Nhật, Đức…đã và đang tập trung nghiêncứu và sản xuất các loại nước uống lên men từ nhiều loại trái cây khác nhaunhư táo, dứa, chanh leo, mơ, xoài… có chất lượng rất cao đáp ứng đượcnhu cầu ngày càng cao của con người Đối với những người tiêu dùng ở cácnước châu Âu và Mĩ do có thói quen ăn thịt, ít ăn rau đặc biệt là trẻ nhỏ nênnhu cầu sử dụng các loại nước trái cây và rau củ thơm ngon, bổ dưỡngngày càng tăng làm cho thị trường nước trái cây ngày càng phát triển Theothống kê, lượng nước giải khát trung bình người dân Mỹ tiêu thụ

216 lít năm, tiếp theo là Ireland và Na Uy Tính riêng việc tiêu thụ nước éptrái cây, đứng đầu là người dân Canada với 52,5 lít người năm, kế đến là

Mỹ và Đức 10 thị trường dẫn đầu là Mỹ, Nhật, Trung Quốc, Brazil, Đức,Mexico, Anh, Italy, Tây Ban Nha và Pháp với con số 2 3 doanh số toàncầu, tuy dân số chỉ ở mức 1 3 [23] Và theo dự đoán của các nhà chiếnlược, trong các loại nước giải khát được sản xuất từ trái cây thì loại nướcgiải khát lên men được đánh giá là mặt hàng “mạnh” trong tương lai vì đây

là sản phẩm được đánh giá có giá trị dinh dưỡng cao nhờ quá trình lên mencủa vi sinh vật và rất phù hợp với thế hệ trẻ

tiên xuất hiện với thành phần pha chế gồm nước lọc, chanh và một chút mậtong Đến năm 1767, một nhà hóa học người Anh là tiến sĩ Joseph Priestley

đã pha chế thành công loại nước giải khát có gas Tuy nhiên, phải đến năm

1832 loại nước khoáng có gas mới trở nên phổ biến nhờ sự ra đời của hàngloạt loại máy sản xuất nước có ga trên thị trường Những thập niên sau đóthị trường nước uống ngày càng phát triển [21]

1.5.2 Tại Việt Nam

Trong những năm gần đây thị trường nước giải khát tại Việt Nam cótốc độ phát triển khá nhanh Theo số liệu từ Bộ Công Thương 2010 , thị

tục tăng trưởng 17% vào năm 2011 Nielsen, 2011 , và được dự đoán còn đầytiềm năng khi thu nhập của người dân ngày càng được cải thiện và phần lớnchỉ tiêu đều dành cho việc ăn uống có lợi cho sức khỏe, và họ đang có xuhướng chú trọng nhiều hơn đến sản phẩm thiên nhiên Xu hướng này bắtnguồn từ nguyên liệu trái cây dồi dào, phong phú quanh năm của nước ta vàthị hiếu người tiêu dùng.

Ở Việt Nam có khá nhiều công trình nghiên cứu tạo các sản phẩm đồ uống lên men từ nguyên liệu tự nhiên như: vào năm 1984 Nguyễn Lân Dũng

và cộng sự đã có công trình nghiên cứu “Lựa chọn chủng nấm men và xây

dựng một quy trình mới sản xuất quả lên men BIEST1”[2], sau đó là các

nghiên cứu của các tác giả Trần Thanh Thủy 2003 , “Nghiên cứu sử dụng vi

sinh vật để lên men lactic đồ uống từ sắn”[20], Lê Cảnh Tuấn 2009

“Nghiên cứu quy trình sản xuất nước giải khát chanh dây lên men” [17].

Những năm gần đây có nhều công trình nghiên cứu về kombucha nhưnăm 2013, tác giả Lâm Thị Hồng Liên, trường đại học sư phạm Hà Nội 2 thực

hiện đề tài “Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà

Shan tuyết Hà Giang”, kết quả đã phân lập được 25 mẫu nấm men, từ đó định

loại sơ bộ 5 chủng nấm men là Sacharomyces M1; Sacharomyces M2;

Sacharomyces M3; Sacharomyces M4; Sacharomyces M5 Sau cùng tuyển

chọn 2 chủng nấm men M1 và M2 phù hợp cho quá trình lên men kombucha[6] Tác giả Nguyễn Thị Minh 2016 đã nghiên cứu và tìm ra được với hàm

g l thì thích hợp cho quá trình lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh, VĩnhPhúc [7]

Còn rất nhiều công trình khác nghiên cứu về đồ uống từ trái cây lênmen tuy nhiên có thể thấy, hiện nay trong nước chưa có công trình nghiên cứutạo sản phẩm đồ uống lên men từ nhãn cộng thêm việc nguồn nguyên liệu nàykhá dồi dào và giàu chất dinh dưỡng nên việc nghiên cứu ảnh hưởng của một

số yếu tố đến quá trình lên men tạo đồ uống từ nguồn nguyên liệu này là rấtcần thiết

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, thiết bị và hóa chất nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Quả nhãn

- Bộ phận sử dụng: cùi nhãn

- Nơi thu mẫu: phường Xuân Hòa, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc

- Nấm men phân lập được từ dịch nhãn

- Box vô trùng Haraeus

- Cân Precisa XT 320M - Thụy Sĩ

- Máy lắc Orbital Shakergallenkump Anh

- Máy li tâm Sorvall Mỹ

- Micropipet Jinson Pháp các loại từ 0.5μll – 10ml

- Kính hiển vi quang học Carl Zeiss Đức

- Tủ lạnh

- Máy đo pH

- Máy cất nước 2 lần Hamilton-Anh)

- Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn… vànhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác

2.1.2.2 Hóa chất

Hóa chất PTN Vi sinh vật khoa Sinh-KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội 2 cung cấp

- Nguồn nitơ: Nấm men, pepton, NH4)2SO4, dd NH3

- Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol, tím gentian, phenolphtalein…

2.2 Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian

- Phạm vi nghiên cứu: Chủng nấm men Saccharomyces, tuyển chọn trên

đối tượng là quả nhãn thu từ chợ Đồng Xuân Xuân Hòa , thị xã Phúc Yên,tỉnh Vĩnh Phúc

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm vi sinh vật khoa Sinh-KTNN, TrườngĐHSP Hà Nội 2

- Thời gian: Từ ngày 10 8 2018 đến tháng 5 2019 trừ khoảng thời gianthực tập sư phạm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

mặt thạch rồi dùng que chang vô trùng dàn đều

● Đặt ngược các hộp petri xuống, dùng giấy báo gói lại và nuôi

thạch sẽ xuất hiện các khuẩn lạc [5]

2.3.1.2 Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram với nấm men

Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng có khả năng lên mennước trái cây làm vết bôi trên lam kính nhuộm tế bào theo phương phápnhuộm Gram Sau đó soi tiêu bản dưới kính dầu và kính hiển vi quang học ở

độ phóng đại 1000 lần

Với nấm men: chỉ cần nhuộm bằng fucshin từ 1- 2p sau đó rửa bằng

2.3.1.3 Xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đếm

a Phương pháp xác định số lượng tế bào trên thạch đĩa [5]:

Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa nấm men, pha loãng theo phươngpháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipep hút 0,1ml pha loãng rồi changđều trên môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi sinh vật trong1ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức:

Trong đó: N – Tổng số CFU trong 1ml dịch huyền phù lúc đầu

A – số CFU trung bình đếm được trên một đĩa petri

V – thể tích mẫu cấy trên một đĩa petri

n – độ pha loãng của mẫu n lần

b Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm [5]:

Để đếm số lượng tế bào nấm men sử dụng buồng đếm hồng cầu

canh trường Dùng pipet lấy dịch pha loãng nhỏ 1 giọt vào giữa khung đếm,chú ý tránh tạo bọt và đậy lá kính lên để yên 3-5 phút, rồi tiến hành soi trênkính hiển vi ở vật kính 1000 Đếm số tế bào trong 4 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ởtrung tâm của khung đếm Cách tính số tế bào trong 1ml:

N=A x 25 : V : n

Trong đó: N – số lượng tế bào trong 1ml dịch huyền phù ban đầu

A – số lượng tế bào trung bình trong 1 ô lớn

n – độ pha loãng của mẫu

25 – số ô lớn của toàn khung đếm

2.3.1.4 Bảo quản chủng giống

Các khuẩn lạc sau khi phân lập được cấy chuyển sang môi trường giữ

nghiêng định kì hai tháng 1 lần [5]

2.3.1.5 Phương pháp hoạt lực lên men

Xác định hoạt lực lên men của mẫu nấm men đã được phân lập và

thì chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt

2.3.1.6 Phương pháp hoạt hóa giống

Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sửdụng phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vậtcho quá trình lên men Phương pháp hoạt hóa giống sử dụng môi trường tiêu

đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêngvào và nuôi lắc 135 vòng phút trong 24 giờ [4, 19]

2.3.1.7 Phương pháp lên men

phút, sau đó khử khuẩn ở đèn tím trong 15 phút Bổ sung vào môi trường10%V giống hoạt hóa TB ml Nuôi cấy ở điều kiện tĩnh trong 3 - 7 ngày

2.3.2 Phương pháp hóa sinh

- Xác định độ cồn:

Sử dụng cồn kế thả vào trong dịch nhãn và căn cứ vào độ chìm nổi củacồn kế mà đọc chỉ số trên vạch

 Lưu ý: Chỉ số độ cồn chỉ chính xác ở một nhiệt độ thích hợp 18 20% , còn trên hoặc dưới nhiệt độ đó, độ cồn trên cồn kế không chínhxác tuyệt đối và được coi là độ cồn biểu kiến Thông thường người ta

-sử dụng thêm một nhiệt kế cắm ngập vào dịch quả, cồn cần đo để lấynhiệt độ của dịch, cồn và kết hợp với độ cồn biểu kiến trên cồn kế đểtính toán bằng công thức cho ra độ cồn thực tế

- Xác định hàm lượng đường bằng đường kế

- Xác định độ pH bằng máy đo pH

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện m i trư ng đến quá trình lên men

2.3.3.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên men

Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men tạo nướcgiải khát, tiến hành nghiên cứu trên môi trường lên men chuẩn ở các điều kiện

đường sót g l , hàm lượng cồn %V sau 4 ngày lên men và xác định số

ra nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men tạo đồ uống giải khát từ nhãn

2.3.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH

Tiến hành nuôi lắc 24h chủng được tuyển chọn 135 vòng phút ở nhiệt

4; 4,5; 5 dùng HCl và NaOH để điều chỉnh pH Theo dõi các chỉ số về hàmlượng đường sót g l , hàm lượng cồn %V , số lượng tế bào nấm men trung

quá trình lên men

2.3.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng giống

Để nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng giống bổ sung đến quá trìnhlên men tạo nước giải khát từ nhãn, tiến hành nghiên cứu trên môi trường lên

8%V, 10%V, 12%V còn các thành phần khác giữ nguyên theo tỷ lệ môitrường cơ bản ban đầu Theo dõi sự biến thiên của hàm lượng đường sót g l ,hàm lượng cồn %V sau 4 ngày lên men ở các hàm lượng giống khác nhau

Từ đó chọn hàm lượng giống thích hợp cho quá trình lên men

2.3.4 Phương pháp cảm quan

Sử dụng cơ quan cảm giác của con người để tìm hiểu mô tả và địnhlượng các tính chất cảm quan vốn có của thực phẩm như: màu sắc, mùi vị,trạng thái…Cảm quan của sản phầm được đánh giá trên một số chỉ tiêu theoTCVN 3215 – 79 [14]: