Nghiên cứu ảnh hưởng của stress hormone dopamine lên các yếu tố độc lực của vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây hội chứng tôm chết sớm (early mortality syndrome (EMS)) ở đồng bằng sông cửu long, việt nam

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, đề tài tốt nghiệp: “Nghiên cứu ảnh hưởng stress hormone Dopamine lên yếu tố độc lực vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng tôm chết sớm (Early mortality syndrome (EMS)) đồng sông Cửu Long, Việt Nam” công trình nghiên cứu thực cá nhân tơi, thực lý thuyết kiến thức hướng dẫn Th.s Nguyễn Thảo Sương Số liệu dùng đề tài hồn tồn trung thực, có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng Đề tài có dùng tài liệu tham khảo đăng tải sách, tạp chí, báo cáo,trang web, từ khóa liên quan đến khóa luận, đồ án nước TP.HCM, ngày 20 tháng 09 năm 2015 Sinh viên thực Tô Thị Thơm LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đồ án tốt nghiệp, em nhận nhiều giúp đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ từ phía gia đình thầy bạn bè Nhờ mà em hồn thành đồ án mong muốn, cho phép em gửi lời cảm ơn sâu sắc chân thành đến: Đầu tiên em xin cảm ơn Th.s Nguyễn Thảo Sương người trực tiếp hướng dẫn đồ án thời gian vừa qua Trong suốt thời gian thực hiện, chị tận tình hướng dẫn, hỗ trợ truyền đạt nhiều kinh nghiệm, giúp em giải vấn đề nảy sinh trình làm đồ án hoàn thành đồ án định hướng ban đầu Tiếp đó, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến T.S Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Viện Nghiên cứu nôi trồng thủy sản 2, tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tốt đồ án Đồng thời cảm ơn anh chị, thầy cô Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2, tạo điều kiện thuận lợi cho mượn dụng cụ thí nghiệm hỗ trợ em trình làm đồ án Viện Sau đó, em xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ TP.HCM thầy cô khoa Công nghệ- Thực phẩm- Môi trường tận tình giúp đỡ em suốt năm học trường Cuối cùng, em xin cảm ơn ủng hộ, giúp đỡ gia đình, bạn bè, anh chị thầy cô động viên Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Chúc tất người sức khỏe hạnh phúc TP.HCM, ngày 20 tháng 09 năm 2015 Sinh viên thực Tô Thị Thơm Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AHPNS Acute hepatopancreatic necrosis Syndrome EMS Early Mortality Syndrome GAV Gill-associated virus IHHNV Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus LB Luria Broth TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose TSA Trytic Soya Agar TSB Trytic Soya Broth TSV Taura syndrome virus VP Vibrio parahaemolyticus WSSV White spot Syndrome Virus YHV Yellow head virus FAO Food and Agricultute Organization Ppt Part per thousand HCl Hydrocloric acid CFU Colony Forming Unit µM Micromol per litre Mm Millimetre Ml Mililitre H Hour LSI Larval Stage Index Mg Miligram i Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Khoảng chịu đựng tối ưu Vibrio parahaemolyticus Bảng 3.1: Đường kính vùng di động chủng vi khuẩn gây bệnh VP (mm) sau 16h 39 Bảng 3.2: Tỉ số đường kính vùng suốt xung quanh khuẩn lạc làm dung huyết, phân giải casein, phân giải chitin đường kính khuẩn lạc có/khơng bổ sung stress hormone 41 Bảng 3.3: Đường kính vùng di động chủng vi khuẩn gây bệnh VP (mm) sau 16h có/khơng bổ sung stress hormone chất ức chế stress hormone 43 Bảng 3.4: Tổng số tôm chết sau số tôm bể chết gần 50% 45 Bảng 3.5 : Tỉ lệ sống tôm thẻ chân trắng sau ngày thí ngiệm cảm nhiễm với V Parahaemolyticus có/khơng ni cấy với Dopamine chất ức chế LED 209 45 ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình1.1: Vi khuẩn V.parahaemolyticus mơi trường TCBS, CHrom agar Hình 1.2: Vi khuẩn V.parahaemolyticus Hình 1.3: Bệnh EMS/AHPNS tôm Hình 1.4: Tơm nhiễm bệnh EMS 11 Hình 1.5: Stress hormone 19 Hình 1.6: LED 209 21 Hình 1.7: Tổng sản lượng tôm nuôi giới 23 Hình 1.8: Tơm thẻ chân trắng 25 Hình 1.9: Bệnh WSSV tôm 26 Hình1.10 : Mơ tế bào bị bệnh hoại tử 27 Hình 1.11: Bệnh TSV tơm 28 Hình 1.12: Bệnh IHHNV tơm 30 Hình 2.1: Bố trí thí nghiệm 38 Hình 3.1: Khả di động Vibrio parahaemolyticus nồng độ ĐC, 50µM, 100µM 41 Hình 3.2: Biểu đồ đường kính vùng di động chủng vi khuẩn gây bệnh VP (mm) sau 16h 41 Hình 3.3: Biểu đồ tỉ số đường kính vùng suốt xung quanh khuẩn lạc phân giải chitin đường kính khuẩn lạc có/khơng bổ sung stress hormone 42 Hình 3.2: Khả dung huyết Vibrio parahaemolyticus nồng độ ĐC, 50µM, 100µM 43 Hình 3.3: Tỉ số đường kính vùng suốt xung quanh khuẩn lạc làm dung huyết đường kính khuẩn lạc có/khơng bổ sung stress hormone 43 Hình 3.3: Khả thủy phân casein Vibrio parahaemolyticus nồng độ ĐC,50µM, 100µM 44 Hình 3.4: Biểu đồ tỉ số đường kính vùng suốt xung quanh khuẩn lạc phân Đồ án tốt nghiệp giải casein đường kính khuẩn lạc có/khơng bổ sung stress hormone…………………………………………………………………………………… 44 Hình 3.4: Khả di động VP nồng độ ĐC, 50µM, 100µM, 0.05 LED209, 0.1 LED209 45 Hình 3.5: Đường kính vùng di động chủng vi khuẩn gây bệnh VP (mm) sau 16h có/khơng bổ sung stress hormone chất ức chế stress hormone 46 Hình 3.6: Thí nghiệm (N=16) tỉ lệ sống tôm thẻ chân trắng sau ngày thí ngiệm cảm nhiễm với V Parahaemolyticus có/khơng ni cấy với Dopamine chất ức chế LED 209 48 Hình 3.7 : Thí nghiệm ( N=12) tỉ lệ sống tôm thẻ chân trắng sau ngày thí ngiệm cảm nhiễm với V Parahaemolyticus có/khơng ni cấy với Dopamine chất ức chế LED 209…………………………………………………………………… 48 Hình 3.8 : Thí nghiệm ( N=20) tỉ lệ sống tơm thẻ chân trắng sau ngày thí ngiệm cảm nhiễm với V Parahaemolyticus có/khơng ni cấy với Dopamine chất ức chế LED 209……………………………………………………………………… 49 Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH ẢNH Error! Bookmark not defined LỜI MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Tình hình nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Mục đích nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Các kết đạt đề tài Kết cấu đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm 1.1.3 Ảnh hưởng vi khuẩn gây bệnh Vibrio parahaemolyticus nuôi trồng thủy sản 1.1.4 Các yếu tố độc lực vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 13 1.1.5 Quy chế biểu gen độc lực 18 1.1.6 Phương pháp kiểm soát yếu tố độc lực 20 Đồ án tốt nghiệp 1.2 Stress hormone catecholamine 22 Đồ án tốt nghiệp 1.2.1 22 1.3 Ảnh hưởng catecholamine lên tăng trưởng vi khuẩn Tôm thẻ chân trắng 23 1.3.1 Vai trò ngành cơng nghiệp ni tơm thẻ chân trắng 23 1.3.2 Đặc điểm sinh học tôm thẻ chân trắng 24 1.3.3 Một số bênh thường gặp tôm thẻ chân trắng 26 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 33 2.2 Vật liệu nghiên cứu 33 2.2.1 Hóa chất mơi trường 33 2.2.2 Dụng cụ 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Nguồn mẫu phân lập 34 2.3.2 Thí nghiệm in vitro 35 2.3.3 Thí nghiệm in vivo 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Ảnh hưởng stress hormone dopamine lên yếu tố độc lực Vibrio parahaemolyticus in vitro 39 3.1.1 Ảnh hưởng lên khả di động 39 3.1.2 Ảnh hưởng lên khả dung huyết, thủy phân casein thủy phân chitin……………………………………………………………………………4 3.3 Ảnh hưởng stress hormone dopamine tới độc lực Vibrio parahaemolyticus cảm nhiễm tôm thẻ chân trắng 44 3.3.1 Kết thí nghiệm LD50 44 3.3.2 Kết thí nghiệm challenge 45 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 vii S 10 o g S 10 o g S 20 uc g T h 04 Y 5g ea N 10 00 Môi trường TSA Tr y P h N a K 17 g 3g 5g 2, 5g G 2, lu 5g A 15 ga g N 10 00 Môi trường TSB Tr y P h N a K2 H G lu N 17 g 3g 5g 2, 5g 2, 5g 10 00 PHỤC LỤC B BẢNG SỐ LIỆU CỦA CÁC THÍ NGHIỆM Thí nghiệm invitro 1.1 Ảnh hưởng catecholamines lên khả di động Bảng 1.1: Kết vòng đo vi khuẩn (mm) 16h nồng độ ĐC, Dopamine 50, Dopamine 100 N g Đ h C i m 4 3 D o p 6 6 D o p 52 59 61 61 65 Bảng 1.2: Kết vòng đo vi khuẩn (mm) 16h nồng độ ĐC, Dopamine LED 0.05µM, LED 0.1µM N g Đ D L L i C o E E m p D D t 15 8 2 3 16 3 15 4 15 14 1.2 Ảnh hưởng catecholamines lên khả dung huyết Bảng 2.1: Tỉ số đường kính vùng suốt xung quanh khuẩn lạc enzyme hemolysin làm dung huyết tế bào máu đường kính khuẩn lạc có/khơng bổ sung stress hormone Ng hiệ ĐC m th ức C O D Z 1 2, 2 0, 2, 1, 2, Dopami Dopami ne 50 ne 100 O Z/ 2, 2, 2, C D 1, 1, 1, O Z 2, 2, 2, O Z/ 2, 1, 1, C O O D Z Z/ 1, 1, 80 1, 2, 2, 09 1, 2, 1, 92 1.3 Ảnh hưởng catecholamines lên khả phân giải Chitin Bảng 3.1: Tỉ số đường kính vùng suốt xung quanh khuẩn lạc enzyme hemolysin làm dung huyết tế bào máu đường kính khuẩn lạc có/khơng bổ sung stress hormone chất ức chế stress hormone Ng hiệ ĐC m th ức C O D Z 1 2 7 1 1 9 1 Dopami Dopami ne 50 ne 100 O Z/ 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, C D 5 6 5 O Z 2 1 2 2 O Z/ 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, C D 7 6 O Z 2 9 9 O Z/ 1, 18 1, 18 1, 21 1, 19 1, 27 1, 11 1, 27 1, 25 1, 19 1 1, 11 1, 4 1 1, 1 1, 1 1, 1 1, 6 6 2 2 2 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1 4 5 2 2 1, 29 1, 43 1, 1, 33 1, 1, 18 1.4 Ảnh hưởng catecholamines lên khả phân giải casein Bảng 4.1: Tỉ số đường kính vùng suốt xung quanh khuẩn lạc enzyme caseinase làm thủy phân casein đường kính khuẩn lạc có/khơng bổ sung stress hormone Ng hiệ ĐC Dopami m ne 50 th ức C O O C O O D Z Z/ D Z Z/ 1 1, 11 1, 3 11 1, 1 1, 2 1 1, 11 1, 2 5 11 1, 11 1, 4 1 1, 1 1, 3 7 1 1, 11 1, 1 1, 1 1, 5 1 1, 1 1, 3 1 1, 1 1, 4 Thí nghiệm invivo Dopami ne 100 C D 1 11 2 11 1 O Z 4 5 5 O Z/ 1, 1, 17 1, 36 1, 25 1, 25 1, 1, 36 1, 1, 33 2.1 Thí nghiệm LD50 - Kết theo dõi số tôm chết bể thí nghiệm 9/3 N 1 1 0/ N 1 11 /3 N 1 Bì Bì Bì n n nh 8 1 1 Bì Bì Bì n n nh X X X 2 1 1 Bì Bì Bì n n nh X X X 3 2 2 2.2 Thí nghiệm Chanllge - Kết tính tỷ lệ sống (%) Thí nghiệm : N=16 D o L L E E Thí nghiệm 2: N=12 D o L L E E Thí nghiệm 3: N=20 D o L L E E PHỤ LỤC C KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU Thí nghiệm invitro 1.1 Khả di động 1.1.1 Khả di động: ĐC, 50 µM, 100 µM Summary Statistics S C C A t o ve Đ 3a C 50 µ 10 5 T ot S o M M R t in ax an 4e 1n, 4 11, 5 -1 , , 4 1-1 , , 2 44 11, ANOVA Table S u S D M F- Pm ou f ea R V B of 28 147 et 27 9, W 2151 it 7, T 30 ot Multiple Range Tests C ou Đ C 5 H o M m ea 31 X 59X 61X C o Đ C Đ C 0- Si D +/ g iff * - * 5 1.1.2 Khả di động nồng độ ĐC, 50, 0.05 LED, 0.1 LED Summary Statistics C S o C A ta e o ve Đ n1, ff 5, C 4, 34 5 3, 9, 8, 56 0, 4, 70 5, 14 2, T 2 9, ot 5, 05 6, S M M R t in ax an 23 n 0, 33 0, 14 18 1, 00 14 1, 05 ANOVA Table S u S D M F- Pm o f ea R V B 133 464440 et W 16616 10 it T 15 19 ot Multiple Range Tests H o C M m ou ea og X 5 X Đ 24X C 5 38 X C o Đ C Đ C Đ C 05 00 L Si D +/ g iff * - 13 * 9, 4 1, 4 * 23 * 15 * -8 1.2 Khả dung huyết Summary Statistics S C Đ C T ot C A o ve , 31 , 31 , 92 , t o M in 0a e1 2, , 0 1, , , , , , 1 , , S M a 2, 2, 2, 2, R t an n1 , , 0 , , 0 , , , , ANOVA Table S u S D M F- Pm o f ea R V B 02 02, et 36 , W 0, it T 08 ot Multiple Range Tests C o Đ C H o M m ea 1X 1X 2X 1.3 Khả phân giải chitin Summary Statistics S C C A t o M o ve in Đ 15 a e 61, C , , 51 15 61, , , 21 15 71, , , 611 T 45 61, ot , , 811 ANOVA Table S S ou u B 0, et W 0, it T 0, ot S M R t ax an 1, n , 1, , 1, , 1, , D M F- Pf ea R V 0 4 1 0 8 Multiple Range Tests Đ C C M H ou ea o 1X , 1X , 1X , C Si D +/ o g iff Đ - C Đ 0 C , 0 0, 1.4 Khả phân giải casein Summary Statistics S C S C A t o M M R t o ve in ax an a e 71, n D 0, ,0 ,1 , , D 0, 61, ,0 ,2 , , D 0, 61, 1, C ,0 ,1 , T 0, 61, ot ,0 ,1 , , ANOVA Table S u S D M F- Pm ou f ea R V B of 00, et 04 , W 0, 24 it T 26 ot 0 Multiple Range Tests C ou D C D D H o M m ea 1X , 1X , 1X , C Si D +/ o g iff D D D 0 , 0 , 5 0 , nghiệm invivo Thí Thí nghiệm 1: N= 16 Summary Statistics C D C D op L E L E V P T ot St C A S o M M R nd o ve D in ax an 7, e 788 35 , 3 21 138 20 2, 5, 62 381 2, 3 63 281 0, 51 363 20 2, 5, 188 5 ANOVA Table S F u S D M - Pm ou f ea V B R3 et , , W 361 it T ot Multiple Range Tests C M H o ea o D X op 5, V X P 0, X L X E 0, L X E 2, D X C 3, C o D C D C D C D C D o D o D o L E L E L E Si D +/ g iff * 34 34 34 3 34 * - 34 * - 34 - 34 34 , 34 34 Thí nghiệm 2: N=12 Summary Statistics S C S C A ta o M M R t o ve in ax an n C n1 e 30, ol 306 C 3 6 ol 7 , C 508 ol C ol , C 3 6 ol 7 , T 5 1ot 0 0, ANOVA Table F S S D M ou u f ea R B e tW i 6 4 4 t T 111 ot , Thí nghiệm 3: N=20 Summary Statistics C S o S C A ta e M M R t o ve in ax an C n7 ff1 1n ol , 5 C 4 ol 5 C 301 ol 0 C 651 ol 5 C 5 ol , 0 T 521 ot 0 ANOVA Table S ou B et W it T ot S u D m f of 354 101 00 451 04 F M ea R8 , Multiple Range Tests C M H ou ea o C 3 X ol C 4X ol 3X C 4X ol 8X C X ol X C X ol 2 , ... Các kết đạt đề tài Đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng stress hormone Dopamine (Do) lên yếu tố độc lực vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hôi chứng tôm chết sớm (Early mortality syndrome (EMS)) đồng. .. hệ stress hormone Dopamine chất ức chế stress hormone LED 209 lên độc lực vi khuẩn VP gây bệnh tôm chết sớm tơm thẻ chân trắng Mục đích nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu để khảo sát ảnh hưởng stress. .. 1.1.4 Các yếu tố độc lực vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 13 1.1.5 Quy chế biểu gen độc lực 18 1.1.6 Phương pháp kiểm soát yếu tố độc lực 20 Đồ án tốt nghiệp 1.2 Stress hormone