Sau khi thăm dò được nồng độ bổ sung tối ưu nhất lă 100 µM MeJA, chúng tôi tiếp tục sử dụng nồng độ năy để thăm dò thời điểm bổ sung MeJA.
3.3.2.1. Sinh khối tế băo
Để thăm dò ảnh hưởng của thời điểm bổ sung MeJA lín sự sinh trưởng vă khả năng tích lũy asiaticoside của tế băo rau mâ, tôi tiến hănh như sau:
Lấy 3 g callus văng rời cho văo bình tam giâc có thể tích 250 mL chứa 50 mL môi trường lỏng có thănh phần cơ bản MS + 1 mg/L NAA + 1 mg/L BAP + 30 g/L sucrose. Sau 2 tuần nuôi cấy, tôi tiến hănh thu câc tế băo đồng nhất (tế băo sơ cấp).
Tiếp tục cấy chuyển 3 g tế băo sơ cấp trín văo môi trường có thănh phần cơ bản MS +1 mg/L NAA + 1 mg/L BAP + 30 g/L sucrose, đồng thời bổ sung MeJA 100 µM ở câc thời điểm 0, 5, 10 vă 15 ngăy. Sau 24 ngăy thu sinh khối tế băo để xâc định khối lượng tươi, khối lượng khô được, sau đó tâch chiết asiaticoside vă phđn tích HPLC.
Tế băo 24 ngăy tuổi đạt sinh khối cực đại, chúng tôi tiến hănh thu mẫu vă cđn khối lượng. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả được thể hiện ở bảng 3.6 vă bảng 3.7.
Bảng 3.6. Sinh khối tươi thu được sau khi bổ sung 100µM MeJA ở câc thời điểm khâc nhau sau (g)
Thời điểm(ngăy) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
0 5.28 5.36 5.32 5.32
5 6.42 6.4 6.21 6.34
10 6.54 6.4 6.33 6.43
Bảng 3.7. Sinh khối khô thu được sau khi bổ sung 100µM MeJA ở câc thời điểm khâc nhau (g)
Thời điểm(ngăy) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
0 0.54 0.53 0.53 0.53
5 0.77 0.76 0.76 0.76
10 0.77 0.77 0.77 0.77
15 0.81 0.83 0.83 0.82
Qua số liệu ở bảng 3.6 vă bảng 3.7, cho thấy ở câc thời điểm bổ sung 100 µM MeJA lă 5, 10,15, 20 ngăy thì sinh khối thu được có sự chính lệch nhau, biễu diễn ở biểu đồ 3.3 vă 3.4.
Biều đồ 3.3. Sinh khối tươi tế băo rau mâ sau khi bổ sung 100 µM MeJA ở câc thời điểm khâc nhau
Biều đồ 3.4. Sinh khối khô tế băo rau mâ sau khi bổ sung 100 µM MeJA ở câc thời điểm khâc nhau
Qua biểu đồ 3.3 vă biểu đồ 3.4 cho thấy sinh khối của tế băo tăng dần tương ứng với câc thời điểm bổ sung MeJA lần lượt lă: 0, 5, 10 vă 15 ngăy sau nuôi cấy, trong đó bổ sung MeJA văo ngăy thứ 15 cho hiệu quả cao nhất với khối lượng tươi thu được đạt 7.18 g nhưng thấp hơn so với đối chứng (8.08 g). Kết quả của chúng tôi lă tương tự với kết quả của Nguyễn Hoăng Lộc vă cs (2010) vă Nguyễn Hoăng Lộc vă cs (2012). Lý do với tính chất sinh trưởng của tế băo trong nuôi cấy mẻ, khi bổ sung MeJA văo môi trường nuôi cấy sẽ ức chế sự sinh trưởng của tế băo trong đó sự ức chế mạnh nhất nếu bổ sung văo đầu chu kỳ sinh trưởng vă ức chế yếu nhất nếu bổ sung văo giữa pha log (ngăy thứ 15).
3.3.2.2. Khả năng tích lũy asiaticoside của tế băo
Chúng tôi tiến hănh tâch chiết vă chạy HPLC để định tính vă định lượng asiaticoside của tế băo 24 ngăy tuổi có bổ sung 100µM MeJA ở câc thời điểm khâc nhau. Kết quả chạy HPLC được thể hiện qua hình 3.9-3.11. Phđn tích HPLC asiaticoside cho thấy tất cả phổ sắc ký đều có 1 peak chính giống nhau ở thời gian lưu khoảng 2,03 phút, gần trùng với peak của asiaticoside chuẩn
vă một số peak phụ có diện tích không đâng kể. Như vậy trong câc mẫu có asiaticoside. Câc peak năy khâc nhau về chiều cao vă độ rộng ở câc thời điểm bổ sung MeJA khâc nhau, hăm lượng asiaticoside được thể hiện qua bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 100 µM MeJA lín khả năng tích lũy asiaticoside của tế băo rau mâ
Thời điểm (ngăy) Diện tích peak Thời gian lưu (phút) Hăm lượng asiaticoside (mg/g) 0 2945603 2,03 99,69 5 2908595 2,06 108,6 10 6084305 2,00 205,92 15 5210892 2,05 176,37 Đối chứng 1608494 2,06 54,44
Kết quả bảng 3.8 cho thấy, hăm lượng asiaticoside tích lũy trong tế băo nuôi cấy trín môi trường bổ sung MeJA ở những thời điểm khâc nhau có sự chính lệch đâng kể. Trong đó, khả năng tích lũy asiaticoside của tế băo rau mâ được nuôi cấy trín môi trường có bổ sung MeJA ở thời điểm 10 ngăy tốt nhất với hăm lượng asiaticiside đạt 205,92 mg/g khối lượng khô, cao gấp 3,78 lần so với đối chứng. Nguyín nhđn có thể liín quan đến thời gian hoạt hóa câc gen mê hóa câc enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp centelloside [18]. Kết quả năy của chúng tôi khâc so với kết quả nghiín cứu của Bonfic vă cs (2010) lă khả năng tích lũy centellosides của tế băo rau mâ được nuôi cấy trín môi trường có bổ sung 100 µM MeJA ở thời điểm 15 ngăy lă tối ưu nhất. Lý do thời điểm bổ sung kích khâng MeJA tối ưu nhất để tăng khả năng tích lỹ câc HCTC lă khâc nhau.
Độ ộ hấ p th ụ qu an g (m A U ) Đ ộ hấ p th ụ qu an g (m A U )
Thời gian lưu (phút)
Hình 3.9. Phổ HPLC của dịch chiết asiaticoside từ tế băo nuôi trín môi trường bổ sung 100 µM MeJA ở thời điểm 5 ngăy
Thời gian lưu (phút)
Hình 3.10 Phổ HPLC của dịch chiết asiaticoside từ tế băo nuôi trín môi trường bổ sung 100 µM MeJA ở thời điểm 10 ngăy
Độ ộ hấ p th ụ qu an g (m A U )
Thời gian lưu (phút)
Hình 3.11 Phổ HPLC của dịch chiết asiaticoside từ tế băo nuôi trín môi trường bổ sung MeJA ở thời điểm 15 ngăy
Thời gian lưu (phút)
Hình 3.11 Phổ HPLC của dịch chiết asiaticoside từ tế băo nuôi trín môi trường bổ sung MeJA ở thời điểm 15 ngăy
Thời gian lưu (phút)
Hình 3.11 Phổ HPLC của dịch chiết asiaticoside từ tế băo nuôi trín môi trường bổ sung MeJA ở thời điểm 15 ngăy
Thời gian lưu (phút)
Hình 3.11 Phổ HPLC của dịch chiết asiaticoside từ tế băo nuôi trín môi trường bổ sung 100 µM MeJA ở thời điểm 15 ngăy