Bước đầu nghiên cứu tổng hợp và thiết lập tạp chuẩn captopril disulfid

Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm các bộ phận chính sau :  Bơm cao áp : Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN BÌNH NGUYÊN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ

THIẾT LẬP TẠP CHUẨN CAPTOPRIL

DISULFID

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH : KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ : 60720410

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS.Nguyễn Hải Nam

Nơi thực hiện đề tài:

Bộ môn Hóa Dược – Trường Đại Học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những

sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người

khác Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học đến nay,

em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và

bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Bộ môn Hóa

Dược cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý

báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại bộ môn

Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới GS TS Nguyễn Hải Nam, ThS

Trần Lan Hương đã tận tâm hướng dẫn em trong suốt quá trình học tập cũng

như hướng dẫn khoa học Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của thầy

cô thì em nghĩ bài luận văn này của em rất khó có thể hoàn thiện được Một

lần nữa, em xin chân thành cám ơn thầy cô

Em cũng xin cám ơn tới thầy Lê Xuân Kỳ - Bộ môn Hóa lý, các anh chị kỹ

thuật viên ở bộ môn Hóa Phân tích, các anh chị ở Khoa Hóa Pháp – Viện pháp y

quốc gia, các anh chị đồng nghiệp ở chuyên ngành kiểm nghiệm lớp cao học 19

đã giúp đỡ em trong suốt quá trình làm và hoàn thiện luận văn này

Bài luận văn này được thực hiện trong khoảng thời gian dài Bước đầu đi

vào thực tế tìm hiểu về lĩnh vự sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, kiến thức của

em còn nhiều hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ Do vậy không tránh khỏi những thiếu

sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được các ý kiến đóng góp quý báu của

các thầy cô để kiến thức của em trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn

Sau cùng, em xin kính chúc quý Thầy Cô ở bộ môn Hóa Dược và GS.TS

Nguyễn Hải Nam, ThS.Trần Lan Hương thật dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp

tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai

sau

Trân trọng cám ơn

Hà Nội, ngày 19 tháng 8 năm 2015

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.2: Mối tương quan giữa lượng Iod thêm vào và khối lượng

Bảng 3.5: Tương quan giữa khối lượng cân và lượng dung môi thêm

Bảng 3.10: Kết quả xác định độ tinh khiết bằng đo quét nhiệt vi sai 48

Bảng 3.12: Thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết khi chạy độ

ổn định

53

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 3.5: Mối tương quan giữa lượng Iod thêm vào và khối lượng

cắn

39

Hình 3.8: So sánh phổ hồng ngoại giữa Captopril Disulfid với

Captopril

45

Hình 3.19: Sắc ký đồ của Captopril Disulfid 52

Mục lục

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1

1.1 CHẤT CHUẨN VÀ TẠP CHUẨN DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM 1

1.1.1 Chất chuẩn dùng trong kiểm nghiệm [11] 1

1.1.2 Tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm [9][10] 1

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ CAPTOPRIL 2

1.1.1 Công thức, tính chất 2

1.1.2 Tác dụng, chỉ định, chống chỉ định : 3

1.3 KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU CAPTOPRIL VÀ CÁC CHẾ PHẨM CHỨA CAPTOPRIL 4

1.3.1 Định tính 4

1.3.2 Định lượng 5

1.3.3 Tạp chất liên quan 6

1.4 ĐẠI CƯƠNG VỀ CAPTOPRIL DISULFID 9

1.4.1 Công thức, tính chất 9

1.4.2 Độc tính [18] [24] [42] [44] [45] 10

1.4.3 Các sản phẩm chuyển hóa của Captopril Disulfid 10

1.5 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP LIÊN KẾT DISULFID 11

1.5.1 Phương pháp 1 [27] 11

1.5.2 Phương pháp 2 [32] 12

1.5.3 Phương pháp 3 [37] 12

1.5.4 Tác nhân oxy hóa là Na 2 S 4 O 6 [28] 13

1.5.5 Tác nhân oxy hóa là K 3 (Fe(CN) 6 ) [30] [38] 14

1.5.6 Tác nhân oxy hóa là H 2 O 2 [47] 15

1.5.7 Với tác nhân oxy hóa là Br 2 ,KBrO 3 [25] 15

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HỮU CƠ [5] 16

1.6.1 Phổ IR 16

1.6.2 Phổ khối – Mass spectrum 17

1.6.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 17

1.7 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO [1][4][46] 18

1.7.1 Định nghĩa 18

1.7.2 Các thông số cơ bản của quá trình sắc ký 18

1.7.3 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC 20

1.7.4 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 21

1.7.5 Phương pháp định lượng bằng HPLC 24

1.9 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH [10] 26

1.9.1 Yêu cầu chung 26

1.9.2 Các tiêu chí trong thẩm định phương pháp 26

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 28

2.1.1 Hóa chất, thuốc thử 28

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 28

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.2 Nội dung nghiên cứu 29

2.2.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 32

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 33

3.1 NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP CAPTOPRIL DISULFID TỪ CAPTOPRIL Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 33

3.1.1 Lựa chọn phương pháp và khảo sát điều kiện tổng hợp Captopril Disulfid 33

3.1.2 Tinh chế Captopril Disulfid 42

3.1.3 Quy trình bán tổng hợp và tinh chế Captopril Disulfid 43

3.2 XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU NHẬN DẠNG VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CAPTOPRIL DISULFID 43

3.2.1 Đặc điểm cảm quan 43

3.2.2 Nhiệt độ nóng chảy - DSC 43

3.2.3 Kết quả đo phổ 44

3.2.4 Độ tinh khiết của hợp chất 47

3.3 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU 48

3.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích 48

3.3.2 Áp dụng phương pháp xây dựng tiến hành định lượng Capotpirl Disulfid trong mẫu đã tổng hợp được 60

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 62

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……….66

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tạp chuẩn trong kiểm nghiệm dược phẩm là chất chuẩn của các tạp chất liên quan trong nguyên liệu làm thuốc hoặc thuốc thành phẩm Các nguyên nhân dẫn đến xuất hiện tạp chất liên quan: có sẵn trong nguyên liệu điều chế, tạo ra trong quá trình điều chế, xuất hiện trong quá trình bảo quản nguyên liệu làm thuốc và thuốc thành phẩm

Thông thường giới hạn tạp chất liên quan được kiểm soát bằng cách so sánh đáp ứng (ví dụ: diện tích pic trong kỹ thuật HPLC) của tạp chất so với đáp ứng của hoạt chất chính trong cùng điều kiện

Tuy nhiên với những tạp chất ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả điều trị, tác dụng không mong muốn hoặc thường xuất hiện với tỷ lệ lớn thì có yêu cầu định lượng hàm lượng tạp chất Việc định lượng này bắt buộc phải có tạp chuẩn để so sánh Đối với các hội đồng Dược Điển Anh, Mỹ, Nhật Bản thì các tạp chuẩn cần thiết luôn được cung cấp bởi bộ phận chuyên trách thuộc hội đồng Dược Điển Trong đó Captopril Disulfid là sản phẩm oxy hóa của Captopril Trong các chuyên luận dược điển về nguyên liệu và các dạng bào chế của Captopril thường

có chỉ tiêu yêu cầu định lượng tạp chất Captopril Disulfid Lý do là vì tạp chất này thường xuất hiện với tỷ lệ cao, ảnh hưởng đến độ tinh khiết hóa học của thuốc Hiện tại, tạp chuẩn Captopril Disulfid cũng như nhiều tạp chuẩn khác phải mua

từ nước ngoài với giá cao Vì vậy, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài: “Bước

đầu nghiên cứu tổng hợp và thiết lập tạp chuẩn Captopril Disulfid”

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1.1 CHẤT CHUẨN VÀ TẠP CHUẨN DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM 1.1.1 Chất chuẩn dùng trong kiểm nghiệm [11]

Hiện nay, theo dược điển Việt Nam IV thì hầu các phương pháp kiểm nghiệm các chế phẩm đều phải sử dụng chất chuẩn để so sánh và đối chiếu Gồm có các dạng:

Dạng nguyên chất - neat : ưu điểm của loại này là có hạn dài, có thể pha ra các loại nồng độ khác nhau Tuy nhiên dạng này cũng đòi hỏi trình độ pha chế chuẩn, ngoài ra một số chất chuẩn đòi hỏi pha chế trong điều kiện tiêu chuẩn như

Aflatoxin, Asen, đồng vị phóng xạ

Dạng pha chế sẵn - ready to use : ưu điểm là có nồng độ rất tin cậy, tuy nhiên khi đặt cần đặc biệt chú ý về dung môi của chất chuẩn Các dung môi nên gần nhất với dung môi pha mẫu Thông thường các dung môi là nước, Methanol, Aceton, Acetonitril, n-Hexan, Dichloromethan, acid HCl, HNO3

Hỗn hợp chuẩn - Mix là hỗn hợp các chất chuẩn pha trong một loại dung môi có nồng độ biết trước hỗn hợp chuẩn có ưu điểm dùng trong phân tích đa thành phần với các yếu tố ảnh hưởng Người sử dụng có thể quan sát thời gian lưu, cường độ tín hiệu tương đối của các cấu tử trên tài liệu đi kèm chất chuẩn Mẫu chuẩn - Reference certified material : Gần như hỗn hợp chuẩn nhưng thành phần và nồng độ các cấu tử mô phỏng một mẫu có thật trong tự nhiên ví dụ mẫu nước thải, mẫu bùn thải, mẫu ngô nhiễm nấm, mẫu thép

1.1.2 Tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm [9][10]

Theo dược điển Việt Nam 4 thì có hơn 20 chuyên luận về dạng bào chế có yêu cầu bắt buộc phải sử dụng tạp chuẩn Trên thực tế hiện nay các cơ sở trong nước mới chỉ đáp ứng được một số tạp chuẩn như bảng sau:

Bảng 1.1- Các tạp chuẩn đã được thiết lập bởi các cơ sở trong nước

Sản phẩm phụ trong quá trình tổng hợp hoạt chất

4

2-amino-1-(4-nitrophenyl)

propan-1,3-diol

Do nhu cầu sử dụng hạn chế, có ít nhà cung cấp nên giá thành của tạp chuẩn thường cao gấp nhiều lần so với chất chuẩn dược chất Đặc biệt khác với chất chuẩn dược chất, một số tạp chuẩn thường không có sẵn ở nhà máy, mặt khác giá thành chất chuẩn của tạp chất là cao dẫn đến khó khăn triển khai các tiêu chuẩn này trên thực tế, khó tuân thủ các tiêu chuẩn dược điển của nguyên liệu và thành

 Công thức phân tử : C9H15NO3S ; M = 217,28;

 Tính chất:

Bột kết tinh màu trắng ngà, ở 25oC: tan tốt trong nước (160 mg/ml), ethanol, methanol, methylclorid, tan trong glyceryl triacetat (20 mg/ml), trong dung dịch NaOH loãng, rất ít tan trong dầu ngô, ethyl acetat (< 1mg/ml) Nhiệt

độ nóng chảy: 105oC – 108oC Góc quay cực riêng trong ethanol tuyệt đối là αD25

= - 127,8o, hai đồng phân R,S có góc quay cực riêng lệch nhau +5o Hằng số phân

ly trong nước pKa lần lượt là 3,7 (-COOH) và 9,8 (-SH) Hệ số phân bố logP (octhanol/nước) = 0,34, logP (CH2Cl2/nước(pH=2)) = 1,39, logP (octhanol/HCl 0,1M) =1,9 [6] [12] [13] [14]

1.1.2 Tác dụng, chỉ định, chống chỉ định :

1.1.2.1 Dược động học :[3] [8]

Captopril hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, có Ftuyệt đối là 60% - 75%, Cmax

trong huyết tương đạt được khoảng 1 giờ sau khi uống Captopril liên kết với protein khoảng 30% Chủ yếu được bài tiết trong nước tiểu, khoảng 40% - 50% đào thải qua thận ở dạng còn nguyên hoạt tính, còn lại chuyển hóa qua gan thành dạng Captopril Disulfid và Captopril-Cystein Captopril có t1/2= 2–3h, Cls=13,33 ml/min/kg

1.1.2.2 Dược lực học [3] [8] [33]

Captopril có tác dụng ức chế enzym chuyển Angiotensin I→Angiotensin

II, giảm tái hấp thu muối nước ở ống thận nên hạ huyết áp, giảm tiết các yếu tố gây phì đại cơ tim và phì đại mạch máu Captopril được chỉ định trong điều trị tăng huyết áp, điều trị suy tim, đau thắt ngực, bệnh thận do tiểu đường phụ thuộc Insulin có protein niệu > 300mg/24h

1.1.2.3 Chỉ định và tác dụng không mong muốn [3] [8] [33]

Liều dùng: Điều trị tăng huyết áp : liều đầu 12,5mg /lần x 2 lần /ngày, sự tăng giảm phụ thuộc vào huyết áp của bệnh nhân, nếu sử dụng thêm thuốc lợi tiểu thì liều đầu là 6,25 mg/lần x 2 lần /ngày Điều trị bệnh thận do tiểu đường : 75-

100 mg/ngày, với bệnh nhân suy thận cần được hiệu chỉnh liều cho phù hợp với từng đối tượng Một số chế phẩm Captopril đang có trên thị trường đươc trình bày

Hydroclothiazid 25mg

Bristrol-myers Ssquibb

Captopril

STADA®25

GmnH

1.3 KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU CAPTOPRIL VÀ CÁC CHẾ

PHẨM CHỨA CAPTOPRIL

1.3.1 Định tính

1.3.1.1 Nguyên liệu Captopril

Dựa vào phổ hấp thụ hồng ngoại của nguyên liệu phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của Captopril chuẩn [20]

Hình 1.1: Phổ hồng ngoại của Captopril chuẩn

1.3.1.2 Chế phẩm chứa Captopril

A Cân một lượng bột viên tương ứng với 50 mg Captopril, thêm 5 ml

ethanol 96% (TT), lắc kỹ 5 phút, lọc Lấy 2 ml dịch lọc, thêm một vài tinh thể natri nitrat (TT) và 10 ml dung dịch acid sulfuric 10% (TT), lắc mạnh, xuất hiện

màu đỏ

B.Trong phần Định lượng, thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ thu được của dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu của pic Captopril trong sắc ký đồ thu được của dung dịch chuẩn

1.3.2 Định lượng

1.3.2.1 Nguyên liệu Captopril [17]

Định lượng Captopril bằng phép đo Iod

Nguyên tắc : Oxy hóa Captopril bằng dung dịch I2 Hòa tan 0,15g chế phẩm trong 30,0 ml nước cất Chuẩn độ bằng dung dịch Iod 0,05 M Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (dùng điện cực Platin)

và nhiều tiêu chuẩn cơ sở khác

 Phương pháp định lượng thực hiện đơn giản Tuy vậy, nếu trong nguyên liệu có các tạp khử hoặc oxy hóa khác có thể dẫn đến sai số Đồng thời, Captopril

có nhiều mức oxy hóa nên bước nhảy thế có thể diễn ra ở nhiều mức khác nhau, điều này cũng sẽ ảnh hưởng tới kết quả định lượng

1.3.2.2 Chế phẩm chứa Captopril [17]

Tiến hành bằng phương pháp sắc ký lỏng

Pha động: Hỗn hợp methanol - nước - acid phosphoric (550 : 450 : 0,5)

Dung dịch chuẩn: Dung dịch có nồng độ Captopril chuẩn 0,01% và Captopril

Disulfid chuẩn 0,0005% trong pha động

Dung dịch thử: Cân 20 viên (đã loại bỏ lớp vỏ bao, nếu là viên bao), nghiền thành

bột mịn Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 25 mg Captopril vào ống ly tâm, thêm 25,0 ml pha động, để siêu âm 15 phút và ly tâm Pha loãng

1 ml dịch trong ở trên thành 10,0 ml với pha động

Điều kiện sắc ký:

Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C18 (10 m)

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 220 nm

Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

Thể tích tiêm: 20 l

Cách tiến hành: Tiêm dung dịch chuẩn Phép thử chỉ có giá trị, khi hệ số phân

giải giữa pic Captopril và pic Captopril Disulfid trong sắc ký đồ thu được ít nhất

là 2,0

Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn và dung dịch thử

Tính hàm lượng Captopril, C9H15NO3S, trong viên dựa vào diện tích (hay chiều cao) pic Captopril thu được của dung dịch chuẩn, dung dịch thử và nồng độ

C9H15NO3S của dung dịch chuẩn

1.3.3 Tạp chất liên quan

1.3.3.1 Phương pháp 1: Phương pháp sắc ký lỏng (theo ĐVN IV)

Đối với tạp chất là Captopril Disulfid

Pha động:Acid phosphoric - methanol - nước (0,05 : 50 : 50)

Dung dịch thử: Hoà tan 50 mg chế phẩm trong pha động và pha loãng bằng pha

động thành 100,0 ml

Dung dịch đối chiếu (1): Pha loãng 2,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng pha

động

Dung dịch đối chiếu (2): Hoà tan 10 mg chế phẩm trong pha động, thêm 1 ml dung dịch iod 0,05 M rồi pha loãng thành 100,0 ml bằng pha động Lấy 10,0 ml

dung dịch này cho vào bình định mức 100,0 ml, thêm pha động đến vạch

dịch đối chiếu (2) có 3 pic Độ phân giải giữa hai pic cuối ít nhất là 2,0

Tiêm dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (1): Trên sắc ký đồ của dung dịch thử,

diện tích của bất kỳ pic phụ nào không được lớn hơn ½ lần diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (1,0%) Tổng diện tích của tất cả các pic phụ trừ các pic có diện tích bằng hoặc nhỏ hơn 0,1 lần diện tích của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,2%) và diện tích các pic có thời gian lưu nhỏ hơn 1,4 phút) không được lớn hơn diện tích của pic chính trên sắc

ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (2,0%)

1.3.3.2 Phương pháp 2: Chạy sắc ký lỏng – gradient [41]

Dung dịch A: Methanol

Dung dịch B: 0.1 % Acid Trifluoroacetic trong nước

Dung môi pha loãng: Acid Trifluoroacetic : Nước : acetonitrile = 0.1:90:10

Chương trình chạy Gradient:

Thời gian (phút) Dung dịch A (%) Dung dịch B(%)

USP Captopril E RSvà tạp USP Captopril J RS trong hệ dung môi pha loãng

Dung dịch mẫu : 2.0 mg/mL của Captopril trong hệ dung môi pha loãng

Điều kiện sắc ký :

Phát hiện : UV : 220nm

hoặc MS : ES Scan ( + hoặc –): Hiệu điện thế U= 500(V)

Dòng khí : 8 lít/phút Phun sương : 35psig Nhiệt độ làm khô : 300oC

Cột : 15cm x 4,6mm; 2,7µm L60

Tốc độ dòng : 0.7 ml/min

Nhiệt độ cột : 40oC

Thể tích tiêm : 10µl

Hình 1.2: Kết quả sau khi chạy sắc ký

Hình 1.3 : Phân tích thông số sắc ký

1.4 ĐẠI CƯƠNG VỀ CAPTOPRIL DISULFID

1.4.1 Công thức, tính chất

 Công thức hóa học: [32]

Có thể gây ra tăng trưởng ở các tuyến, nhưng hiếm khi gây ra bệnh ung thư

ác tính Tiếp xúc với một lượng nhỏ có thể gây ra phản ứng quá mẫn cấp tính đặc trưng bởi sự co thắt phế quản, phát ban, phù chảy nước mũi (viêm mũi) và mờ mắt Sốc phản vệ và phát ban da - ban xuất huyết có thể xảy ra

1.4.3 Các sản phẩm chuyển hóa của Captopril Disulfid

1.4.3.1 Các sản phẩm oxy hóa

Chất xúc tác là MoO2Cl2(DMSO)2 với lượng bằng 5 mol% RSH, dung môi

là DMSO (Di methyl sulfoxid), nhiệt độ phản ứng là : nhiệt độ phòng (25oC) hoặc cao hơn (= 70oC với alkyl-thiol ), thời gian phản ứng là từ 20 phút đến 24 giờ Hiệu suất từ 87% đến 98%

Nhiệt độ phản ứng: nhiệt độ phòng, thời gian phản ứng 0,5 h

Nhận xét :

Dung môi để phản ứng là ethyl acetat không hòa tan Captopril, nhưng lại hòa tan Captopril Disulfid nên khó tinh chế Mặt khác OI - có khả năng oxy hóa RSSR lên bậc oxy hóa cao hơn tạo ra nhiều sản phẩm phụ hơn

1.5.3 Phương pháp 3 [37]

Phương trình phản ứng :

Cơ chế phản ứng :

Captopril có nhóm thiol (-SH) dễ dàng bị các tác nhân có khả năng oxy hóa chuyển hóa thành Disulfid (-S-S-), (-S(=O)-S-) Các tác nhân oxy hóa có nhiều loại có mức độ mạnh yếu khác nhau, dẫn đến khả năng phản ứng, hiệu suất phản ứng và mức độ tinh khiết của sản phẩm tạo thành

Theo các tài liệu tham khảo thì các tác nhân có thể phản ứng với thiol gồm có: Na2S4O6, K3(Fe(CN)6), I2, H2O2, Br2, KBrO3

1.5.4 Tác nhân oxy hóa là Na 2 S 4 O 6 [28]

Na2S4O6 có phản ứng với thiol nhưng phải thực hiện ở pH = 7 thì phản ứng mới nhanh chóng và hoàn toàn, trong khi ở pH=7 thì ảnh hưởng đến độ bền của liên kết amid của Captopril và Captopril Disulfid, mặt khác nếu để giữ độ bền của Captopril và Captopril Disulfid thì cần pH <4, với pH<4 thì khả năng phản ứng của Na2S4O6 bị giảm xuống, đồng thời quá trình phản ứng sẽ sinh ra H+ nên làm

pH giảm xuống và quá trình tinh chế cần pH< pka-1 = 2,7; và ở khoảng pH này thì có phản ứng phụ:

Na2S2O3 + 2H+ → H2S2O3 → H2SO3 + S ↓

Lưu huỳnh được tạo thành có khả năng hòa tan trong dung môi hữu cơ, mặt khác Captopril Disulfid dễ tan trong dung môi hữu cơ, ít tan trong nước nên khó tinh chế Nên không chọn Na2S4O6 làm tác nhân oxy hóa

1.5.5 Tác nhân oxy hóa là K 3 (Fe(CN) 6 ) [30] [38]

Với K3(Fe(CN)6) thì chỉ có ở pH =7 tốc độ phản ứng mới nhanh, trong khi

ở pH = 4-5 thì phản ứng hoàn toàn khi lượng K3(Fe(CN)6)/Captopril =1/10 và thời gian phản ứng kéo dài 20h

Mặt khác quá trình tinh chế cần pH < 2,7 nên khi hạ pH xuống ảnh hưởng đến khả năng tạo phức và sinh ra HCN là 1 chất độc

Vì vậy K

1.5.6 Tác nhân oxy hóa là H 2 O 2 [47]

H2O2 là một tác nhân oxy hóa không bền, độ ổn định không cao, tốc độ phản ứng chậm Đã có bài báo công thời gian để phản ứng là 10-12h, chính với khoảng thời gian dài và tác nhân phản ứng không ổn định, đồng thời thế oxy hóa của H2O2 cao dễ dàng tạo ra các sản phẩm oxy hóa các bậc tiếp theo nên hiệu suất

và độ ổn định của phản ứng sẽ thấp và mức độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tổng hợp sẽ không cao, phải thực hiện nhiều bước tinh chế nên hao hụt sản phẩm

và giảm hiệu suất cuối cùng Chính vì vậy mà H2O2 không thích hợp để làm chất oxy hóa

1.5.7 Với tác nhân oxy hóa là Br 2 ,KBrO 3 [25]

Br2,KBrO3 là những chất có thế oxy hóa cao, tốc độ phản ứng nhanh, nên khả năng khống chế phản ứng sẽ khó khăn Đồng thời đã có tài liệu chứng minh: khi sử dụng Br2 hoặc KBrO3 thì tạo ra các sản phẩm phụ nhiều như: -S(=O)-S, -S(O2)-S-, và các sản phẩm có bậc oxy hóa cao hơn, đồng thời cũng có sự xuất hiện của ion SO42- cle

Nên hai tác nhân này chỉ dùng trong nghiên cứu sự chuyển hóa của Captopril

là phù hợp, không nên dùng trong bán tổng hợp để tạo ra Captopril Disulfid

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HỮU

CƠ [5]

1.6.1 Phổ IR

Quang phổ kế hồng ngoại là dụng cụ sử dụng để nghiên cứu cấu trúc các hợp

cm) thường được dùng

λ= Trong đó : ν(số sóng , cm-1)= f/c ; f là tần số, c là tốc độ ánh sáng Trong những dao động của một phân tử, các nguyên tử có thể chuyển động theo chiều của liên kết (hóa trị), hoặc có thẻ chuyển động sao cho khoảng cách giữa các nguyên tử không thay đổi mà chỉ biến dạng những góc liên kết Vì năng lượng kích thích cho những biến dạng như vậy thấp hơn hẳn một dao động hướng liên kết nên trong những dao động nội phân tử ta có thể phân biệt dao động hóa trị và dao động biến dạng

Số sóng ứng với dao động hóa trị của một liên kết, nhờ định luật Hooke:

1.6.2 Phổ khối – Mass spectrum

Dùng chùm điện tử năng lượng trung bình (50-100 eV) để bắn phá phân tử

M+ → m1+ + m2+ + m3+ + m4+ +…

Trong quá trình này , ion phân tử được tạo ra dưới dạng cation-gốc Nếu một phân tử được tiếp năng lượng lớn hơn là cần thiết để ion hóa thì ion phân tử được tạo ra sẽ phân cắt thành những ion mảnh Các ion tao ra trong quá trình trên sẽ được tăng tốc nhờ bản gia tốc tính điện âm Dòng ion bị cuốn cong tới ống phân tích Nhờ tác dụng của từ trường, các ion này được lái vào những quỹ đạo hình tròn với bán kính r phụ thuộc vào khối lượng m của ion, điện tích q, điện thế U, cường độ từ trường B

r = x Nếu U và H không đổi thì r chỉ phụ thuốc vào khối lượng / điện tích (m/q), nên khi thay đổi U và H có thể thay đổi bán kính r của các ion, và các ion có khối lượng khác nhau sẽ lần lượt qua khe vào thiết bị tiếp nhận ion và cho phổ hình que

1.6.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

1.6.3.1 Nguyên tắc của phổ cộng hưởng từ

Nếu hạt nhân nguyên tử có momen từ được dặt trong một từ trường, thì hạt nhân nguyên tử sẽ quay với 1 tần số xác định phụ thuộc vào cường độ từ trường bên ngoài (B)

Sau đó, một cuộn dây dẫn điện sẽ phát ra sóng vô tuyến có tần số ν, làm cho hạt nhân hấp thụ năng lượng làm vecto từ trường hạt nhân lệch hướng ban đầu, tiếp theo tắt phát sóng vô tuyến thì vecto từ trường hạt nhân trở về ban đầu sẽ phát

ra từ trường làm cho cuộn cảm phát hiện dao động điện, nên thu được peak trên giản đồ

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của

sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế: hấp phụ, phân tán, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt

1.7.2 Các thông số cơ bản của quá trình sắc ký

 Thời gian lưu tR :

Thời gian lưu của một chất là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detertor và cho pic trên sắc ký đồ tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của pic Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký

đồ, nó là hằng số đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi Ngoài ra trong một phép phân tích còn thời gian lưu hiệu chỉnh, được tính bằng công thức sau: tR’ = tR – tM

Với: tM là thời gian lưu của 1 chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh

Nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì pic bị loãng, thời gian phân tích kéo dài

 Hệ số phân bố k : là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột

CM là nồng độ mol của chất tan trong pha động

 Hệ số dung lượng k’ : cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong hai pha và được tính theo sức chứa của cột:

F = Trong đó :W : chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic

a : là khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

 Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N :

Hiệu lực cột được đo bằng thống số : Số đĩa lý thuyết N của cột

Trong đó : W1/2h là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic

W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic

 Độ phân giải Rs của cột :

Trong đó :

t(R)A ; t(R)B : thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A)

WB ; WA : độ rộng pic đo ở các đáy pic

W1/2A ; W1/2B : độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic Yêu cầu : RS > 1 ; giá trị tối ưu Rs = 1,5

1.7.3 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC

Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm các bộ phận chính sau :

 Bơm cao áp :

Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được áp suất (thường 0 – 400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn định, phù hợp với quá trình sắc ký

 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi :

Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh đôi khi bằng thép không gỉ Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường dùng màng lọc cỡ 0,45 µm) và đã đuổi khí hòa tan

1.7.4 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

1.7.4.1 Lựa chọn pha tĩnh cho HPLC

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của một hỗn hợp nhiều chất Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động sắc ký được chia thành 2 loại :

tích thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực

thường là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực

Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền Silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon Trong sắc ký hấp phụ pha đảo: pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất

Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc Siloxan:

-NH2, alkyl nitril – CH2 – CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha thuận

để phân tích các chất ít hoặc không phân cực

 Với R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế bàng cách alkyl hóa các nhóm OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl-R của mạch carbon (C2;C8;C18) hay các gốc carbon vòng phenyl Do các nhóm OH thân nước được thay thế bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực

Silica đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion

Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn những nhóm –OH gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy theo môi trường pH phân tích

Trong môi trường quá acid pH< 2 thì có sự phân ly các nhóm ether ra khỏi nền Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không thể tương tác với cột

Trong môi trường Base (pH>7), các nhóm –OH trong cột sẽ tương tác với chất tan có tính base Tương tác này khác với kiểu tương tác của chất tan với nhóm –Si-C18, dẫn đến hiện tượng cùng một chất nhưng sẽ có những đỉnh ra khác nhau hay là hiện tượng kéo đuôi Kết quả giảm đi độ chính xác

Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các hợp chất như trimethylclorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexametyldisizan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này Cấu trúc pha liên kết được trình bày ở hình 1.2

Hình 1.5: Cấu trúc cột LC-DB

Có một cách khác để loại trừ bớt sự ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che chắn đi những nhóm –OH, được trình bày ở hình 1.3

Hình 1.5: Cấu trúc cột có gốc Isopropyl Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của dây C18 làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh (Cột EPS – Expended Polar Selectivity)

1.7.4.2 Lựa chọn pha động cho HPLC

Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu

tố thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp Trong sắc ký pha đảo, pha động là dung môi phân cực như: nước, methanol, acetonitril … hoặc hỗn hợp của chúng Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ

Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc

ký như: độ chọn lọc α, thời gian lưu tR, độ phân giải Rs, độ rộng của đáy pic Nên việc phân tích, lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng

Yêu cầu của 1 pha động :

 Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian

 Hòa tan chất cần phân tích

 Có độ tinh khiết cao

 Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

 Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường

Có các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả :

 Thành phần các chất trong pha động

 Tốc độ dòng của pha động

Chọn đệm – pH :

Trong sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính chất acid hoặc base thường phải

sử dụng đệm ở pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký Giá trị pH thích hợp

sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký

Tốc độ dòng của pha động :

Sau khi có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp, để tăng hiệu lực tách của quá trình phải chọn tốc độ pha động phù hợp, đảm bảo việc tách các chất phân tích được tốt nhất mà đạt hiệu quả cao về thời gian và kinh tế

1.7.4.3 Lựa chọn Detector

Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ ghi nhận bởi Detector chuyển thành tín hiệu và được ghi trên sắc ký đồ Detector phổ biến nhất là Detector UV-VIS Tùy theo chất cần phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác nhau

1.7.5.2 Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC

Phương pháp định lượng chất phân tích trong HPLC dựa trên nguyên tắc nồng độ của chất phân tích tỷ lệ thuận với chiều cao hoặc diện tích pic của chất

phân tích Các phương pháp tính kết quả thường dùng

Dựa trên việc so sánh đáp ứng pic của mẫu thử với mẫu chuẩn được phân tích trong cũng một điều kiện Nồng độ (hàm lượng) của chất chưa biết được tính toán dựa trên nồng độ (hàm lượng) chất chuẩn đã biết hoặc suy ra từ đường chuẩn Trong khóa luận này, chúng tôi sử dụng phương pháp chuẩn ngoại, chuẩn hóa một điểm: chuẩn bị một mẫu chất chuẩn và một mẫu chất thử Tiến hành song song với nhau Căn cứ vào diện tích pic của chất chuẩn, chất thử và nồng độ chất chuẩn, tìm được nồng độ của chất thử

Điều kiện áp dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm: trong khoảng nồng độ khảo sát, chứng minh luôn có tương quan hồi quy tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích với diện tích pic của chất phân tích

1.8 QUÉT NHIỆT VI SAI

1.8.1 Quét nhiệt vi sai DSC

DSC là phương pháp phân tích nhiệt mà ở đó độ chênh lệch về nhiệt độ ∆ T giữa hai mẫu: mẫu chuẩn và mẫu nghiên cứu luôn được duy trì bằng không Thay vào đó người ta sẽ xác định ethanpy của quá trình này bằng cách xác định lưu lượng nhiệt vi sai cần để duy trì mẫu vật liệu và mẫu chuẩn trơ ở cùng nhiệt độ Nhiệt độ này thường được lập trình để quét một khoảng nhiệt độ bằng cách tang tuyến tính ở một tốc độ nhất định Ta sẽ xác định được năng lượng đó thông qua tính diện tích giới hạn bởi đồ thị mà chúng ta thu được

DSC cho chúng ta thông tin về sự chuyển pha của vật chất và xác được độ tinh khiết của hợp chất

1.8.2 Phân tích nhiệt trong lượng TGA

Phương pháp dựa trên cở sở xác định khối lượng của mẫu vật chất bị mất đi (hoặc nhận vào) trong quá trình chuyển pha như một hàm của nhiệt độ Khi vật chất bị nung nóng khối lượng của chúng sẽ bị mất đi từ các quá trình đơn giản như bay hơi hoặc các quá trình hóa học: như phân giải, oxy hóa, hoặc giải phóng khí Một số vật liệu có thể nhận được khối lượng do chúng phản ứng với oxy không khí trong môi trường kiểm tra

Phép đo TGA nhằm xác định:

Khối lượng bị mất đi trong quá trình chuyển pha

Khối lượng bị mất theo thời gian và theo nhiệt độ do quá trình khử nước hoặc phân ly

Đường phổ TGA đặc trưng cho một hợp chất hoặc một hệ do thứ tự của các phản ứng hóa học xuất hiện tại một khoảng nhiệt độ xác định là một hàm của cấu trúc phân tử

Sự thay đổi của khối lượng là kết quả của quá trình đứt gãy hoặc sự hình thành vô số các liên kết vật lý và hóa học tại một nhiệt độ gia tăng dẫn đến sự bay hơi của các sản phẩm hoặc tạo thành các sản phẩm nặng hơn

1.9 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH [10]

1.9.1 Yêu cầu chung

Thẩm định một phương pháp phân tích trong nguyên liệu là một quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc trưng cơ bản của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế, nhằm chứng minh rằng phương pháp đó là đáng tin cậy và có khả năng thực hiện phân tích những mẫu được khảo sát

1.9.2 Các tiêu chí trong thẩm định phương pháp

1.9.2.1 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ đáp ứng của pic (diện tích pic) với nồng độ chất phân tích trong dung dịch

Tính tuyến tính của phương pháp phân tích là khả năng suy ra các kết quả thử một cách trực tiếp hoặc thông qua phép biến đổi toán học, nó tỷ lệ thuận với nồng độ của chất cần phân tích có trong mẫu thử trong một giới hạn nồng độ đã cho

Khoảng tuyến tính: là khoảng nồng độ từ nồng độ thấp nhất đến nồng độ cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính Thông thường đối với nguyên liệu thì khảo sát tính tuyến tính trong khoảng từ 80% đến 120% nồng độ

so với nồng độ định lượng Đường chuẩn phải có ít nhất là 5 nồng độ của chất

chuẩn pha trong dung dịch và ít nhất 4/5 điểm trong dãy chuẩn có độ đúng và độc chính xác đạt yêu cầu

1.9.2.2 Tính chính xác : bao gồm các tiêu chí về độ lặp lại và độ đúng

 Độ lặp lại

Độ lặp lại của phương pháp phân tích là mức độ phù hợp với nhau giữa các kết quả riêng rẽ khi áp dụng phương pháp để định lượng lặp đi lặp lại nhiều lần lấy mẫu từ một mẫu đã trộn đồng nhất

Phương pháp là lặp lại nếu độ lệch chuẩn tương đối RSD ≤ 2,0%

Tính đúng của phương pháp là sự gần sát của kết quả định lượng so với giá trị thực Do hàm lượng mẫu thử chưa được xác định chắc chắn ở thời điểm nào, vì vậy tính đúng phải được xác định trong toàn bộ vùng cần xác định Đối với nguyên liệu, tính đúng được xác định trong khoảng 80% đến 120% nồng độ phân tích

Phương pháp là đúng nếu :

 Khoảng tin cậy của độ dốc chứa 1 (không có sai số hệ thống tỷ lệ) Khoảng tin cậy của b (y=ax + b) chứa gốc tọa độ (không có sai số hằng

định)

1.9.2.3 Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu của phương pháp là khả năng xác định chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác như tạp chất, sản phẩm phân hủy và các thành phần khác

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Hóa chất, thuốc thử

Captopril Disulfid: EDQM Council of Europe Control No 198216

Captopril nguyên liệu : Công Ty TRAPHACO

Captopril chuẩn đối chiếu – VKN –QT146040113, hàm lượng 98,54%

MeOH dùng cho sắc ký : Merk

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao : DIONEX – detector UV diode aray

Máy đo quang phổ UV

Máy lắc siêu âm – SONOREX

Máy đo pH : METTLER TOLEDO MP 220

Máy lọc chân không : SATORIOUS

Cân phân tích : SATORIOUS, Cân 5 chữ số Meter AE 163 (VKN)

Máy khuấy từ: HEIDOLPH MR 1000

Bình định mức 10, 25, 50, 100 ml

Ống đong 100ml, cốc có mỏ 100, 500, 1000 ml

Pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, màng lọc 0,45µm

Máy Metrohm 848

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu

- Tham khảo các phương pháp oxy hóa thiol và chuyển hóa của Captopril

đã công bố

- Tham khảo các phương pháp định lượng Captopril Disulfid đã công bố

- Dựa vào cấu tạo phân tử, tính chất lý hóa học của Captopril cũng như điều kiện thực nghiệm ở nước ta hiện nay để nghiên cứu, tổng hợp, thiết lập chỉ tiêu của chất chuẩn Captopril Disulfid, đồng thời xây dựng quy trình định lượng Captopril Disulfid trong mẫu đã tổng hợp bằng phương pháp HPLC có tính chính xác, đặc hiệu cao

2.2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.2.1 Xây dựng quy trình tổng hợp Captopril Disulfid và tinh chế

* Khảo sát điều kiện bán tổng hợp:

Khảo sát và lựa chọn chất oxy hóa phù hợp, tỷ lệ giữa chất oxy hóa và Captopril, hệ đệm và dung môi phản ứng

* Khảo sát dung môi để tinh chế:

2.2.2.2.Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất

Hợp chất đối tượng nghiên cứu của đề tài đều là những chất đã biết cấu trúc Dữ liệu chuẩn dùng để nhận dạng chất nhằm cung cấp thông tin cho thiết lập hồ sơ nhận dạng chuẩn Việc nhận dạng chất dựa vào:

- So sánh phổ của chất phân tích với phổ chất chuẩn trong cùng điều kiện

- So sánh thông tin phổ, dữ liệu hóa lí, hằng số vật lí của chất với tài liệu khoa học hoặc thông tin đã công bố Tập hợp các dữ liệu chuẩn đó có thể khẳng định được hợp chất là đúng đối tượng nghiên cứu

Các phương pháp được sử dụng để xây dựng bộ dữ liệu gồm có: Đo điểm chảy, đo phổ hồng ngoại (trong KBr), đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (H1NMR,C13NMR, DEPT) và 2 chiều (HMBC,HSQC), đo phổ khối lượng (MS)

2.2.2.3 Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất

Sắc kí lớp mỏng: TLC được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết dựa vào

sự có mặt của vết duy nhất hoặc vết chính là vết của đối tượng phân tích Chất càng tinh khiết khi không có vết phụ hoặc vết phụ càng nhỏ

Quét nhiệt vi sai: Sử dụng thiết bị DSC (Differential Scanning Calorimetry) để

xác định thông số nhiệt lượng, qua đó đánh giá mức độ tinh khiết của chất chuẩn

Sắc kí lỏng hiệu năng cao: Sử dụng HPLC để xác định cụ thể số lượng tạp chất

và tính gần đúng tỉ lệ tạp chất dựa trên tỉ lệ phần trăm diện tích pic

Sắc kí lỏng – khối phổ : Đánh gái độ tinh khiết dựa vào sự có mặt của số lượng

và tỷ lệ tín hiệu của các mảnh ion khi chạy ở chế độ ESI- negative

2.2.2.4.Thiết lập chất chuẩn và xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất chuẩn

2.2.2.4.1 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng

Xây dựng chỉ tiêu chất lượng:

Căn cứ vào tính chất lí – hóa của nguyên liệu thiết lập chuẩn và các CTCL thông thường của CCĐC sơ cấp để xây dựng các CTCL của CCĐC cần thiết lập

Xây dựng phương pháp đánh giá:

Tham khảo DĐVN và các dược điển quốc tế để lựa chọn phương pháp phù hợp đánh giá các CTCL

Khảo sát lựa chọn chương trình sắc kí thích hợp để định lượng và xác định tạp chất

Dựa trên công thức phân tử và cấu trúc hóa học của các hợp chất chiết xuất từ dược liệu để tìm các các điều kiện sắc kí phù hợp như: Bản chất pha tĩnh, thành phần pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dòng pha động, thể tích tiêm mẫu, nồng độ dung dịch thử, dung môi pha mẫu

Thẩm định phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu:

- Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

- Sự phù hợp của hệ thống sắc kí (System suitability)

2.2.2.4.2 Nghiên cứu các điều kiện tiến hành xây dựng phương pháp

 Khảo sát điều kiện sắc ký

Chọn bước sóng phát hiện, chọn cột, chọn pha động, tốc độ dòng thích hợp

để có pic Captopril cân đối và thời gian lưu hợp lý

Chúng tôi tiến hành khảo sát trên cột C18 (250mm x 4,6mm, 5µm) là những cột thường dùng trong các cơ sở kiểm nghiệm hiện nay Tiến hành khảo sát các điều kiện khác để chọn chương trình sắc ký phù hợp

 Lựa chọn dung môi hòa tan Captopril Disulfid hoàn toàn từ mẫu đã tinh chế:

Dựa vào tính chất của Captopril và qua tham khảo tài liệu, bằng thực nghiệm chọn ra dung môi thích hợp để hòa tan Captopril và đảm bảo Captopril không bị thủy phân

2.2.2.4.3 Xây dựng, đánh giá phương pháp định lượng Captopril Disulfid trong

mẫu đã bán tổng hợp và tinh chế

 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký

 Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ Captopril Disulfidvà diện tích pic trên sắc ký đồ

- Độ lặp lại của phương pháp

2.2.2.4.4 Áp dụng phương pháp xây dựng định lượng Captopril Disulfid trong

mẫu đã bán tổng hợp và tinh chế

Áp dụng phương pháp xây dựng tiến hành định lượng Captopril Disulfid trong mẫu đã tinh chế