CAPTOPRIL Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
3.1.1 Lựa chọn phương pháp và khảo sát điều kiện tổng hợp Captopril Disulfid Disulfid
3.1.1.1. Oxy hóa Captopril bởi Iod
Với tác nhân là I2 thì Dược điển anh đã dùng để định lượng Captopril với quy trình như sau: m-captopril = 0.7458g, pha vào bình định mức 50,00 ml. Mỗi lần định lượng thì lấy 10,00 ml dung dịch đã pha. Tiến hành định lượng bằng Iod được theo dõi bằng chuẩn độ đo thế có bảng kết quá như sau:
Bảng 3.1: Sự phụ thuộc giữa thế điện cực với lượng Iod thêm vào V(I2)(ml) E(mV) V(I2)(ml) E(mV) V(I2)(ml) E(mV)
0 294 6.4 180 7.7 344 0.15 228 6.5 181 7.75 348 0.25 217 6.65 182 7.85 354 0.5 207 6.85 185 7.95 358 0.55 204 7.1 190 8.1 361 1.1 193 7.15 192 8.3 366 1.75 188 7.2 193 8.65 370 2.8 186 7.25 195 9 373 2.95 185 7.3 198 9.5 376 3.65 183 7.4 204 14 384 4.8 181 7.45 210 14.5 384 6 176 7.5 220 17 384 6.2 178 7.6 328 19 384 6.3 179 7.65 339 23 383 Từ bảng kết quả giữa E-V ta có đồ thị như sau:
Hình 3.1: Biểu đồ mối tương quan giữa thế điện cực và lượng Iod thêm vào 150 200 250 300 350 400 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
34
Từ biểu đồ ta: thấy rằng khi nhỏ tới 23 ml dung dịch Iod 0.1N thì chỉ có 1 bước nhảy thế, mặt khác thể tích Iod ở bước nhảy thế khoảng 7,4-7,5 ml nên 23/7,4 >2 hãy xấp xỉ 3. Nếu như có 1 bước nhảy thể tiếp theo thì phải nhảy ở điểm khoảng 14-15 ml dung dịch Iod 0.1N nhỏ vào.Vậy chứng tỏ rằng Iod phản ứng với Captopril có nhiều khả năng chỉ tạo ra 1 sản phẩm. Đồng thời quá trình phản ứng nhanh, độ ổn định của thế phản ứng cao nên Iod được chọn làm chất oxy hóa.
3.1.1.2.Phương pháp bán tổng hợp Captopril Disulfid đề xuất
Hòa tan 0.1500g Captopril vào 30 ml nước cất, cho con khuấy từ khuấy đều và nhỏ từ từ 7.4 ml dung dịch Iod 0.1N vào trong khoảng thời gian 2h đồng hồ, nhiệt độ thực hiện : nhiệt độ phòng.
Sau khi phản ứng kết thúc: lọc tủa, sấy khô ở 27oC trong 2h. Tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng có hệ dung môi : Cloroform – ethylacetat - acid acetic băng = 4 :5:3 có kết quả như sau:
Hình 3.2 : Sắc ký lớp mỏng chạy sản phẩm Vết bên trái là của Captopril
Vết bên phải là của mẫu đã tổng hợp
Qua số lượng vết tách trên trên TLC ta thấy chỉ có 1 vết, chứng tỏ khả năng cao chỉ có 1 chất phân tích
35
Hình 3.3: Phân tích phổ khối của sản phẩm
Phân tích độ tinh khiết của chất đã tổng hợp bằng LC-MS/MS (position), có kết quả như sau:
Phổ khối của Captopril Disulfid là
M/z = 433,04 (M +H) ; 455,05 (M+Na); 470,98 (M+K) M/z = 887,05 (2M+Na) ; 903,04 (2M+K);
Các mảnh của Captopril Disulfid sau khi phân mảnh là : M/z = 216.02; 357.98
Ngoài ra còn 1 số mảnh là các chất đã bị oxy hóa lên bậc cao hơn hay là chất A (Mục 1.4.3 : Các chất chuyển hóa của Captopril Disulfid)
36
Đồng thời mảnh M/z = 357,98 cũng có thể là tạp thủy phân D2 của Captopril Disulfid (Mục 1.4.3: Các chất chuyển hóa của Captopril Disulfid)
Qua thông số về phổ ta thấy như sau : đa số sản phẩm là Captopril Disulfid nhưng đang cần lẫn 1 lượng tạp oxy hóa A và tập thủy phân D2 của Captopril Disulfid. Chứng tỏ khi nhỏ 7,4 ml Iod 0.1 N (Chưa tới điểm tương đương) vào dung dịch chưa Captopril thì đã có sự oxy hóa lên bậc cao hơn hay sản phầm A và sản phẩm thủy phân D2 mà chỉ có thể phát hiện bằng sắc ký lỏng khối phổ.
Đồng thời xem xét lại mối tương quan giữa đạo hàm của thế điện cực theo lượng dung dịch Iod:
Hình 3.4 : Mối tương quan giữa dE/dV và V
Qua biểu đồ ta thấy : tại đoạn có thể tích Iod nhỏ vào 0 đến 0.5 ml thì dE/dV tăng lên và sau đó giảm xuống, còn từ 0.5 ml đến 4.8 ml thì dE/dV chỉ có tăng mà không có giảm.
Qua biểu đồ và sản phẩm phân tích bằng phổ khối thì cơ chế tạo thành Captopril Disulfid không phải là:
2R-SH + I2 → R-S-S-R + 2HI
Đồng thời tham khảo các tài liệu [16] [29] [31] [43] về chuyển hóa của gốc Thiol với Iod trong môi trường nước thì có cơ chế như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(1) R-SH + I2 → R-S-I + HI (2) R-S-I +H2O → R-S-OH + HI R-S-OH + R-SH → R-S-S-R + H2O -500 -400 -300 -200 -100 0 0 1 2 3 4 5 6 dE/dV V (Thể tích iod)
37
Qua cơ chế trên ta thấy sự phù hợp với phản ứng của Iod với Captopril ở những điểm sau :
Trên biểu đồ dE/dV ta thấy có sự tụt giảm thế chính là giai đoạn tạo R-S- OH, đồng thời có giai đoạn dE/dV tăng trở lại chứng tỏ đã có sản phẩm tạo thành là R-S-S-R làm cho sự không có sự giảm thế này nữa làm cho dE/dV tăng trở lại. Nhưng sự tăng trở lại này vẫn âm vì Captopril Disulfid chưa bão hòa trong nước.
Đồng thời cũng có cân bằng :
Kcb = [RSSR]/([RSOH]x[RSH])
Khi Captopril Disulfid bão hòa trong nước thì có thể tính được lượng RSH tối thiểu còn lại để duy trì cân bằng này:
[RSH]o = sqrt([RSSR]/Kcb)
Khi nhỏ Iod vào quá cân bằng này thì lượng [RSH] giảm đồng thời với quá trình đó là Iod sẽ phản ứng với [RSSR] tạo ra sản phẩm oxy hóa cao hơn là A và tiếp túc có cân bằng như sau :
R(S=O)SR + H2O → RSO2H + RSH
RSO2H tan tốt trong nước nên làm giảm sản phẩm và giảm độ tinh khiết của sản phẩm.
Điểm cần bằng có thể theo dự đoán dự vào đồ thị dE/dV, khi xuất hiện điểm cực trị ở 0.5 ml dung dịch Iod 0.1N nhỏ vào.
% lương Iod được nhỏ tối đa (So với lượng cần định lượng) = (7.5- 0.5)/7.5 * 100% = 93.33%
Với quy mô đã thử thì lượng Captopril Disulfid tạo ra trong 1 lần tối đã theo lý thuyết có thể đạt được là 0.15 g x 93.33% = 0.14 g. Với lượng chất nhỏ như thế này khi làm các thông số cần thiết khác như nhiệt độ nóng chảy, mất khối lượng do làm khô, bộ phổ xác định cấu trúc và định tính Captopirl Disulfid sẽ không đủ nên chúng tôi quyết định sử dụng lượng Captopril cho mỗi phản ứng là 0.5g. Đồng thời dựa theo cơ chế đã biết thì sự tạo tủa Captopril Disulfid sẽ phụ thuộc vào cả pH và thể tích dung dịch. Mặt khác khi định lượng Captopril Disulfid
38
có cho thêm vào 250ml nước để định lượng thì ko thấy tạo thành tủa. Chính vì vậy chúng tôi đưa ra quy trình mới như sau:
Lượng Captopril phản ứng : 0.5 g
Sử dụng dung dịch Iod 0,2N. Lượng Iod thêm vào không quá 93,33% lượng cần chuẩn độ.
Sau khi thu được sản phẩm: thì lọc hút chân không cho hết nước, rửa bởi 30 ml nước lạnh. Sau đó hòa tan lại bằng vừa đủ MeOH cho tan hết và thực hiện cất kéo chân không để thu được cắn.
Sau khi thu được cắn thì chạy sắc ký lớp mỏng trên hệ: Cloroform – ethylacetat - acid acetic băng = 4 :5:3
3.1.1.3.Khảo sát tỷ lệ Captopril và chất oxy hóa
a. Quy trình đề nghị để khảo sát:
Giai đoạn tổng hợp Giai đoạn tinh chế
b. Thể tích Iod 0.2N được thêm vào
39
Bảng 3.2 : Mối tương quan giữa lượng Iod thêm và và khối lượng cắn thu được Thể tích Iod 0.2N 2 ml 3ml 4 ml 5 ml 6 ml 7 ml 8 ml 9 ml KL cắn lần 1(g) 0.0103 0.0396 0.0728 0.1169 0.1620 0.2057 0.2433 0.2831 KL cắn lần 2(g) 0.0092 0.0382 0.0736 0.1213 0.1517 0.1982 0.2476 0.2932 Trung bình 0.0098 0.0389 0.0732 0.1191 0.1569 0.2020 0.2455 0.2882 Thể tích Iod 0.2N 9.5 ml 10.0 ml 10.5 ml 11 ml 11.5 ml KL cắn lần 1(g) 0.3254 0.3427 0.3208 0.2917 0.2576 KL cắn lần 2(g) 0.3126 0.3418 0.3287 0.2976 0.2672 Trung bình 0.3190 0.3423 0.3248 0.2947 0.2624
Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa thể tích Iod nhỏ vào và khối lượng cắn thu được:
Hình 3.5: Mối tương quan giữa lượng Iod thêm vào và khối lượng cắn Qua đồ thị ta thấy 3 điểm có khối lượng cắn nhiều nhất tương ứng với thể tích Iod 0.2 N được nhỏ vào lần lượt là 9.5 ml, 10.0 ml, 10.5 ml có khối lượng tủa tương ứng là 0.3190 g, 0.3423 g, 0.3248 g.
c. Thay đổi nồng độ dung dịch Iod 0,0000 0,0500 0,1000 0,1500 0,2000 0,2500 0,3000 0,3500 0,4000 2 4 6 8 10 12 m-V KL cắn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
40
Chúng tôi khảo sát lần với các nồng độ Iod là 0.2N; 0.4N; 0.8N và kết quả được thể hiện ở bảng 3.3
Bảng 3.3: Tương quan giữa thể tích và nồng độ Iod với khối lượng tủa Thể tích Iod 0.2N 9.5 ml 10.0 ml 10.5 ml KL Trung bình 0.3190 0.3423 0.3248 KL Trung bình/(V iod*N) 0.0336 0.0342 0.0309 Thể tích Iod 0.4N 4.8 ml 5.0 ml 5.3 ml KL cắn lần 1(g) 0.3465 0.3566 0.3507 KL cắn lần 2(g) 0.3481 0.3621 0.3442 Trung bình 0.3473 0.3593 0.3474 KL Trung bình/(V iod*N) 0.0362 0.0359 0.0327 Thể tích Iod 0.8N 2.4 ml 2.5 ml 2.7 ml KL cắn lần 1(g) 0.3531 0.3612 0.3413 KL cắn lần 2(g) 0.3519 0.3643 0.3402 Trung bình 0.3525 0.3627 0.3407 KL Trung bình/(V iod*N) 0.0367 0.0362 0.0315
Sử dụng phân tích Anova cho 3 nhóm với sự thay đổi của nồng độ Iod ta có như sau:
Khi dùng sử dụng nồng độ Iod: 0.2 N với V = 9.5 ml, 0.4 N với V = 4.8 ml, 0.8 N với V = 2.4 ml thì chỉ có nhóm sử dụng 0.2N với V = 9.5 ml là khác biệt với 2 nhóm còn lại.
Khi dùng sử dụng nồng độ Iod: 0.2 N với V = 10 ml, 0.4 N với V = 5 ml, 0.8 N với V = 2.5 ml thì chỉ có nhóm sử dụng 0.2N với V = 10 ml là khác biệt với 2 nhóm còn lại.
Khi dùng sử dụng nồng độ Iod: 0.2 N với V = 10.5 ml, 0.4 N với V = 5.3 ml, 0.8 N với V = 2.7 ml thì cả 3 nhóm đều thể hiện sự khác nhau.
Chính vì vậy chúng tôi quyết định sử dụng nồng độ Iod 0.4N và V = 4,8
41
3.1.1.4. Hệ đệm – pH
Dựa vào phần mềm phân tích cấu trúc ChewDraw thì dự đoán pKa của Captopril Disulfid là pKa= 3.6, nên chọn hệ đệm là hệ đệm phosphat với pH của hệ đệm là pH = 3,4.
Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc giữa khối lượng cắn và thể tích đệm, với nồng độ Iod là 0.4 N và thể tích Iod sử dụng là 4.8 ml. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4: Tương quan giữa khối lượng cắn với pH đệm Thể tích đệm pH=3,4 20 ml 15 ml 10 ml 5 ml Thể tích nước thêm vào 0 ml 5 ml 10 ml 15 ml pH sau phản ứng 2.71 2.58 2.41 2.02
Khối lượng cắn(g) 0.3481 0.3662 0.3869 0.3885
Qua bảng dữ liệu trên ta thấy có sự khác biệt lớn về khối lượng cắn với các thể tích đệm là 20 ml, 15ml, 10ml. Nhưng với thể tích đệm là 10 ml và 5ml thì có sự chênh lệch lớn về pH sau khi kết thúc phản ứng nhưng sự chênh lệch về khối lượng cắn là không nhiều.
Mặt khác trong công thức của Captopril Disulfid có 2 nhóm amid, là khi pH càng hạ xuống thấp thì độ bền của 2 nhóm amid này càng giảm nên chúng tôi quyết định chọn thể tích đệm phosphat pH = 3,4 là 10,0 ml.
3.1.1.5. Hệ dung môi
Chúng tôi tiến hành khảo sát quy trình với các hệ dung môi như sau : Đệm phosphat pH =3,4 : nước = 10:10
Đệm phosphat pH =3,4 : nước : Ethanol = 10: 8: 2 , 10: 5 : 5 ; 10 : 2 : 8 Bảng 3.5: Khảo sát khối lượng cắn và lượng dung môi thêm vào
Đệm phosphat pH =3,4 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml
Nước cất 10 ml 8 ml 5 ml 2 ml
Ethanol 0 ml 2 ml 5 ml 8 ml
42
Qua bảng kết quả ta thấy khi lượng thể tích Ethanol càng tăng thì khối lượng tủa càng giảm xuống. Vì vậy, chúng tôi quyết định không sử dụng Ethanol vào
hệ dung môi.