1.9.1. Yêu cầu chung
Thẩm định một phương pháp phân tích trong nguyên liệu là một quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc trưng cơ bản của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế, nhằm chứng minh rằng phương pháp đó là đáng tin cậy và có khả năng thực hiện phân tích những mẫu được khảo sát.
1.9.2. Các tiêu chí trong thẩm định phương pháp
1.9.2.1.Khoảng tuyến tính, đường chuẩn
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ đáp ứng của pic (diện tích pic) với nồng độ chất phân tích trong dung dịch.
Tính tuyến tính của phương pháp phân tích là khả năng suy ra các kết quả thử một cách trực tiếp hoặc thông qua phép biến đổi toán học, nó tỷ lệ thuận với nồng độ của chất cần phân tích có trong mẫu thử trong một giới hạn nồng độ đã cho.
Khoảng tuyến tính: là khoảng nồng độ từ nồng độ thấp nhất đến nồng độ cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Thông thường đối với nguyên liệu thì khảo sát tính tuyến tính trong khoảng từ 80% đến 120% nồng độ so với nồng độ định lượng. Đường chuẩn phải có ít nhất là 5 nồng độ của chất
27
chuẩn pha trong dung dịch và ít nhất 4/5 điểm trong dãy chuẩn có độ đúng và độc chính xác đạt yêu cầu.
1.9.2.2.Tính chính xác : bao gồm các tiêu chí về độ lặp lại và độ đúng
Độ lặp lại
Độ lặp lại của phương pháp phân tích là mức độ phù hợp với nhau giữa các kết quả riêng rẽ khi áp dụng phương pháp để định lượng lặp đi lặp lại nhiều lần lấy mẫu từ một mẫu đã trộn đồng nhất.
Phương pháp là lặp lại nếu độ lệch chuẩn tương đối RSD ≤ 2,0%.
Tính đúng
Tính đúng của phương pháp là sự gần sát của kết quả định lượng so với giá trị thực. Do hàm lượng mẫu thử chưa được xác định chắc chắn ở thời điểm nào, vì vậy tính đúng phải được xác định trong toàn bộ vùng cần xác định. Đối với nguyên liệu, tính đúng được xác định trong khoảng 80% đến 120% nồng độ phân tích.
Phương pháp là đúng nếu :
Trung bình tìm lại được từ 98% đến 102%.
Khoảng tin cậy của độ dốc chứa 1 (không có sai số hệ thống tỷ lệ). Khoảng tin cậy của b (y=ax + b) chứa gốc tọa độ (không có sai số hằng định).
1.9.2.3.Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu của phương pháp là khả năng xác định chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác như tạp chất, sản phẩm phân hủy và các thành phần khác.
28
CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Hóa chất, thuốc thử
Captopril Disulfid: EDQM Council of Europe. Control No. 198216 Captopril nguyên liệu : Công Ty TRAPHACO
Captopril chuẩn đối chiếu – VKN –QT146040113, hàm lượng 98,54% MeOH dùng cho sắc ký : Merk
Nước cất 2 lần
KI (500g); I2 ; KH2PO4, H2SO4
H3PO4 85%; Acid acetic băng; Cloroform ; ethyl acetat Bản mỏng Silicagel GF254
Và các hóa chất cần thiết khác.
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao : DIONEX – detector UV diode aray Máy đo quang phổ UV
Máy lắc siêu âm – SONOREX
Máy đo pH : METTLER TOLEDO MP 220 Máy lọc chân không : SATORIOUS
Cân phân tích : SATORIOUS, Cân 5 chữ số Meter AE 163 (VKN) Máy khuấy từ: HEIDOLPH MR 1000
Bình định mức 10, 25, 50, 100 ml
Ống đong 100ml, cốc có mỏ 100, 500, 1000 ml
Pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, màng lọc 0,45µm
Máy Metrohm 848
2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu
- Tham khảo các phương pháp oxy hóa thiol và chuyển hóa của Captopril đã công bố
29
- Tham khảo các phương pháp định lượng Captopril Disulfid đã công bố - Dựa vào cấu tạo phân tử, tính chất lý hóa học của Captopril cũng như điều kiện thực nghiệm ở nước ta hiện nay để nghiên cứu, tổng hợp, thiết lập chỉ tiêu của chất chuẩn Captopril Disulfid, đồng thời xây dựng quy trình định lượng Captopril Disulfid trong mẫu đã tổng hợp bằng phương pháp HPLC có tính chính xác, đặc hiệu cao.
2.2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.2.1. Xây dựng quy trình tổng hợp Captopril Disulfid và tinh chế
* Khảo sát điều kiện bán tổng hợp:
Khảo sát và lựa chọn chất oxy hóa phù hợp, tỷ lệ giữa chất oxy hóa và Captopril, hệ đệm và dung môi phản ứng.
* Khảo sát dung môi để tinh chế:
2.2.2.2.Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất
Hợp chất đối tượng nghiên cứu của đề tài đều là những chất đã biết cấu trúc. Dữ liệu chuẩn dùng để nhận dạng chất nhằm cung cấp thông tin cho thiết lập hồ sơ nhận dạng chuẩn. Việc nhận dạng chất dựa vào:
- So sánh phổ của chất phân tích với phổ chất chuẩn trong cùng điều kiện. - So sánh thông tin phổ, dữ liệu hóa lí, hằng số vật lí của chất với tài liệu khoa học hoặc thông tin đã công bố. Tập hợp các dữ liệu chuẩn đó có thể khẳng định được hợp chất là đúng đối tượng nghiên cứu.
Các phương pháp được sử dụng để xây dựng bộ dữ liệu gồm có: Đo điểm chảy, đo phổ hồng ngoại (trong KBr), đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (H1NMR,C13NMR, DEPT) và 2 chiều (HMBC,HSQC), đo phổ khối lượng (MS).
2.2.2.3. Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất
Sắc kí lớp mỏng: TLC được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết dựa vào sự có mặt của vết duy nhất hoặc vết chính là vết của đối tượng phân tích. Chất càng tinh khiết khi không có vết phụ hoặc vết phụ càng nhỏ.
30
Quét nhiệt vi sai: Sử dụng thiết bị DSC (Differential Scanning Calorimetry) để xác định thông số nhiệt lượng, qua đó đánh giá mức độ tinh khiết của chất chuẩn.
Sắc kí lỏng hiệu năng cao: Sử dụng HPLC để xác định cụ thể số lượng tạp chất và tính gần đúng tỉ lệ tạp chất dựa trên tỉ lệ phần trăm diện tích pic.
Sắc kí lỏng – khối phổ : Đánh gái độ tinh khiết dựa vào sự có mặt của số lượng và tỷ lệ tín hiệu của các mảnh ion khi chạy ở chế độ ESI- negative
2.2.2.4.Thiết lập chất chuẩn và xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất chuẩn
2.2.2.4.1. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng
Xây dựng chỉ tiêu chất lượng:
Căn cứ vào tính chất lí – hóa của nguyên liệu thiết lập chuẩn và các CTCL thông thường của CCĐC sơ cấp để xây dựng các CTCL của CCĐC cần thiết lập.
Xây dựng phương pháp đánh giá:
Tham khảo DĐVN và các dược điển quốc tế để lựa chọn phương pháp phù hợp đánh giá các CTCL.
Khảo sát lựa chọn chương trình sắc kí thích hợp để định lượng và xác định tạp chất.
Dựa trên công thức phân tử và cấu trúc hóa học của các hợp chất chiết xuất từ dược liệu để tìm các các điều kiện sắc kí phù hợp như: Bản chất pha tĩnh, thành phần pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dòng pha động, thể tích tiêm mẫu, nồng độ dung dịch thử, dung môi pha mẫu.
Thẩm định phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu: - Tính đặc hiệu (Specificity)
- Độ tuyến tính và khoảng nồng độ tuyến tính (Linearity and range) - Độ chính xác (Precision)
- Độ đúng (Accuracy): Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn và tính thông qua tỷ lệ thu hồi:
Hàm lượng tìm thấy
Tỷ lệ thu hồi (%) = x 100 Hàm lượng thực cho vào
31
- Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ - Sự phù hợp của hệ thống sắc kí (System suitability) 2.2.2.4.2 Nghiên cứu các điều kiện tiến hành xây dựng phương pháp
Khảo sát điều kiện sắc ký
Chọn bước sóng phát hiện, chọn cột, chọn pha động, tốc độ dòng thích hợp để có pic Captopril cân đối và thời gian lưu hợp lý.
Chúng tôi tiến hành khảo sát trên cột C18 (250mm x 4,6mm, 5µm) là những cột thường dùng trong các cơ sở kiểm nghiệm hiện nay. Tiến hành khảo sát các điều kiện khác để chọn chương trình sắc ký phù hợp.
Lựa chọn dung môi hòa tan Captopril Disulfid hoàn toàn từ mẫu đã tinh chế:
Dựa vào tính chất của Captopril và qua tham khảo tài liệu, bằng thực nghiệm chọn ra dung môi thích hợp để hòa tan Captopril và đảm bảo Captopril không bị thủy phân.
2.2.2.4.3. Xây dựng, đánh giá phương pháp định lượng Captopril Disulfid trong mẫu đã bán tổng hợp và tinh chế
Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Xây dựng phương pháp định lượng
Đánh giá phương pháp xây dựng bằng các tiêu chí
Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ Captopril Disulfidvà diện tích pic trên sắc ký đồ
Tính chính xác của phương pháp:
- Độ lặp lại của phương pháp - Tính đúng của phương pháp
Tính đặc hiệu của phương pháp
2.2.2.4.4. Áp dụng phương pháp xây dựng định lượng Captopril Disulfid trong mẫu đã bán tổng hợp và tinh chế
Áp dụng phương pháp xây dựng tiến hành định lượng Captopril Disulfid trong mẫu đã tinh chế
32
Tiến hành sắc ký theo chương trình đã chọn trên các mẫu thử, song song với mẫu chuẩn.
Trong khoảng tuyến tính, nồng độ chất phân tích tỷ lệ thuận với diện tích pic trên sắc ký đồ. So sánh diện tích mẫu chuẩn và mẫu thử để định lượng chất thử trong dung dịch phân tích, từ đó tính ra hàm lượng chất thử trong mẫu cần định lượng.
2.2.3. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả
2.2.3.1. Đánh giá dung môi hòa tan
Dùng phương pháp HPLC đã xây dựng để đánh giá sự phù hợp, tính dặc hiệu của dung môi sử dụng để hòa tan hoàn toàn Captopril Disulfid trong mẫu đã tinh chế dựa trên kết quả đánh giá tính chính xác, tính đúng của phương pháp. 2.2.3.2. Định tính
Thời gian lưu và hình dạng pic của Captopril trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn (đối chiếu) phải như nhau trong cùng điều kiện sắc ký đã chọn. 2.2.3.3 Định lượng
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp toán thống kê, sử dụng một số công thức sau : Giá trị trung bình: xtb = 1 𝑛 x ∑𝑛 𝑥𝑖 𝑖=1 (2.1) Độ lệch chuẩn : S = √∑𝑛𝑖=1𝑥𝑖𝑥𝑖 − 𝑛𝑥𝑡𝑏𝑥𝑡𝑏 𝑛−1 (2.2)
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%)= 𝑆
𝑥𝑡𝑏 (2.3)
Sai số chuẩn : 𝑆𝑥𝑡𝑏 = 𝑆
√𝑛 (2.4)
Sai số tương đối : ɛ (%) = 𝑡𝛼𝑆𝑥𝑡𝑏
𝑥𝑡𝑏 x 100% (2.5)
33
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1 NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP CAPTOPRIL DISULFID TỪ CAPTOPRIL Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM CAPTOPRIL Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
3.1.1 Lựa chọn phương pháp và khảo sát điều kiện tổng hợp Captopril Disulfid Disulfid
3.1.1.1. Oxy hóa Captopril bởi Iod
Với tác nhân là I2 thì Dược điển anh đã dùng để định lượng Captopril với quy trình như sau: m-captopril = 0.7458g, pha vào bình định mức 50,00 ml. Mỗi lần định lượng thì lấy 10,00 ml dung dịch đã pha. Tiến hành định lượng bằng Iod được theo dõi bằng chuẩn độ đo thế có bảng kết quá như sau:
Bảng 3.1: Sự phụ thuộc giữa thế điện cực với lượng Iod thêm vào V(I2)(ml) E(mV) V(I2)(ml) E(mV) V(I2)(ml) E(mV)
0 294 6.4 180 7.7 344 0.15 228 6.5 181 7.75 348 0.25 217 6.65 182 7.85 354 0.5 207 6.85 185 7.95 358 0.55 204 7.1 190 8.1 361 1.1 193 7.15 192 8.3 366 1.75 188 7.2 193 8.65 370 2.8 186 7.25 195 9 373 2.95 185 7.3 198 9.5 376 3.65 183 7.4 204 14 384 4.8 181 7.45 210 14.5 384 6 176 7.5 220 17 384 6.2 178 7.6 328 19 384 6.3 179 7.65 339 23 383 Từ bảng kết quả giữa E-V ta có đồ thị như sau:
Hình 3.1: Biểu đồ mối tương quan giữa thế điện cực và lượng Iod thêm vào 150 200 250 300 350 400 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
34
Từ biểu đồ ta: thấy rằng khi nhỏ tới 23 ml dung dịch Iod 0.1N thì chỉ có 1 bước nhảy thế, mặt khác thể tích Iod ở bước nhảy thế khoảng 7,4-7,5 ml nên 23/7,4 >2 hãy xấp xỉ 3. Nếu như có 1 bước nhảy thể tiếp theo thì phải nhảy ở điểm khoảng 14-15 ml dung dịch Iod 0.1N nhỏ vào.Vậy chứng tỏ rằng Iod phản ứng với Captopril có nhiều khả năng chỉ tạo ra 1 sản phẩm. Đồng thời quá trình phản ứng nhanh, độ ổn định của thế phản ứng cao nên Iod được chọn làm chất oxy hóa.
3.1.1.2.Phương pháp bán tổng hợp Captopril Disulfid đề xuất
Hòa tan 0.1500g Captopril vào 30 ml nước cất, cho con khuấy từ khuấy đều và nhỏ từ từ 7.4 ml dung dịch Iod 0.1N vào trong khoảng thời gian 2h đồng hồ, nhiệt độ thực hiện : nhiệt độ phòng.
Sau khi phản ứng kết thúc: lọc tủa, sấy khô ở 27oC trong 2h. Tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng có hệ dung môi : Cloroform – ethylacetat - acid acetic băng = 4 :5:3 có kết quả như sau:
Hình 3.2 : Sắc ký lớp mỏng chạy sản phẩm Vết bên trái là của Captopril
Vết bên phải là của mẫu đã tổng hợp
Qua số lượng vết tách trên trên TLC ta thấy chỉ có 1 vết, chứng tỏ khả năng cao chỉ có 1 chất phân tích
35
Hình 3.3: Phân tích phổ khối của sản phẩm
Phân tích độ tinh khiết của chất đã tổng hợp bằng LC-MS/MS (position), có kết quả như sau:
Phổ khối của Captopril Disulfid là
M/z = 433,04 (M +H) ; 455,05 (M+Na); 470,98 (M+K) M/z = 887,05 (2M+Na) ; 903,04 (2M+K);
Các mảnh của Captopril Disulfid sau khi phân mảnh là : M/z = 216.02; 357.98
Ngoài ra còn 1 số mảnh là các chất đã bị oxy hóa lên bậc cao hơn hay là chất A (Mục 1.4.3 : Các chất chuyển hóa của Captopril Disulfid)
36
Đồng thời mảnh M/z = 357,98 cũng có thể là tạp thủy phân D2 của Captopril Disulfid (Mục 1.4.3: Các chất chuyển hóa của Captopril Disulfid)
Qua thông số về phổ ta thấy như sau : đa số sản phẩm là Captopril Disulfid nhưng đang cần lẫn 1 lượng tạp oxy hóa A và tập thủy phân D2 của Captopril Disulfid. Chứng tỏ khi nhỏ 7,4 ml Iod 0.1 N (Chưa tới điểm tương đương) vào dung dịch chưa Captopril thì đã có sự oxy hóa lên bậc cao hơn hay sản phầm A và sản phẩm thủy phân D2 mà chỉ có thể phát hiện bằng sắc ký lỏng khối phổ.
Đồng thời xem xét lại mối tương quan giữa đạo hàm của thế điện cực theo lượng dung dịch Iod:
Hình 3.4 : Mối tương quan giữa dE/dV và V
Qua biểu đồ ta thấy : tại đoạn có thể tích Iod nhỏ vào 0 đến 0.5 ml thì dE/dV tăng lên và sau đó giảm xuống, còn từ 0.5 ml đến 4.8 ml thì dE/dV chỉ có tăng mà không có giảm.
Qua biểu đồ và sản phẩm phân tích bằng phổ khối thì cơ chế tạo thành Captopril Disulfid không phải là:
2R-SH + I2 → R-S-S-R + 2HI
Đồng thời tham khảo các tài liệu [16] [29] [31] [43] về chuyển hóa của gốc Thiol với Iod trong môi trường nước thì có cơ chế như sau:
(1) R-SH + I2 → R-S-I + HI (2) R-S-I +H2O → R-S-OH + HI R-S-OH + R-SH → R-S-S-R + H2O -500 -400 -300 -200 -100 0 0 1 2 3 4 5 6 dE/dV V (Thể tích iod)
37
Qua cơ chế trên ta thấy sự phù hợp với phản ứng của Iod với Captopril ở những điểm sau :
Trên biểu đồ dE/dV ta thấy có sự tụt giảm thế chính là giai đoạn tạo R-S- OH, đồng thời có giai đoạn dE/dV tăng trở lại chứng tỏ đã có sản phẩm tạo thành là R-S-S-R làm cho sự không có sự giảm thế này nữa làm cho dE/dV tăng trở lại. Nhưng sự tăng trở lại này vẫn âm vì Captopril Disulfid chưa bão hòa trong nước.
Đồng thời cũng có cân bằng :
Kcb = [RSSR]/([RSOH]x[RSH])
Khi Captopril Disulfid bão hòa trong nước thì có thể tính được lượng RSH tối thiểu còn lại để duy trì cân bằng này:
[RSH]o = sqrt([RSSR]/Kcb)
Khi nhỏ Iod vào quá cân bằng này thì lượng [RSH] giảm đồng thời với quá trình đó là Iod sẽ phản ứng với [RSSR] tạo ra sản phẩm oxy hóa cao hơn là A và tiếp túc có cân bằng như sau :
R(S=O)SR + H2O → RSO2H + RSH
RSO2H tan tốt trong nước nên làm giảm sản phẩm và giảm độ tinh khiết của sản phẩm.
Điểm cần bằng có thể theo dự đoán dự vào đồ thị dE/dV, khi xuất hiện điểm