3.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích
3.3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng và xác định tạp chất 3.3.1.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng
Tham khảo phương pháp định lượng Captopril Disulfid và định lượng Captopril ở Dược điển Anh – BP 2013 và dược điển Mỹ USP 29 thì chúng tôi có chương trình chạy như sau:
Bước sóng phát hiện : λ=220 nm
Pha động : MeOH : Nước cất : H3PO4(85%) = 55:45:0.1 Pha tĩnh : Cột C18 - Zobax
Thể tích tiêm : V = 20 µl - mẫu pha trong pha động Tốc độ dòng là v = 1 ml/min
Nhiệt độ : nhiệt độ phòng
49
Hình 3.11: Sắc ký đồ chạy theo chương trình dược điển anh
Theo chương trình sắc ký chạy theo dược điển anh thì pic sắc ký của Captopril Disulfid quá nhỏ, không đạt được độ phân giải cần thiết, đồng thời hệ số đối xứng As = 0,73, chứng tỏ pic của Captopril Disulfid đang còn kéo đuôi.
Sau đây chúng tôi thay đổi 1 số thông số để được pic Captopril Disulfid đạt được độ phân giải cần thiết.
1. Giảm bớt thể tích Captopril chuẩn thêm vào, đồng thời tăng thể tích tiêm mẫu lên 50µl thì có sắc ký đồ như sau:
50
Sau khi thay đổi thì đạt được độ tương quan hơn giữa pic Captopril và pic của Captopril Disulfid, độ phân giải giữa 2 pic lúc này là Rs = 6.59 , nhưng hệ số đối xứng của pic Captopril Disulfid vẫn không có sự thay đổi AS= 0.73.
2. Thay đổi hệ dung môi
Chúng tôi thực nghiệm với các hệ dung môi sau:
Hệ I: MeOH : Nước cất : H3PO4(85%) = 60 : 40 : 0.1 Hệ II: MeOH : Nước cất : H3PO4(85%) = 50 : 50 : 0.1 Hệ III: MeOH : Nước cất : H3PO4(85%) = 53 : 47 : 0.1 Kết quả sau khi chạy sắc ký thì có kết quả như sau:
Hình 13: sắc ký đồ chạy hệ dung môi I
Hình 3.14: Sắc ký đồ chạy hệ dung môi II
51 Nhận xét :
Khi chạy hệ dung môi I thì hệ số đối xứng của pic Captopril Disulfid giảm chỉ còn As= 0,70; chạy với hệ dung môi II và III thì hệ số đối xứng As = 0.75. Tuy nhiên thời gian lưu của Captopril Disulfid đã tăng lên đáng kể nhưng thời gian lưu của Captopril Disulfid ở hệ II dài hơn ở hệ III nên chúng tôi giữ nguyên tỷ lệ dung môi như hệ dung môi III để tiếp tục khảo sát tốc độ dòng
3. Thay đổi tốc độ dòng
Chúng tôi khảo sát với 2 tốc độ dòng lần lượt là 1,0 ml/min và 1,2 ml/min thì có các sắc ký đồ sau:
Hình 3.16 : sắc ký đồ khi chạy với tốc độ dòng 1,0 ml/min
52 Nhận xét :
Khi chạy với tốc độ dòng là v = 1,0 ml/min thì thời gian lưu của Captopirl Disulfid là 8,233 phút và As = 0.75. Nhưng khi chạy với tốc độ dòng là 1,2 ml/min thì hệ số đối xứng As = 0.76. Hay khi tăng tốc độ dòng thì thời gian lưu cũng giảm và hệ số đối xứng cũng tăng. Đồng thời với quá trình này thì áp suất ở đầu cột tăng từ 124 bar lên 154 bar. Chính vì vậy chúng tôi chọn tộ dòng là 1,2 ml để
tiếp tục khảo sát.
4. Chọn bước sóng thích hợp
Chúng tôi khảo sát với 2 bước sóng dùng để phát hiện Captopril Disulfid là λ1 = 210nm và λ2= 220 nm thì có kết quả trên sắc ký đồ như sau:
Hình 3.18: Sắc ký đồ Captopril Disulfid khi chạy 2 bước sóng Nhận xét :
với bước sóng λ1 = 210nm cho độ hấp thụ gấp đôi ở bước sóng λ2= 220 nm. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn bước sóng λ1 = 210nm dùng để thẩm định phương pháp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.1.1.2 Xác định tạp chất
Xác định hàm lượng tạp chất dựa vào diện tích pic của tạp chất so với tổng diện tích của tất cả các pic xuất hiện trong sắc ký đồ.
53
Bảng 3.11: Thông số sắc ký đồ của Captopril Disulfid (tổng hợp)
Hàm lượng phần trăm tạp chất : 16,26/(16,26+2326,19)*100% = 0,69%
3.3.1.2 Thẩm định phương pháp phân tích
Tính thích hợp của hệ thống
Tiến hành tiêm 6 lần dung dịch chuẩn đã được chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu và diện tích pic. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích pic và số đĩa lý thuyết.
Kết qủa được trình bày ở bảng 3.12
Bảng 3.12: Thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết khi chạy độ ổn định. STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU) Số đĩa lý thuyết
1 6,541 368,19 2658 2 6,538 369,42 2661 3 6,561 370,00 2661 4 6,547 371,84 2663 5 6,557 367,70 2656 6 6,568 372,72 2664 RSD 0.54% 0.11% Tính đặc hiệu
Tiêm lần lượt dung môi pha mẫu, dung dịch thử và dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký .
54
Hình 3.20: Dung môi pha mẫu – mẫu trắng
Hình 3.21: Sắc ký đồ mẫu chuẩn
Hình 3.22 : sắc ký đồ mẫu thử Nhận xét :
Thời gian lưu của Captopril trên mẫu thử và trên mẫu chuẩn tương ứng với nhau, đồng thời cũng trên khoanrgt hời gian đó thì trên mẫu trắng không xuất hiện bất kỳ 1 pic nào.
Xuất hiện 1 píc trên mẫu thử ở t = 2,475 phút mà trên mẫu chuẩn và mẫu trắng không có pic này. Chứng tỏ píc này là pic tạp có trong mẫu thử.
55 Khoảng tuyến tính
Pha một dãy nồng độ dung dịch của Captopril Disulfid có nồng độ biến thiên từ 2,5µg/ml(50%) đến 7,5µg/ml (150%).
Cân chính xác 1 lượng bột Captopril Disulfid chuẩn hàm lượng 100% (mCPDS= 5,43 mg) cho vào bình định mức 10,00 ml. Thêm 9 ml pha động, lắc kỹ siêu âm trong 2 phút. Thêm hỗn hợp dung môi đến vạch và lắc đều thu được dung dịch gốc 1. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch gốc 1 vừa pha cho vào bình định mức 10,00 ml. Thêm 4 ml pha động, lắc đều, bổ sung thêm pha động cho tới vạch và lắc đều thu được dung dịch gốc 2. Hút chính xác 1,0 ml dung dịch gốc 2 vừa pha cho vào bình định mức 10,00 ml. Thêm 8 ml pha động, lắc đều, bổ sung thêm pha động cho tới vạch và lắc đều thu được dung dịch gốc 3. Dung dịch gốc 3 thu được có nồng độ Captopril Disulfid khoảng 271,5 µg/ml. Tiếp hành pha loãng theo bảng….. để thu được các dung dịch có nồng độ lần lượt là 27,15 µg/ml(50%), 38,01µg/ml (70%); 54,30 µg/ml (100%), 70,59 µg/ml (130%), 81,45 µg/ml (150%).
Bảng 3.13: Cách pha dãy dung dịch khảo sát khoảng tuyến tính
Dung dịch số 1 2 3 4 5
số µl dung dịch gốc (271,5µg/ml) 100 140 200 260 300 Số µl hỗn hợp pha động 900 860 800 740 700 Nồng độ dung dịch (µg/ml) 27,15 38,01 54,30 70,59 81,45
Tiêm 50µl mỗi dung dịch trên vào hệ thống HPLC đã chạy ổn định với pha động 30 phút. Tiến hành sắc ký. Ghi lại giá trị các diện tích pic đo được ứng với các nồng độ Captopril Disulfid. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính được trình bày ở bảng 3.14
Bảng 3.14: Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic
Dung dịch số 1 2 3 4 5
Nồng độ dung dịch (µg/ml) 27,15 38,01 54,30 70,59 81,45 Diện tích pic (mAU*min) 175,10 249,87 372,72 510,46 588,66
56
Từ kết quả thu được ở bảng 3.14, chúng tôi thiết lập mối tương quan giữa diện tích pic thu được trên sắc ký đồ và nồng độ của dung dịch. Phương trình hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan này là: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
y= 7,7174 x – 39,692 với hệ số tương quan là r = 0,999, R2 = 0,9995 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của Captopril được ghi ở hình 3.23
Hình 3.23 : Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của Captopril Disulfid
Từ kết quả thu được ở hình 3.23 cho ta thấy: tất cả các giá trị đo được nằm trên đường hồi quy 50% đến 150% nồng độ định lượng tương đương với 27,15 µg/ml đến 81,45 µg/ml.
Như vậy, trong khoảng nồng độ từ 27,15 µg/ml đến 81,45 µg/ml có sự phụ thuộc tuyến tính giữ nồng độ dung dịch và diện tích pic của Captopril Disulfid. Sự phụ thuộc này là chặt chẽ. Khoảng nồng độ khảo sát là rộng nên thuận tiện cho việc phân tích định lượng trong nguyên liệu.
Độ chính xác
Chuẩn bị 6 mẫu thử nguyên liệu Captopril Disulfid đã tổng hợp và 6 mẫu chuẩn dùng chất chuẩn gốc Captopril Disulfid hàm lượng 100% của EDQM.
y = 7,7174x - 39,692 R² = 0,999 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 25 35 45 55 65 75 85 Tuyến tính Diện tích pic Nồng độ
57
Tiêm lần lượt từng mẫu thử và mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn, tính toán hàm lượng các hoạt chất trong mẫu thử theo công thức 3.1.Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của 6 phép thử độc lập. Phương pháp là lặp lại khi RSD ≤ 2%. Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá bằng sai số tương đối (ɛ %) của 6 phép thử song song. Khi ɛ càng nhỏ, thì độ lặp lại của phương pháp càng cao. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp được ghi lại ở bảng 3.15
Bảng 3.15: Kết quả đánh giá độ chính xác của phương pháp
STT
Mẫu thử Mẫu chuẩn Hàm
lượng Captopril Disulfid chuẩn gốc (%) Hàm lượng Captopril Disulfid thử (%) Khối lượng cân (mg) Diện tích pic (mAU*min) K/l Captopril Disulfid chuẩn gốc (mg) Diện tích pic (mAU*min) 1 8.11 571.24 5.43 372.72 100,0 99.18 2 4.39 291.27 4.78 323.26 100,0 99.29 3 5.12 346.13 4.92 333.94 100,0 99.23 4 4.76 319.47 5.21 355.96 100,0 99.36 5 6.34 438.45 5.04 343.05 100,0 99.31 6 5.16 348.83 4.87 330.14 100,0 99.15 Số liệu thống kê xtb = 99,25 (%) S = 0.8947 Sx = 0.3652 RSD = 0.90(%) ∆x = 0.7159 ɛ = 0.72(%)
Kết quả đánh giá tính chính xác của phương pháp cho thấy, trong các điều kiện sắc ký đã chọn, độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả rất nhỏ (RSD = 0,90); với độ tin cậy p = 0,95, sai số tương đối của 6 phép thử song song (ɛ = 0,72%) cho thấy phương pháp định lượng Captopril Disulfid trong mẫu tổng hợp xây dựng là chính xác .
58
Đánh giá tính đúng của phương pháp được tiến hành dựa trên việc khảo sát khả năng tìm lại hoạt chất trong các mẫu chuẩn ở nồng độ 80% đến 120% nồng độ định lượng.
Cân 9 mẫu Captopril Disulfid chuẩn gốc, chia thành 3 nhóm, mỗi nhóm 3 mẫu như sau :
Nhóm I : cân chính xác mỗi mẫu khoảng 4,0mg Captopril Disulfid chuẩn gốc do EDQM sản xuất (hàm lượng 100%)
Nhóm II :cân chính xác mỗi mẫu khoảng 5,0mg Captopril Disulfid chuẩn gốc.
Nhóm III:cân chính xác mỗi mẫu khoảng 6,0mg Captopril Disulfid chuẩn gốc. Tiến hành định lượng các mẫu này theo phần độ chính xác của phương pháp. Kết quả được trình bày ở bảng 3.16
Bảng 3.16: Kết quả đánh giá tính đúng của phương pháp
Nhóm Mẫu K/l Captopril Disulfid chuẩn gốc (mg) Diện tích pic (mAU*min) Khối lượng Captopril Disulfid tìm lại(mg) Phần trăm Captopril tìm lại (%) I 1 4.26 283.46 4.24 99.53 2 4.17 276.34 4.15 99.52 3 4.34 288.87 4.31 99.30 II 4 5.43 372.72 5.41 99.63 5 4.92 333.94 4.90 99.59 6 5.04 343.05 5.02 99.60 III 7 6.57 457.78 6.54 99.54 8 6.42 447.52 6.40 99.69 9 6.26 435.27 6.23 99.52 Chuẩn 5.43 373.52 5.41 100.00 Số liệu thống kê xtb =99,54%) S = 0.011% RSD = 0,011(%) ∆x = 0,071 ɛ = 0,071(%)
Giá trị trung bình của tỷ lệ thu hồi là 99,54% ; độ lệch chuẩn tương đối là RSD = 0,011% < 2% ; với độ tin cậy p = 0,95 thì sai số tường đối của 9 phép thử
59
nhỏ (ɛ = 0,071%). Khoảng tin cậy của tỷ lệ thu hồi là : 99,48≤ x ≤99,62. Kết quả này cho thấy phương pháp có độ đúng cao.
Để đánh giá sai số tỷ lệ và sai số hệ thống trong phương pháp, chúng tôi thiết lập mối tương quan giữa lượng hoạt chất ban đầu và lượng hoạt chất ban đầu và lượng hoạt chất tìm lại. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa lượng hoạt chất và lượng hoạt chất tìm lại hình 3.24
Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa lượng hoạt chất ban đầu và lượng hoạt chất tìm lại là :
y = 0,9981x – 0,0135 với hệ số tương quan r=0,9999, R2 = 0,9998 Độ lệch chuẩn của độ dốc là : Sa = 0,00185
Độ lệch chuẩn của y-intercept là : Sb = 0,00988
Khoảng tin cậy của độ dốc là : 0,9937≤ a ≤ 1,0025 chứa 1 với độ tin cậy là p = 0,95. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khoảng tin cậy của y-intercept : -0,0368 ≤ b ≤ 0,0099 chứa gốc tọa độ với độ tin cậy là p = 0,95.
Hình 3.24. : Sự tương quan giữa lượng Captopril ban đầu và lượng tìm lại Như vậy ta thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát, phương pháp xây dựng có độ đúng cao, không mắc sai số tỷ lệ (khoảng tin cậy của độ dốc chứa 1 và không có sai số hệ thống (khoảng tin cậy của y-intercept chứa 0)
y = 0,9981x - 0,0135 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 độ đúng
do dung Linear (do dung)
KL tìm lại
60
3.3.1.3 Độ mất khối lượng do làm khô
Với quá trình tinh chế sử dụng MeOH và sấy ở nhiệt độ 27oC nhưng Captopril Disulfid vẫn là 1 chất kết tinh nên vẫn cần xác định khối lượng mất đi khi là khô. Với đối tượng là Captopril Disulfid là 1 chất dễ bị oxy hóa, đồng thời không thể dùng phương pháp Karh-fisher để xác định nước kết tinh nên chúng tôi dùng phương pháp đo quét nhiệt vi sai TGA để xác định khối lượng mất do làm khô. Kết quả được trình bày ở hình 3.25 và phụ lục 4.
Hình 3.25: Độ mất khối lượng do làm khô
Kết quả : không xác định được độ mất khối lượng hay khối lượng bị mất rất nhỏ.
3.3.2 Áp dụng phương pháp xây dựng tiến hành định lượng Capotpirl Disulfid trong mẫu đã tổng hợp được Disulfid trong mẫu đã tổng hợp được
Áp dụng phương pháp vừa xây dựng, chúng tôi tiến hành định lượng Captopril Disulfid trong Captopril Disulfid đã tổng hợp được
Sử dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng Captopril Disulfid trong mẫu đã tổng hợp, dùng chất chẩn gốc là Captopril Disulfid hàm lượng 100,0 % do EDQM để pha dung dịch chuẩn gốc. Tiến hành định lượng 6 lần. Kết quả định lượng Captopril Disulfid được trình bảy ở bảng 3.17
61
Bảng 3.17: Kết quả định lượng Captopril Disulfid trong mẫu tổng hợp STT Khối lượng
cân (mg) Diện tích pic (mAU*min)
Hàm lượng Captopril trong nguyên liệu (%)
1 7.12 496.58 99.17 2 5.11 345.52 99.25 3 6.17 424.94 99.15 4 4.16 273.98 99.28 5 5.65 386.04 99.21 6 6.25 431.67 99.30 Chuẩn 5.43 372.72 100% 371.85 373.15 Trung bình xtb =99,22% S = 0.06 RSD = 0,06(%) ∆x = 0.053 ɛ = 0,053(%)
Từ các kết quả khảo sát chúng tối thấy : các mẫu chất chuẩn đạt tiêu chuẩn về hàm lượng qui định (nằm trong khoảng 98,0% đến 101,5%)
Khoảng tin cậy của hàm lượng chất đối chiếu là 99.167% → 99.273% Pic Captopril Disulfid trên sắc ký đồ cao, cân xứng, tách hoàn toàn với các pic tạp .
62
CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN
4.1 VỀ VIỆC LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng lựa chọn thiết lập chất chuẩn đối chiếu là Captopril Disulfid, đây là 1 tạp chất có trong các chế phẩm có chứa Captopril, đồng thời Captopril Disulfid là 1 tạp chất độc, có khả năng gây quái thai. Nhưng tại Việt Nam hiện nay chưa có chất chuẩn này để xác định và quy định về giới hạn của Captopril Disulfid có trong các chế phẩm chứa Captopril.
Vì vậy, kết quả của nghiên cứu có thể tiếp tục được sử dụng để nghiên cứu và nâng cao chỉ tiêu chất lượng của các chế phẩm thuốc .
4.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐÃ SỬ DỤNG 4.2.1 Các phương pháp tổng hợp
Với các phương pháp tổng hợp Captopril Disulfid thì gần như không có. Tháng 10/2014 thì trường Đại học Y dược TP Hồ chí Minh và đại học y dược Cần thơ đã công bố phương pháp tổng hợp Captopril Disulfid từ Captopril và đã được