Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

1.6.3.1. Nguyên tắc của phổ cộng hưởng từ

Nếu hạt nhân nguyên tử có momen từ được dặt trong một từ trường, thì hạt nhân nguyên tử sẽ quay với 1 tần số xác định phụ thuộc vào cường độ từ trường bên ngoài (B)

ν= Trong đó: : Hệ số hồi chuyển đặc trưng cho từng hạt nhân B : Cường độ từ trường

Sau đó, một cuộn dây dẫn điện sẽ phát ra sóng vô tuyến có tần số ν, làm cho hạt nhân hấp thụ năng lượng làm vecto từ trường hạt nhân lệch hướng ban đầu, tiếp theo tắt phát sóng vô tuyến thì vecto từ trường hạt nhân trở về ban đầu sẽ phát ra từ trường làm cho cuộn cảm phát hiện dao động điện, nên thu được peak trên giản đồ.

18

1.4.3.2. Ứng dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Căn cứ vào độ dịch chuyển hóa học, tương tác spin-spin, diện tích dưới tín hiệu cộng hưởng để biện giải phổ 1H-NMR, 13C-NMR,…..

1.7.TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO [1][4][46] 1.7.1. Định nghĩa

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao. Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế: hấp phụ, phân tán, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt.

1.7.2. Các thông số cơ bản của quá trình sắc ký

 Thời gian lưu tR :

Thời gian lưu của một chất là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detertor và cho pic trên sắc ký đồ tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của pic. Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ, nó là hằng số đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi. Ngoài ra trong một phép phân tích còn thời gian lưu hiệu chỉnh, được tính bằng công thức sau: tR’ = tR – tM .

Với: tM là thời gian lưu của 1 chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh.

Nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì pic bị loãng, thời gian phân tích kéo dài.

 Hệ số phân bố k : là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột

k = Trong đó : CS là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh CM là nồng độ mol của chất tan trong pha động

19

 Hệ số dung lượng k’ : cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong hai pha và được tính theo sức chứa của cột:

k’ = k x = = = k’ : tối ưu trong khoảng : 1≤ k ’≤ 8

 Hệ số chọn lọc α :

Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B, người ta dùng hệ số chọn lọc α :

α = = =

Qui ước : Chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên α > 1 Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0

 Hệ số đối xứng của pic F :

F = Trong đó :W : chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic a : là khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.

 Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N :

Hiệu lực cột được đo bằng thống số : Số đĩa lý thuyết N của cột

N = 5,54 x hoặc 16 x

Trong đó : W1/2h là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic. W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic.

 Độ phân giải Rs của cột :

Rs = hoặc

Trong đó :

20

WB ; WA : độ rộng pic đo ở các đáy pic.

W1/2A ; W1/2B : độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic Yêu cầu : RS > 1 ; giá trị tối ưu Rs = 1,5.

1.7.3. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC

Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm các bộ phận chính sau :

 Bơm cao áp :

Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được áp suất (thường 0 – 400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn định, phù hợp với quá trình sắc ký.

 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi :

Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh đôi khi bằng thép không gỉ. Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường dùng màng lọc cỡ 0,45 µm) và đã đuổi khí hòa tan.

 Hệ tiêm mẫu :

Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ thống tiêm tự động .

 Cột sắc ký:

Quá trình tách các chất diễn ra ở cột. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Trong cột được nhồi pha tĩnh. Cột sắc ký có nhiều cỡ khác nhau tùy thuộc vào mức độ và mục đích của quá trính sắc ký. Nói chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10 – 25 cm, đường kính 2 – 5 mm .

 Detector :

Là bộ phận phát hiện chất phân tích. Tùy theo bản chất của các chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp bao gồm các loại sau: Detector hấp thụ UV – VIS, Detector phổ phát xạ nguyên tử, Detector huỳnh quang.

21

1.7.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

1.7.4.1.Lựa chọn pha tĩnh cho HPLC

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của một hỗn hợp nhiều chất. Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động sắc ký được chia thành 2 loại :

 Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân tích thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực.

 Sắc ký pha đảo: pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích thường là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực .

Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền Silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon. Trong sắc ký hấp phụ pha đảo: pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất.

Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc Siloxan:

 R là các nhóm phân cực (ưa nước): nhóm OH hoặc các alkylamin –CH2- NH2, alkyl nitril – CH2 – CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha thuận để phân tích các chất ít hoặc không phân cực.

 Với R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế bàng cách alkyl hóa các nhóm OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl-R của mạch carbon (C2;C8;C18) hay các gốc carbon vòng phenyl. Do các nhóm OH thân nước được thay thế bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực.

22

Silica đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion.

Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn những nhóm –OH gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy theo môi trường pH phân tích.

Trong môi trường quá acid pH< 2 thì có sự phân ly các nhóm ether ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không thể tương tác với cột.

Trong môi trường Base (pH>7), các nhóm –OH trong cột sẽ tương tác với chất tan có tính base. Tương tác này khác với kiểu tương tác của chất tan với nhóm –Si-C18, dẫn đến hiện tượng cùng một chất nhưng sẽ có những đỉnh ra khác nhau hay là hiện tượng kéo đuôi. Kết quả giảm đi độ chính xác.

Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các hợp chất như trimethylclorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexametyldisizan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này. Cấu trúc pha liên kết được trình bày ở hình 1.2

Hình 1.5: Cấu trúc cột LC-DB

Có một cách khác để loại trừ bớt sự ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che chắn đi những nhóm –OH, được trình bày ở hình 1.3.

23

Hình 1.5: Cấu trúc cột có gốc Isopropyl

Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của dây C18 làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh (Cột EPS – Expended Polar Selectivity)

1.7.4.2.Lựa chọn pha động cho HPLC

Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp. Trong sắc ký pha đảo, pha động là dung môi phân cực như: nước, methanol, acetonitril … hoặc hỗn hợp của chúng. Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ.

Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký như: độ chọn lọc α, thời gian lưu tR, độ phân giải Rs, độ rộng của đáy pic. Nên việc phân tích, lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng .

Yêu cầu của 1 pha động :

 Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian.

 Hòa tan chất cần phân tích .

 Có độ tinh khiết cao.

 Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký .

 Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường.

Có các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả :

 Bản chất của dung môi để pha pha động .

 Thành phần các chất trong pha động .

24

 Tốc độ dòng của pha động.

Chọn đệm – pH :

Trong sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính chất acid hoặc base thường phải sử dụng đệm ở pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký.

Tốc độ dòng của pha động :

Sau khi có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp, để tăng hiệu lực tách của quá trình phải chọn tốc độ pha động phù hợp, đảm bảo việc tách các chất phân tích được tốt nhất mà đạt hiệu quả cao về thời gian và kinh tế.

1.7.4.3. Lựa chọn Detector

Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ ghi nhận bởi Detector chuyển thành tín hiệu và được ghi trên sắc ký đồ. Detector phổ biến nhất là Detector UV- VIS. Tùy theo chất cần phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác nhau.

1.7.5. Phương pháp định lượng bằng HPLC

1.7.5.1. Cách đánh giá pic

 Đánh giá diện tích pic: để tính diện tích pic có thể dùng tích phân kế hoặc dùng máy tính đã cài đặt sẵn chương trình.

 Đánh giá chiều cao của pic với điều kiện các chỉ số k’ là hằng định. Đo chiều cao của pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thử từ thấp đến trung bình.

1.7.5.2. Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC

Phương pháp định lượng chất phân tích trong HPLC dựa trên nguyên tắc nồng độ của chất phân tích tỷ lệ thuận với chiều cao hoặc diện tích pic của chất phân tích. Các phương pháp tính kết quả thường dùng

 Phương pháp chuẩn nội.

 Phương pháp chuẩn hóa diện tích.

25

Dựa trên việc so sánh đáp ứng pic của mẫu thử với mẫu chuẩn được phân tích trong cũng một điều kiện. Nồng độ (hàm lượng) của chất chưa biết được tính toán dựa trên nồng độ (hàm lượng) chất chuẩn đã biết hoặc suy ra từ đường chuẩn. Trong khóa luận này, chúng tôi sử dụng phương pháp chuẩn ngoại, chuẩn hóa một điểm: chuẩn bị một mẫu chất chuẩn và một mẫu chất thử. Tiến hành song song với nhau. Căn cứ vào diện tích pic của chất chuẩn, chất thử và nồng độ chất chuẩn, tìm được nồng độ của chất thử.

Điều kiện áp dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm: trong khoảng nồng độ khảo sát, chứng minh luôn có tương quan hồi quy tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích với diện tích pic của chất phân tích.

1.8. QUÉT NHIỆT VI SAI 1.8.1. Quét nhiệt vi sai DSC 1.8.1. Quét nhiệt vi sai DSC

DSC là phương pháp phân tích nhiệt mà ở đó độ chênh lệch về nhiệt độ ∆ T giữa hai mẫu: mẫu chuẩn và mẫu nghiên cứu luôn được duy trì bằng không. Thay vào đó người ta sẽ xác định ethanpy của quá trình này bằng cách xác định lưu lượng nhiệt vi sai cần để duy trì mẫu vật liệu và mẫu chuẩn trơ ở cùng nhiệt độ. Nhiệt độ này thường được lập trình để quét một khoảng nhiệt độ bằng cách tang tuyến tính ở một tốc độ nhất định. Ta sẽ xác định được năng lượng đó thông qua tính diện tích giới hạn bởi đồ thị mà chúng ta thu được.

DSC cho chúng ta thông tin về sự chuyển pha của vật chất và xác được độ tinh khiết của hợp chất.

1.8.2. Phân tích nhiệt trong lượng TGA

Phương pháp dựa trên cở sở xác định khối lượng của mẫu vật chất bị mất đi (hoặc nhận vào) trong quá trình chuyển pha như một hàm của nhiệt độ. Khi vật chất bị nung nóng khối lượng của chúng sẽ bị mất đi từ các quá trình đơn giản như bay hơi hoặc các quá trình hóa học: như phân giải, oxy hóa, hoặc giải phóng khí. Một số vật liệu có thể nhận được khối lượng do chúng phản ứng với oxy không khí trong môi trường kiểm tra.

26

Khối lượng bị mất đi trong quá trình chuyển pha

Khối lượng bị mất theo thời gian và theo nhiệt độ do quá trình khử nước hoặc phân ly.

Đường phổ TGA đặc trưng cho một hợp chất hoặc một hệ do thứ tự của các phản ứng hóa học xuất hiện tại một khoảng nhiệt độ xác định là một hàm của cấu trúc phân tử.

Sự thay đổi của khối lượng là kết quả của quá trình đứt gãy hoặc sự hình thành vô số các liên kết vật lý và hóa học tại một nhiệt độ gia tăng dẫn đến sự bay hơi của các sản phẩm hoặc tạo thành các sản phẩm nặng hơn.

1.9. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH [10] 1.9.1. Yêu cầu chung 1.9.1. Yêu cầu chung

Thẩm định một phương pháp phân tích trong nguyên liệu là một quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc trưng cơ bản của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế, nhằm chứng minh rằng phương pháp đó là đáng tin cậy và có khả năng thực hiện phân tích những mẫu được khảo sát.

1.9.2. Các tiêu chí trong thẩm định phương pháp

1.9.2.1.Khoảng tuyến tính, đường chuẩn

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ đáp ứng của pic (diện tích pic) với nồng độ chất phân tích trong dung dịch.

Tính tuyến tính của phương pháp phân tích là khả năng suy ra các kết quả thử một cách trực tiếp hoặc thông qua phép biến đổi toán học, nó tỷ lệ thuận với nồng độ của chất cần phân tích có trong mẫu thử trong một giới hạn nồng độ đã cho.

Khoảng tuyến tính: là khoảng nồng độ từ nồng độ thấp nhất đến nồng độ cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Thông thường đối với nguyên liệu thì khảo sát tính tuyến tính trong khoảng từ 80% đến 120% nồng độ so với nồng độ định lượng. Đường chuẩn phải có ít nhất là 5 nồng độ của chất

27

chuẩn pha trong dung dịch và ít nhất 4/5 điểm trong dãy chuẩn có độ đúng và độc chính xác đạt yêu cầu.

1.9.2.2.Tính chính xác : bao gồm các tiêu chí về độ lặp lại và độ đúng

 Độ lặp lại

Độ lặp lại của phương pháp phân tích là mức độ phù hợp với nhau giữa các kết quả riêng rẽ khi áp dụng phương pháp để định lượng lặp đi lặp lại nhiều lần