2.2.2.1. Xây dựng quy trình tổng hợp Captopril Disulfid và tinh chế
* Khảo sát điều kiện bán tổng hợp:
Khảo sát và lựa chọn chất oxy hóa phù hợp, tỷ lệ giữa chất oxy hóa và Captopril, hệ đệm và dung môi phản ứng.
* Khảo sát dung môi để tinh chế:
2.2.2.2.Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất
Hợp chất đối tượng nghiên cứu của đề tài đều là những chất đã biết cấu trúc. Dữ liệu chuẩn dùng để nhận dạng chất nhằm cung cấp thông tin cho thiết lập hồ sơ nhận dạng chuẩn. Việc nhận dạng chất dựa vào:
- So sánh phổ của chất phân tích với phổ chất chuẩn trong cùng điều kiện. - So sánh thông tin phổ, dữ liệu hóa lí, hằng số vật lí của chất với tài liệu khoa học hoặc thông tin đã công bố. Tập hợp các dữ liệu chuẩn đó có thể khẳng định được hợp chất là đúng đối tượng nghiên cứu.
Các phương pháp được sử dụng để xây dựng bộ dữ liệu gồm có: Đo điểm chảy, đo phổ hồng ngoại (trong KBr), đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (H1NMR,C13NMR, DEPT) và 2 chiều (HMBC,HSQC), đo phổ khối lượng (MS).
2.2.2.3. Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất
Sắc kí lớp mỏng: TLC được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết dựa vào sự có mặt của vết duy nhất hoặc vết chính là vết của đối tượng phân tích. Chất càng tinh khiết khi không có vết phụ hoặc vết phụ càng nhỏ.
30
Quét nhiệt vi sai: Sử dụng thiết bị DSC (Differential Scanning Calorimetry) để xác định thông số nhiệt lượng, qua đó đánh giá mức độ tinh khiết của chất chuẩn.
Sắc kí lỏng hiệu năng cao: Sử dụng HPLC để xác định cụ thể số lượng tạp chất và tính gần đúng tỉ lệ tạp chất dựa trên tỉ lệ phần trăm diện tích pic.
Sắc kí lỏng – khối phổ : Đánh gái độ tinh khiết dựa vào sự có mặt của số lượng và tỷ lệ tín hiệu của các mảnh ion khi chạy ở chế độ ESI- negative
2.2.2.4.Thiết lập chất chuẩn và xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất chuẩn
2.2.2.4.1. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng
Xây dựng chỉ tiêu chất lượng:
Căn cứ vào tính chất lí – hóa của nguyên liệu thiết lập chuẩn và các CTCL thông thường của CCĐC sơ cấp để xây dựng các CTCL của CCĐC cần thiết lập.
Xây dựng phương pháp đánh giá:
Tham khảo DĐVN và các dược điển quốc tế để lựa chọn phương pháp phù hợp đánh giá các CTCL.
Khảo sát lựa chọn chương trình sắc kí thích hợp để định lượng và xác định tạp chất.
Dựa trên công thức phân tử và cấu trúc hóa học của các hợp chất chiết xuất từ dược liệu để tìm các các điều kiện sắc kí phù hợp như: Bản chất pha tĩnh, thành phần pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dòng pha động, thể tích tiêm mẫu, nồng độ dung dịch thử, dung môi pha mẫu.
Thẩm định phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu: - Tính đặc hiệu (Specificity)
- Độ tuyến tính và khoảng nồng độ tuyến tính (Linearity and range) - Độ chính xác (Precision)
- Độ đúng (Accuracy): Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn và tính thông qua tỷ lệ thu hồi:
Hàm lượng tìm thấy
Tỷ lệ thu hồi (%) = x 100 Hàm lượng thực cho vào
31
- Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ - Sự phù hợp của hệ thống sắc kí (System suitability) 2.2.2.4.2 Nghiên cứu các điều kiện tiến hành xây dựng phương pháp
Khảo sát điều kiện sắc ký
Chọn bước sóng phát hiện, chọn cột, chọn pha động, tốc độ dòng thích hợp để có pic Captopril cân đối và thời gian lưu hợp lý.
Chúng tôi tiến hành khảo sát trên cột C18 (250mm x 4,6mm, 5µm) là những cột thường dùng trong các cơ sở kiểm nghiệm hiện nay. Tiến hành khảo sát các điều kiện khác để chọn chương trình sắc ký phù hợp.
Lựa chọn dung môi hòa tan Captopril Disulfid hoàn toàn từ mẫu đã tinh chế:
Dựa vào tính chất của Captopril và qua tham khảo tài liệu, bằng thực nghiệm chọn ra dung môi thích hợp để hòa tan Captopril và đảm bảo Captopril không bị thủy phân.
2.2.2.4.3. Xây dựng, đánh giá phương pháp định lượng Captopril Disulfid trong mẫu đã bán tổng hợp và tinh chế
Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Xây dựng phương pháp định lượng
Đánh giá phương pháp xây dựng bằng các tiêu chí
Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ Captopril Disulfidvà diện tích pic trên sắc ký đồ
Tính chính xác của phương pháp:
- Độ lặp lại của phương pháp - Tính đúng của phương pháp
Tính đặc hiệu của phương pháp
2.2.2.4.4. Áp dụng phương pháp xây dựng định lượng Captopril Disulfid trong mẫu đã bán tổng hợp và tinh chế
Áp dụng phương pháp xây dựng tiến hành định lượng Captopril Disulfid trong mẫu đã tinh chế
32
Tiến hành sắc ký theo chương trình đã chọn trên các mẫu thử, song song với mẫu chuẩn.
Trong khoảng tuyến tính, nồng độ chất phân tích tỷ lệ thuận với diện tích pic trên sắc ký đồ. So sánh diện tích mẫu chuẩn và mẫu thử để định lượng chất thử trong dung dịch phân tích, từ đó tính ra hàm lượng chất thử trong mẫu cần định lượng.