Disulfid trong mẫu đã tổng hợp được
Áp dụng phương pháp vừa xây dựng, chúng tôi tiến hành định lượng Captopril Disulfid trong Captopril Disulfid đã tổng hợp được
Sử dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng Captopril Disulfid trong mẫu đã tổng hợp, dùng chất chẩn gốc là Captopril Disulfid hàm lượng 100,0 % do EDQM để pha dung dịch chuẩn gốc. Tiến hành định lượng 6 lần. Kết quả định lượng Captopril Disulfid được trình bảy ở bảng 3.17
61
Bảng 3.17: Kết quả định lượng Captopril Disulfid trong mẫu tổng hợp STT Khối lượng
cân (mg) Diện tích pic (mAU*min)
Hàm lượng Captopril trong nguyên liệu (%)
1 7.12 496.58 99.17 2 5.11 345.52 99.25 3 6.17 424.94 99.15 4 4.16 273.98 99.28 5 5.65 386.04 99.21 6 6.25 431.67 99.30 Chuẩn 5.43 372.72 100% 371.85 373.15 Trung bình xtb =99,22% S = 0.06 RSD = 0,06(%) ∆x = 0.053 ɛ = 0,053(%)
Từ các kết quả khảo sát chúng tối thấy : các mẫu chất chuẩn đạt tiêu chuẩn về hàm lượng qui định (nằm trong khoảng 98,0% đến 101,5%)
Khoảng tin cậy của hàm lượng chất đối chiếu là 99.167% → 99.273% Pic Captopril Disulfid trên sắc ký đồ cao, cân xứng, tách hoàn toàn với các pic tạp .
62
CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN
4.1 VỀ VIỆC LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng lựa chọn thiết lập chất chuẩn đối chiếu là Captopril Disulfid, đây là 1 tạp chất có trong các chế phẩm có chứa Captopril, đồng thời Captopril Disulfid là 1 tạp chất độc, có khả năng gây quái thai. Nhưng tại Việt Nam hiện nay chưa có chất chuẩn này để xác định và quy định về giới hạn của Captopril Disulfid có trong các chế phẩm chứa Captopril.
Vì vậy, kết quả của nghiên cứu có thể tiếp tục được sử dụng để nghiên cứu và nâng cao chỉ tiêu chất lượng của các chế phẩm thuốc .
4.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐÃ SỬ DỤNG 4.2.1 Các phương pháp tổng hợp
Với các phương pháp tổng hợp Captopril Disulfid thì gần như không có. Tháng 10/2014 thì trường Đại học Y dược TP Hồ chí Minh và đại học y dược Cần thơ đã công bố phương pháp tổng hợp Captopril Disulfid từ Captopril và đã được công bố trên tạp chí y-dược học tháng 10/2014 [7]. Các nhà nghiên cứu ở hai trường đại học này đã sử dụng phương pháp oxy hóa bởi H2O230%. Nước oxy già 30% là 1 chất oxy hóa mạnh có thể tạo các sản phẩm có bậc oxy hóa cao hơn. Đồng thời quá trình này diễn ra tương đối chậm nên tạo điều kiện không thuận lợi cho sản phẩm tạo thành là Captopril Disulfid tiếp xúc với oxy già tạo thành các sản phẩm phụ khác. Mặt khác, nước oxy già 30% là 1 hóa chất không bền dễ dàng bị ảnh hưởng bởi các điều kiện bên ngoài như: nhiệt độ, ion kim loại nặng… Và pH sử dụng cho phản ứng là pH =3,4, làm cho lượng Captopril tồn tại nhiều ở dạng ion tan tốt trong nước nên dẫn tới giảm hiệu suất phản ứng và giảm độ tinh khiết của sản phẩm. Mặt khác: ở công trình nghiên cứu này, tác giải mới đưa ra được xác định độ tinh khiết bằng HPLC, vẫn có khả năng chưa tách hết tạp chất
63
khác và chưa xác định được hàm lượng Captopril Disulfide có trong mẫu đã tổng hợp
Có nhiều bài báo khoa học đã công bố về chuyển hóa của Captopril, trong đó có tạo thành Captopril Disulfid. Tuy nhiên đã số đều tiến hành ở mức nồng độ thấp để xem các sản phẩm có thể tạo thành, không có bài báo nào đưa được ra sản phẩm dưới dạng thô và tinh khiết. Đa số các nghiên cứu đều tạo ra nhiều sản phẩm, nhưng chỉ có sử dụng Na2S4O6 thì chỉ tạo ra liên kết Disulfid nhưng điều kiện áp dụng lại tương đối khó khăn với Captopril vì pH phản ứng là pH = 7,0, nhưng độ bền liên kết amid cùa Captopril là pH từ 4- 5. Chính vì vậy khó khăn cho phương pháp tổng hợp.
4.2.2 Các phương pháp tinh chế
Phương pháp tinh chế với đa số các hợp chất tổng hợp là sử dụng hòa tan trong Aceton và sau đó kết tinh phân đoạn lại để thu được chất tinh khiết. Nhưng các nhà nghiên cứu ở hai trường đại học Y dược TPHCM và y dược Cần Thơ đã sử dụng MeOH để tinh chế. Với tinh chế bằng MeOH thì cần sử dụng cất bay hơi ở áp suất thấp vì khả năng bay hơi của MeOH kém hơn Aceton.
4.3 QUY TRÌNH TỔNG HỢP VÀ TINH CHẾ 4.3.1 Bán tổng hợp
Với nguyên liệu ban đầu dùng để bán tổng hợp Captopril Disulfid là Captopril thì có nhiều bài báo công bố là dùng các chất oxy hóa khác nhau để tạo thành Captopril Disulfid nhưng đều ở dạng hóa tan trong dung dịch và đo trong dung dich. Chỉ di nhất có 1 nghiên cứu đã công bố (tài liệu [7]) của Đại học Y dược Hồ Chí Minh và Đại học Y dược Cần thơ là sản phẩm thu được dưới dạng bột. Tuy nhiên, trong giai đoạn nghiên cứu và khảo sát chúng tôi quyết định sử dụng Iod để làm chất oxy hóa vì lí do: phản ứng diễn ra với tốc độ phản ứng cao, khống chế được sản phẩm tạo thành, tăng độ ổn định cho chế phẩm.
64
4.3.2 Tinh chế
Quá trình tinh chế bắt buộc phải có giai đoạn rửa sản phẩm sau khi phản ứng bằng 20 ml nước lạnh nhằm mục đích hòa tan và lôi cuốn hết các hợp chất tan trong nước, cũng như các sản phẩm oxy hóa tan trong nước nếu có. Phải rửa bằng nước lạnh nhằm mục đích để giảm thiểu tối đa lượng Captopril Disulfid bị hòa tan. Giai đoạn tái hòa tan lại nhằm mục đích chuyển hết tất cả sản phẩm sang dạng dung dịch bởi vì sản phẩm sau khi tỏng hợp tủa xuất có ngậm nước, dùng cất quay áp suất thấp để kéo hết nước ra ngoài. Bởi vì nước có liên quan đến phẩn ứng thủy phân liên kết disulfid trong môi trường acid mà Captopril Disuld là 1 acid yếu.
Giai đoạn sấy khô ở 27oC là làm cho lượng MeOH còn lại trong chế phẩm bay hơi hết.
4.4 BỘ DỮ LIỆU NHẬN DẠNG VÀ ĐỘ TINH KHIẾT CỦA HỢP CHẤT 4.4.1. Về bộ dữ liệu đo phổ
Hợp chất là đối tượng nghiên cứu trong đề tài là hợp chất đã biết, tuy nhiên các dữ liệu phổ khó có thể tìm thấy trong thư viện phổ. Vi vậy, luận văn đã tiến hành xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất, bao gồm dữ liệu phổ, đo điểm chảy bằng chính nguyên liệu thu được sau quá trình chiết xuất, phân lập, tinh chế. Kết quả nghiên cứu đã khẳng định hợp chất được sử dụng làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn đối chiếu đã được mô tả đặc tính một cách đầy đủ, đáp ứng yêu cầu của WHO và ASEAN về thiết lập chất chuẩn đối chiếu
4.4.2. Về độ tinh khiết xác định bằng kỹ thuật quét nhiệt vi sai (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
DSC là kĩ thuật phân tích không phải sử dụng đến chất đối chiếu, vì vậy có giá trị tham khảo tốt bên cạnh giá trị ấn định của chất chuẩn thiết lập được khi sử dụng kĩ thuật định lượng bằng HPLC. Phương pháp này rất được khuyến khích sử dụng trong nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu. Các nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước trước đây về hợp chất này đều chưa tiến hành xác định độ tinh khiết của chất bằng DSC. Kết quả xác định độ tinh khiết bằng DSC đã được xem xét để xây dựng chỉ tiêu chất lượng cho các chất chuẩn đối chiếu. Kết quả này có sự phù hợp với kết quả định lượng và xác định tạp chất liên quan: Captopril Disulfid đạt độ tinh khiết cao 99,25%.
65
4.5 ỨNG DỤNG CHẤT CHUẨN
Cho đến nay, cục quản lý dược Việt Nam đã cấp số đăng ký cho rất nhiều mặt hàng như nguyên liệu, viên nén có hoạt chất là Captopril của các cơ sở sản xuất trong nước và nước ngoài. Tuy nhiên, Cục chưa ban hành quy định về hàm lượng tạp chất liên quan có trong nguyên liệu cũng như trong viên nén Captopril. Mặt khác Captopril Disulfid là một chất có khả năng gây quái thai. Chính vì vậy cần phải có chất chuẩn Captopril Disulfid để định lượng và xác định chính xác sự có mặt của chất này trong nguyên liệu cũng như trong chế phẩm. Ngoài ra, khi đã thiết lập được chất chuẩn Captopril Disulfid thì có thể xây dựng được quy trình thẩm định Captopril Disulfid có trong huyết tương của người bệnh. Lúc đó sẽ đánh giá được mức độ chuyển hóa của cơ thể người bệnh với Captopril và đưa ra được lời khuyên với bác sỹ khi sử dụng các chế phẩm có chứa Captopril.
66
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT I. KẾT LUẬN
1. Xây dựng quy trình bán tổng hợp và tinh chế
Đã khảo sát đầy đủ và xây dựng quy trình bán tổng hợp và tinh chế được hợp chất là Captopril Disulfid đáp ứng đủ điều kiện đề làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn đối chiếu.
2. Thiết lập chất chuẩn đối chiếu
Đã xây dựng được bộ dữ liệu nhận dạng chất: Phổ IR, phổ MS, phổ NMR, điểm chảy và xác định được độ tinh khiết của hợp chất bằng phương pháp đo quét nhiệt vi sai. Kết quả độ tinh khiết của Captopril Disulfid là 99,25%. Đánh giá được hàm lượng của chất chuẩn đối chiếu
II. ĐỀ XUẤT
1. Tiếp tục nghiên cứu độ ổn định của chất chuẩn đối chiếu làm cơ sở cho việc cải tiến qui trình chiết xuất, phân lập, tinh chế đã xây dựng, để tạo ra nguồn nguyên liệu thiết lập chuẩn có độ tinh khiết cao.
2. Bổ sung các chất chuẩn đối chiếu trên vào Dược điển Việt Nam và nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu có hoạt chất tương ứng trong các chuyên luận của Dược điển Việt Nam.
1
Tài liệu tham khảo
Tiếng Việt
1. PGS.TS Trần Tử An, PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu, Hóa Phân Tích 2, Nhà xuất bản Y học, trang 168 – 200.
2. Bộ Y tế, Dược điển việt nam 4, Phụ lục 12.13, 12.16, 10.3 3. Bộ Y Tế, Dược thư Việt Nam, 2006, trang 142 - 144
4. Bộ Y Tế (2007), Kiểm nghiêm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, trang 84 – 110
5. GS.TS. Trần Mạnh Bình, PGS.TS. Nguyễn Quang Đạt, Hóa học hữu cơ - tập 1, Trường Đại Học Dược Hà Nội, trang 115 - 130
6. PGS.TS Trần Đức Hậu (2006), Hóa dược tập 1, Trường Đại học Dược Hà Nội, trang 68 – 69
7. Lữ Thiện Phúc, Nguyễn Tấn Đạt, Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn, Đặng Văn Tịnh, Tổng hợp và xác định độ tinh khiết Captopril Disulfid, công bố 10/2014
8. PGS.TS Mai Tất Tố, TS Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học tập II, Nhà xuất bản Y học, trang 26-28
9. Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương ,Khoa Thiết lập Chất chuẩn - Chất đối chiếu, 2013. Danh sách chuẩn cập nhật 30-8-2013. http://nidqc.org.vn/chat-chuan-chat-doi-chieu/334-danh-sach-
chuan-cap-nhat-30-8-2013.html, truy cập ngày 01/09/2013.
10. Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương, Quy trình thiết lập chất chuẩn – 2006 11. Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương, Phân loại chất chuẩn, 2006
Tiếng Anh
12. Australian Pharmaceutical Formulary and Handbook 21, p.11, p.91, p.324, p.473
13. Anthony C, Moffat,M David Osselton, Brian Widdop, Clarke's Analysis of Drugs and Poisons 4th, p.1038 – p.1039
14. Analytical profiles of drug substances,volume 11, Captopril, page 79 -138. 15. Ayman A. Gouda a,*, Alaa S. Amin b, Copper(II)–neocuproine reagent for spectrophotometric determination of captopril in pure form and pharmaceutical formulations, ngày công bố 14/4/2010 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
16. Alice Chanakira, Edward Chikwana, David H.Peyton, and Reuben H.Simoyi, Oxyhalogen-sulfur chemistry – Kinetics and mechanism of the oxidation of cysteamine by acid iodate and iodine, ngày công bố 25/2/2006 17. Bristish pharmacopoeia (2009) volume I&II, p.1020 – p.1022.
18. Bristish pharmacopoedia chemical reference substance, Material safety dara sheet - Captopril Disulfide, ngày 6/5/2010
19. Chromatographia, volume 55, issue 9, p.565 – p.571.
20. DALLASL RABENSTEINAN, D YVONT HERIAULT, A nuclear magnetic resonance study of the formation and conformational equilibria of symmetrical and mixed disulfides of captopril, ngày công bố 8/3/1984 21. Disulfide Bond Identification of HR 1294, Mass spectrometry facility
CABM
22. European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare,
CAPTOPRIL International Chemical Reference Substance Batch 1
23. European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare,
CAPTOPRIL DISULFIDE International Chemical Reference Substance Control
24. Edward J.Calabrese, Hormetic Dose-Respone Relationships in Immunology: Occurrence, Quantitative Features of the Dose Response, Mechanistic Foundations, and Clinical Implications, năm công bố 2005
2
25. G. P. Kapungu and G. Rukweza, Oxyhalogen−Sulfur Chemistry: Kinetics and Mechanism of Oxidation of Captopril by Acidified Bromate and Aqueous Bromine, ngày công bố 14/02/2013
26. Girish G Ariga, Amruta Mutalikdesai, Deepti Jog, Manjula Kirgi, Shatanappa T Nandibewoor & Shivamurti A Chimatadar, Oxidation of Captopril by hexacyanoferrate (III) in a queous hydrocloric acid medium – a kinetic and mechanistic study, ngày công bố 27/1/2014
27. A. Khazaei, M. A. Zolfigol, A. Rostami, Synthesis, 2004, 2959-2961 28. Krishna K.Verma, Titrimetric determination of thiols: Tetrathionate,
iron(III), cystine and hexacyanoferrate (III) as thiol reagents, ngày công bố 16/10/19978
29. Kamenosuke Shinohara, oxidation of cystein by iodine in aqueous medium, ngày công bố 16/11/1931
30. Gordon J.King, Alun Jones, Nostjan Kobe, Thomas Huber, Dimitri Mouradov, David A.Hume, and lan L.Ross, Identification of Disulfide- Containing Chemical Cross-Links in Proteins Using MALDI-TOF/TOF- Mass Spectrometry, ngày công bố 30/5/2008
31. Mauro Lo Conte and Kate S.Caroll, The Chemistry of Thiol oxidation and detection
32. M. Kirihara, Y. Asai, S. Ogawa, T. Noguchi, A. Hatano ,Y. Hirai ,
Synthesis, 2007, 3286-3289
33. Martindale Thirty-six edited by Sean C Sweetman, p1239 – p.1240. 34. Mass Spectrometry edited by Jurgen H.Gross, p 441 – 474
35. B. H. Migdalof, S. M. Singhvi, & K. J. Kripalani, THIN-LAYER RADIOMROMATOGRAPHIC DETERMINATION OF CAPTOPRIL(SQ 14,225) AND ITS DISULFIDE DIMER METABOLITE IN BLOOD, ngày công bố 5/12/2006
3
36. Paul K. Owens *, Lars A. Svensson, Jo¨rgen Vessman, Direct separation of captopril diastereoisomers includingtheir rotational isomers by RP-LC using a teicoplanin column, ngày công bố 21/10/2010
37. Rana N. Zahdeh, Ribhi A. Zaru, Hamdallah A. Hodali, Kinetics of oxidation of cysteine and captopril via Cs3[Mo(CN)8] and Cs3[W(CN)8], ngày công bố 13/2/2007
38. Seema S. Badi, Suresh M. Tuwar, Kinetics and Mechanism of Oxidation of Captoprilby Hexacyanoferrate(III) in Aqueous Acidic Medium, ngày công bố 16/02/2013
39. R. Sanz, R. Aguado, M. R. Pedrosa, F. Arnáiz, Synthesis, 2002, 856-858 40. Takashi Nishikawa, Reiko Abe, Yumiko Sudo, Asako yamada, and
Kayoko Tahara, HPLC profile of captopril disulfide that undergoes reversible cis-trans conversion among three isomers, ngày công bố 8/8/2004
41. USP MC, Captopril Summary Validation Report, 31/5/2013 42. USP, Safe Data Sheet - Captopril Disulfide
43. Vinayak Gupta, Kate S.Caroll, Sulfenic acid chemistry, detection and cellular lifetime, ngày công bố 6/6/2013 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
44. Vivekananda M.Vrudhula,*,+ John F. Macmaster, Zhengong Li, David E.Kerr and Peter D.Senter, Reductively Activated Disulfide Prodrugs of Paclitaxel, ngày công bố 11/12/2002
45. Wiliam J.Rea, Kalpana Patel, Reversibility of Chronic Degenerative Disease and Hypersensitivity (Regulating Mechanisms of Chemical Sensitivity) – Volume 1 – Pharmacological Agents that Induce Immune- System-Related Hormetic-like Biphasic Dose Responeses, page 339 46. Yuri Karakevich & Rosario Lobrutto, HPLC for Pharmaceutical Scientists
(2007), p.139 – p.188 & p.75 – p.132.
47.Ying Wang and James H. Espenson, Oxidation of Symmetric Disulfides with Hydrogen Peroxide Catalyzed by Methyltrioxorhenium(VII), ngày công bố 12/7/1999.
4
5
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
Phụ lục 1 Quy trình tổng hợp và tinh chế Captopril Disulfid Phụ lục 2 Bộ dữ liệu phổ chuẩn của Capropril Disulfid
Phụ lục 3 Sắc ký đồ của xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Captopril Disulfid
6
PHỤ LỤC 1
QUY TRÌNH TỔNG HỢP VÀ TINH CHẾ CAPTOPRIL DISULFID
7
PHỤ LỤC 2
BỘ DỮ LIỆU PHỔ CHUẨN CỦA CAPTOPRIL DISULFID (1)PHỔ HỒNG NGOẠI – IR
(2)PHỔ KHỐI
2
3
4
2
2
2
3
4
5
6
PHỤ LỤC 3
SẮC KÝ ĐỒ CỦA XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH