1.7.4.1.Lựa chọn pha tĩnh cho HPLC
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của một hỗn hợp nhiều chất. Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động sắc ký được chia thành 2 loại :
Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân tích thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực.
Sắc ký pha đảo: pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích thường là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực .
Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền Silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon. Trong sắc ký hấp phụ pha đảo: pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất.
Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc Siloxan:
R là các nhóm phân cực (ưa nước): nhóm OH hoặc các alkylamin –CH2- NH2, alkyl nitril – CH2 – CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha thuận để phân tích các chất ít hoặc không phân cực.
Với R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế bàng cách alkyl hóa các nhóm OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl-R của mạch carbon (C2;C8;C18) hay các gốc carbon vòng phenyl. Do các nhóm OH thân nước được thay thế bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực.
22
Silica đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion.
Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn những nhóm –OH gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy theo môi trường pH phân tích.
Trong môi trường quá acid pH< 2 thì có sự phân ly các nhóm ether ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không thể tương tác với cột.
Trong môi trường Base (pH>7), các nhóm –OH trong cột sẽ tương tác với chất tan có tính base. Tương tác này khác với kiểu tương tác của chất tan với nhóm –Si-C18, dẫn đến hiện tượng cùng một chất nhưng sẽ có những đỉnh ra khác nhau hay là hiện tượng kéo đuôi. Kết quả giảm đi độ chính xác.
Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các hợp chất như trimethylclorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexametyldisizan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này. Cấu trúc pha liên kết được trình bày ở hình 1.2
Hình 1.5: Cấu trúc cột LC-DB
Có một cách khác để loại trừ bớt sự ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che chắn đi những nhóm –OH, được trình bày ở hình 1.3.
23
Hình 1.5: Cấu trúc cột có gốc Isopropyl
Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của dây C18 làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh (Cột EPS – Expended Polar Selectivity)
1.7.4.2.Lựa chọn pha động cho HPLC
Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp. Trong sắc ký pha đảo, pha động là dung môi phân cực như: nước, methanol, acetonitril … hoặc hỗn hợp của chúng. Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ.
Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký như: độ chọn lọc α, thời gian lưu tR, độ phân giải Rs, độ rộng của đáy pic. Nên việc phân tích, lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng .
Yêu cầu của 1 pha động :
Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian.
Hòa tan chất cần phân tích .
Có độ tinh khiết cao.
Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký .
Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường.
Có các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả :
Bản chất của dung môi để pha pha động .
Thành phần các chất trong pha động .
24
Tốc độ dòng của pha động.
Chọn đệm – pH :
Trong sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính chất acid hoặc base thường phải sử dụng đệm ở pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký.
Tốc độ dòng của pha động :
Sau khi có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp, để tăng hiệu lực tách của quá trình phải chọn tốc độ pha động phù hợp, đảm bảo việc tách các chất phân tích được tốt nhất mà đạt hiệu quả cao về thời gian và kinh tế.
1.7.4.3. Lựa chọn Detector
Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ ghi nhận bởi Detector chuyển thành tín hiệu và được ghi trên sắc ký đồ. Detector phổ biến nhất là Detector UV- VIS. Tùy theo chất cần phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác nhau.