Tổng hợp và thiết lập tạp chuẩn captopril disulfid, 7 ADCA, d phenlyglycin, tạp d của amlodipin, tạp a và b của nifedipin dùng trong kiểm nghiệm thuốc TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN VĂN MƯỜI TỔNG HỢP VÀ THIẾT LẬP TẠP CHUẨN CAPTOPRIL DISULFID, 7-ADCA, D-PHENYLGLYCIN, TẠP D CỦA AMLODIPIN, TẠP A VÀ B CỦA NIFEDIPIN DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC MÃ SỐ: 62720410 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP HỒ CHÍ MINH, Năm 2021 Cơng trình hoàn thành tại: Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN PGS.TS ĐẶNG VĂN TỊNH Phản biện 1: ……………………………………………… Phản biện ……………………………………………… Phản biện 3: ……………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp vào hồi ngày tháng Có thể tìm hiểu Luận án thư viện: năm 24 Về ứng dụng kết nghiên cứu đánh giá tạp số mẫu thử GIỚI THIỆU LUẬN ÁN nguyên liệu thành phẩm thị trường Các quy trình kiểm tạp chất captopril, cephalexin, amlodipin nifedipin đạt yêu cầu tính phù hợp hệ thống Đã ứng dụng quy trình chất đối chiếu thiết lập để kiểm tra tạp tương ứng số mẫu thử nguyên liệu thành phẩm thị trường Ngoại trừ captopril có số mẫu có hàm lượng captopril disulfid vượt yêu cầu cho phép, mẫu cịn lại cephalexin, amlodipin nifedipin có hàm lượng tạp mức qui định ĐẶT VẤN ĐỀ Kiểm nghiệm tạp chất thuốc tiêu bắt buộc phải kiểm mà dược điển nước dược điển Việt Nam qui định Tuy nhiên, tạp chất chuẩn thuốc nói chung không đầy đủ hoạt chất thuốc Lĩnh vực tổng hợp, thiết lập phân tích tạp chất thuốc phát triển từ đầu thập niên 20 Vì vậy, nước ta, nghiên cứu tạp chuẩn thuốc lĩnh vực nhà khoa học tập trung; đồng thời nhà quản lý thúc đẩy nhằm giải khó khăn công tác kiểm nghiệm thuốc KIẾN NGHỊ Trong hướng nghiên cứu tiếp theo, đề tài cần thực nội dung: 1) 06 tạp chuẩn: captopril disulfid, 7-ADCA D-phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin đăng ký chất chuẩn quốc gia 2) Tiếp tục nghiên cứu độ ổn định tạp chất đối chiếu nhằm cải tiến quy trình tổng hợp, tinh chế xây dựng 3) Ứng dụng quy trình kiểm tra tạp captopril disulfid, 7-ADCA, Dphenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin mẫu nguyên liệu thành phẩm tương ứng khác lưu hành thị trường 4) Tăng cường kiểm tra, kiểm soát chất lượng thuốc, nguyên liệu lưu hành thị trường tiêu giới hạn tạp chất để đảm bảo chất lượng thuốc theo tiêu chuẩn đăng ký 5) Tiếp tục đầu tư trang thiết bị, sở vật chất phục vụ cho cơng tác điều chế, chuẩn hóa chất sử dụng làm chất chuẩn, đặc biệt tạp chuẩn để phục vụ nhu cầu sử dụng nước, hạn chế nhập từ nước Kháng sinh cephalexin thuốc tim mạch captopril, amlodipin, nifedipin đa số nhà máy nước sản xuất Tuy nhiên, nguồn cung cấp tạp chất đối chiếu khan Đề tài “Tổng hợp thiết lập tạp chuẩn captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A B nifedipin dùng kiểm nghiệm thuốc” thực với mục tiêu chính: Xây dựng quy trình tổng hợp tạp chất thuốc: captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin qui mơ phịng thí nghiệm Xây dựng thẩm định quy trình xác định độ tinh khiết tạp tổng hợp phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Thiết lập tạp chuẩn captopril disulfid, 7-ADCA, Dphenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin đạt yêu cầu chất đối chiếu quốc gia Xây dựng thẩm định qui trình định lượng tạp chất captopril disulfid nguyên liệu thành phẩm captopril phương pháp sắc ký lỏng 2 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Ứng dụng tạp chuẩn thiết lập kiểm nghiệm tạp KẾT LUẬN captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp Đề tài hoàn thành mục tiêu đề luận án, cụ thể sau: A tạp B nifedipin số nguyên liệu thành phẩm tương Về quy trình tổng hợp tạp chất: ứng lưu hành thị trường TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Kết nghiên cứu luận án đóng góp cho ngành Kiểm nghiệm thuốc quy trình tổng hợp tạp chất thuốc Các đóng góp giúp cho Hệ thống kiểm nghiệm thuốc nhà nước việc sản xuất, cung cấp chất đối chiếu tạp chất ổn định; sở kiểm nghiệm có đủ nguồn tạp chuẩn pháp lý để thực tiêu tạp chất liên quan Tiêu chuẩn chất lượng NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Các quy trình tổng hợp tạp chất - Tạp captopril disulfid: tối ưu hóa quy trình tổng hợp captopril disulfid với tác nhân H2O2 nội dung chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu nước - Tạp 7-ADCA D-phenylglycin: thủy phân cephalexin enzym PGA, enzym tái sử dụng nên ảnh hưởng mơi trường giảm giá thành ưu điểm so với tổng hợp hóa học - Tạp D: phthaloyl amlodipin lựa chọn để rút ngắn quy trình cịn giai đoạn, hạn chế sử dụng dung mơi, hóa chất độc hại - Tạp A nifedipin: việc oxy hóa vịng 1,4-dihydropyridin chất có khung tương tự, phương pháp chưa cơng bố Phương pháp phân tích: luận án đóng góp quy trình định lượng captopril disulfid nguyên liệu thành phẩm chứa HPLC Thiết lập tạp đối chiếu: đối tượng nghiên cứu luận án 7ADCA, D-phenylglycin, captopril disulfid, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin đạt yêu cầu chất đối chiếu quốc gia Đã tổng hợp xác định điều kiện tổng hợp cho hiệu suất cao tạp chất captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin, đồng thời xác định cấu trúc sản phẩm phương pháp phổ nghiệm (UV, IR, MS NMR) Độ tinh khiết xác định phương pháp HPLC, sản phẩm có độ tinh khiết cao dùng làm chất đối chiếu kiểm nghiệm Về xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết tạp tổng hợp: Đã xây dựng thẩm định đạt yêu cầu quy trình xác định độ tinh khiết captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin phương pháp HPLC Về thiết lập chất đối chiếu tạp tổng hợp: Đã đánh giá tạp 7-ADCA, D-phenylglycin, captopril disulfid, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin bao gồm tiêu tính chất, điểm chảy, định tính, hàm ẩm, độ tinh khiết, mức chất lượng tiêu phương pháp thử Tất chất tổng hợp đủ điều kiện đăng ký chuẩn quốc gia phục vụ cho công tác kiểm nghiệm, phù hợp yêu cầu, điều kiện kinh tế Việt Nam Về quy trình kiểm nghiệm captopril disulfid nguyên liệu thành phẩm chứa captopril: Đã xây dựng thẩm định đạt yêu cầu quy trình định lượng tạp captopril disulfid nguyên liệu thành phẩm captopril phương pháp sắc ký lỏng Quy trình có giới hạn phát thấp mức chất lượng cho phép theo DĐVN 22 Trong trình thử nghiệm, thời gian tiến hành sắc ký tạp A tạp B Các quy trình tổng hợp tạp chất sản phẩm tổng hợp từ kết nghiên cứu luận án Hội đồng đánh giá nghiệm thu Sở Khoa học Công nghệ Tp.HCM nghiệm thu kết (23/03/2016) Trong số có quy trình chất đối chiếu Viện Kiểm nghiệm thuốc TpHCM ứng dụng vào thực tế sản xuất, lưu thông chất đối chiếu quốc gia: captopril disulfid; tạp A tạp B nifedipin 60 phút, nhiên sắc ký đồ pic tạp A, tạp B tạp khác có thời gian lưu khoảng 10 phút, thời gian từ 10 phút tới 60 phút không phát pic lạ sắc ký đồ chiều chiều, việc tiến hành sắc ký với thời gian 15 phút phù hợp 4.3 ĐÁNH GIÁ VÀ THIẾT LẬP TẠP CHẤT ĐỐI CHIẾU Kết luận án cho thấy sản phẩm tổng hợp đủ điều kiện đăng ký chuẩn quốc gia, với độ tinh khiết sắc ký: Captopril disulfid (99,32%), D-phenylglycin (99,97%), Tạp A nifedipin (100%), 7-ADCA (99,42%), Tạp D amlodipin (99,62%), Tạp B nifedipin (99,75%) tính theo chế phẩm nguyên trạng BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN Luận án gồm 151 trang, nội dung tương ứng với số trang sau: Mở đầu: 2; Tổng quan: 33; Đối tượng - Phương pháp: 30; Kết nghiên cứu: 64; Bàn luận: 19; Kết luận Kiến nghị: Luận án có 57 Bảng biểu; 75 Hình ảnh minh họa; Sơ đồ; 81 tài liệu (gồm 18 TL tiếng Việt; 61 TL tiếng Anh; trang web) 103 Phụ lục 4.4 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL DISULFID TRONG NGUYÊN LIỆU, THÀNH PHẨM CHỨA CAPTOPRIL NỘI DUNG LUẬN ÁN Quy trình định lượng captopril disulfid nguyên liệu thành Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tạp chất captopril disulfid: sản phẩm phân hủy captopril tác động ánh sáng, oxy khơng khí; từ tính chất nghiên cứu đường tổng hợp 1.2 Tạp chất 7-ADCA D-phenylglycin: cephalexin bị nhiễm tạp từ nguyên liệu tổng hợp cephalexin Độc tính kích ứng đường hơ hấp, mắt, da hít nuốt phải 1.3 Tạp chất D amlodipin: hình thành amlodipin bị oxy hóa thành pyridin tác động ánh sáng trình bảo quản 1.4 Tạp chất A B nifedipin: nguyên nhân hình thành oxy hóa nifedipin Các chất gây độc người dùng nifedipin tiếp xúc với ánh sáng, gây đỏ rát mặt vùng da tiếp xúc 1.5 Phương pháp kiểm nghiệm giới hạn tạp chất nguyên liệu thành phẩm thuốc tương ứng 1.6 Chất đối chiếu: khái niệm qui định thiết lập chất đối chiếu phẩm chứa captopril tương tự quy trình xác định độ tinh khiết, thẩm định đạt yêu cầu Nội dung trình bày Mục 4.2.1 4.5 KIỂM TRA TẠP TRONG CÁC MẪU THỬ Điều kiện sắc ký để xác định độ tinh khiết captopril disulfid điều kiện định lượng tạp captopril disulfid nguyên liệu chế phẩm captopril Điều kiện phù hợp định lượng đồng thời hoạt chất captopril tạp chất captopril disulfid Điều thuận lợi công tác kiểm tra chất lượng chế phẩm Trong kiểm nghiệm nifedipin, lưu ý pha dung dịch thử trước dùng nifedipin dung dịch dễ bị hủy thành tạp A B 4 21 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4.2.2 Tạp 7-ADCA D-phenylglycin 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Kết định tính suất quay cực riêng khẳng định hợp Gồm chất hóa học tạp chất liên quan: chất tổng hợp phenylglycin D-phenylglycin, tiến hành xác định độ - Tạp captopril disulfid captopril - Tạp 7-ADCA cephalexin tinh khiết sản phẩm Quy trình xác định độ tinh khiết tạp - Tạp D-phenylglycin cephalexin - Tạp D amlodipin chất tổng hợp tham khảo theo chuyên luận cefalexin monohydrat - Tạp A nifedipin - Tạp B nifedipin BP 2019 phần tạp chất liên quan Việc xác định độ tinh khiết Nguyên vật liệu thử nghiệm TT Tên chất Captopril 7-ADCA D-phenylglycin Captopril Dehydronifedipin Dehydronitrosonifedipin Amlodipin D-amlodipin Nifedipin 10 Cephalexin 11 Amlodipin D-phenylglycin với tốc độ dịng ml/phút chương trình gradient Nguồn gốc Viện KNT Tp HCM EP Sigma C.Pharmaceutical USP USP Viện KNT Tp.HCM LGC Viện KNT Tp.HCM Lupin Ercros Tinh khiết 99,1% 99,5% 99,0% 100,6% 99,5% 99,5% 100,0% 91,5% 99,5% 99,5% 99,5% với bước sóng cài đặt 220 nm, D-phenylglycin tách hồn tồn 7ADCA bước sóng 7-ADCA hấp thu nên diện tích pic khơng ảnh hưởng đến độ tinh khiết tạp chất D-phenylglycin Việc xác định độ tinh khiết 7-ADCA theo điều kiện sắc ký với Dphenylglycin thay đổi tốc độ dịng ml/phút nhằm mục đích xác định hợp chất có độ tinh khiết theo phần trăm diện tích pic tốc độ dịng D-phenylglycin bị rửa giải nhanh khỏi cột 4.2.3 Tạp D amlodipin Quy trình xác định độ tinh khiết tạp D amlodipin tham khảo USP 43, việc thay đổi chiều dài cột (250 x 4,6 mm) so với USP 43 (150 x 3,9 mm) Quy trình đạt tất yêu cầu thẩm định 4.2.4 Tạp A tạp B nifedipin 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Quy trình xác định độ tinh khiết hai tạp A tạp B nifedipin 2.2.1 Tổng hợp tinh chế tạp chất HPLC - PDA đơn giản, thời gian lưu pic tạp A từ 5,9 tới 6,2 phút 2.2.1.1 Tạp captopril disulfid captopril thời gian lưu pic tạp B từ 7,2 8,0 phút, hệ dung mơi Captopril disulfid: oxy hóa captopril với tác nhân H2O2 Sản phẩm acetonitril – nước, không cần thêm đệm hay phải điều chỉnh pH giúp tinh chế phương pháp kết tinh nóng với methanol – nước rửa hệ thống sắc ký nhanh an toàn cho hệ thống, cột sắc ký 2.2.1.2 Tạp D amlodipin Đối với tạp B nifedipin, sắc ký đồ thường xuất pic tạp Tạp D amlodipin tổng hợp qua giai đoạn: tạp B bị oxy hóa tạo tạp A dạng dung dịch, mẫu để định lượng tạp B phải pha trước định lượng 20 Tinh chế tạp A kỹ thuật sắc ký cột với dung môi ethyl acetat - n- - Tổng hợp 3-ethyl 5-methyl 2-[(2-(phthalimido)ethoxy)]-4-(2- hexan (2 : 8), thời gian thử nghiệm dài hiệu tách cao clorophenyl)-6-methylpyridin-3,5-dicarboxylat qua q trình oxy hóa Tinh chế tạp B sắc ký cột cần thận trọng cơng thức có nhóm phthaloyl amlodipin tinh chế hỗn hợp aceton – nước (2 : 1) nitroso gắn vào vòng thơm, nhóm bị oxy hóa nên hạn chế - Tổng hợp tạp D từ sản phẩm trung gian: thủy phân 3-ethyl 5-methyl việc tiếp xúc với khơng khí chất có tính oxy hóa Cần loại oxy 2-[(2-(phthalimido)ethoxy)]-4-(2-clorophenyl)-6-methylpyridin-3,5- trình sắc ký bay dung mơi dịng khí argon dicarboxylat với chất xúc tác hydrazin Sản phẩm tinh chế 4.2 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT TẠP CHẤT BẰNG HPLC qua dạng muối với acid hydrocloric, chuyển dạng kiềm với natri 4.2.1 Tạp captopril disulfid hydroxyd, dạng kiềm chiết dicloromethan Điều kiện nhiệt độ ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu cột, hệ số đối xứng o o 2.2.1.3 Tạp 7-ADCA D-phenylglycin cephalexin không đạt nhiệt độ cột < 40 C Khi tăng nhiệt độ lên 50 - 60 C, Tạp 7-ADCA D-phenylglycin: thủy phân cephalexin enzym As pic captopril disulfid cải thiện Khi nhiệt độ tăng, độ nhớt pha PGA Các sản phẩm tổng hợp tinh chế kỹ thuật HPLC điều động giảm nên giảm thời gian rửa giải, dẫn đến chiều rộng pic hẹp chế cột C18, pha động methanol – nước Ngoài nhiệt độ cao làm giảm tượng chuyển khối, dẫn đến 2.2.1.4 Tạp A nifedipin hiệu cột tăng theo phương trình Van Deemter Tuy nhiên nhiệt Tạp A nifedipin: oxy hóa nifedipin với acid nitric Sản phẩm tinh độ không nên > 60 oC làm bay pha động phân hủy mẫu chế sắc ký cột kết tinh lại aceton – nước o Trong nghiên cứu này, nhiệt độ 50 C phù hợp Pha động acetonitril 2.2.1.5 Tạp B nifedipin acid phosphoric với pH 2, không cần sử dụng đệm nên thời gian rửa Tạp B tổng hợp cách chiếu tia UVA nifedipin Sản phẩm hệ thống nhanh, không gây ăn mịn muối kết tủa Ngồi pH tinh chế kỹ thuật sắc ký cột này, hiệu cột sắc ký thích hợp pH từ đến 13 cột C18 2.2.2 Xác định cấu trúc sản phẩm tổng hợp Thời gian lưu pic captopril captopril disulfid phút, Cấu trúc sản phẩm tổng hợp xác định phương pháp đồng thời xuất pic tạp trình tổng hợp khoảng phút, đối chiếu liệu phổ UV–Vis; IR; MS NMR với liệu có khả sản phẩm phụ q trình tổng hợp captopril cơng bố tài liệu khoa học uy tín disulfid Khi tiến hành sắc ký với thời gian đến 60 phút không thấy 2.2.3 Xây dựng thẩm định quy trình xác định độ tinh khiết xuất pic lạ khác xem sắc ký đồ không gian chiều tạp tổng hợp phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao không phát pic tạp khác Tất đánh giá 2.2.3.1 Chuẩn bị mẫu khảo sát điều kiện sắc ký chứng tỏ thành phần sản phẩm tổng hợp sau tinh chế Khảo sát nồng độ mẫu điều kiện sắc ký để tách hoàn toàn pic rửa giải tiến hành sắc ký nên độ tinh khiết sản phẩm tính cần phân tích với pic lân cận có thành phần mẫu, đạt tất theo phương pháp phần trăm diện tích pic đạt 99% tin cậy thơng số sắc ký cho quy trình phân tích định lượng 6 19 2.2.3.2 Thẩm định quy trình 4.1.2 Tổng hợp tinh chế 7-ADCA D-phenylglycin Sau thử nghiệm tính phù hợp hệ thống, quy trình xác định độ tinh khiết Enzym penicillin G acylase (PGA) xúc tác phản ứng tổng hợp tạp tổng hợp thẩm định theo hướng dẫn ICH cephalexin từ D-phenylglycin 7-ADCA Enzym tham gia 2.2.4 Đánh giá thiết lập tạp chất đối chiếu trình thủy giải nhóm N-acyl lại sản phẩm ban đầu Tuy 2.2.4.1 Xây dựng phương pháp đánh giá tạp tổng hợp nhiên, PGA có giá thành cao, khó bảo quản, vận chuyển khơng thể - Tính chất cảm quan: quan sát cảm quan hình dạng, màu, mùi tái sử dụng Một sản phẩm từ công nghệ enzym việc cố định độ tan mẫu thử hóa enzym phức hợp polymer giúp giải trở ngại - Điểm chảy: xác định điểm chảy thiết bị đo điểm chảy Sản phẩm thu dễ tinh chế, có độ tinh khiết cao đáp ứng yêu - Định tính: phổ hồng ngoại, phổ khối phổ NMR cầu làm chất chuẩn Điểm quan trọng sau xúc tác phản ứng, có - Giảm khối lượng sấy khơ: phân tích nhiệt trọng lượng thể tách loại enzym dễ dàng cách lọc thu hồi tái sử dụng - Độ tinh khiết hàm lượng: phương pháp sắc ký lỏng nhiều lần Đây điểm trội so với việc tổng hợp 2.2.4.2 Thiết lập chất đối chiếu đường hóa học, đồng thời làm giảm giá thành sản phẩm Các công đoạn thiết lập tạp đối chiếu bao gồm: tổng hợp Nghiên cứu hứa hẹn khả tổng hợp tạp - Đóng gói: Glove-box: khí nitơ 99,99%, độ ẩm tương đối 40% chất kháng sinh nhóm cephalosporin - Đánh giá độ đồng trình đóng lọ: theo ISO Guide 35 4.1.3 Tổng hợp tinh chế tạp D amlodipin - Đánh giá độ đồng lọ liên phịng thí nghiệm: theo ISO 13528 Tạp chất D amlodipin dạng dầu màu vàng nâu dễ bị oxy - Xác định giá trị ấn định – giá trị công bố: theo ISO 13528 hóa ngồi khơng khí khó bảo quản sau tinh chế Vì 2.2.5 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng tạp captopril phương pháp tinh chế sản phẩm cách tạo muối với HCl đơn giản, disulfid nguyên liệu chế phẩm chứa captopril tốn thời gian, áp dụng với lượng sản phẩm lớn Pha chế dung dịch mẫu thử: 4.1.4 Tổng hợp tinh chế tạp A B nifedipin - Dung dịch chuẩn gốc captopril disulfid: 0,1 mg/ml methanol Trong trình tổng hợp tạp A nifedipin cần ý tới lượng HNO3 - Mẫu chuẩn (1): captopril 1000 captopril disulfid 10 (ppm) cho vào phản ứng thời gian phản ứng, nên dừng phản ứng sớm để - Mẫu chuẩn (2): captopril 1000 captopril disulfid 20 (ppm) tránh việc tạo nhiều tạp gây khó khăn cho trình tinh chế Sau - Mẫu thử: nguyên liệu/chế phẩm captopril mg/ml methanol tổng hợp tạp A nifedipin, việc loại bỏ HNO3 nên rửa - Mẫu thử giả lập: hỗn hợp nguyên liệu/chế phẩm captopril mg/ml; nước cất, không nên rửa nước có tính base gây biến đổi cấu 0,01 mg/ml captopril disulfid với mẫu giả lập nguyên liệu/hoặc 0,02 trúc tạp A, tạo chất có màu đỏ mg/ml tạp captopril disulfid với mẫu giả lập chế phẩm Để tổng hợp tạp B nifedipin sử dụng đèn UVA công suất lớn - Mẫu giả dược: tương đương mg/ml captopril methanol để có thời gian phản ứng rút ngắn 18 Bảng 3.10 Kết kiểm tra tạp D amlodipin số nguyên Khảo sát điều kiện sắc ký: từ điều kiện sắc ký thử nghiệm xác liệu chế phẩm thị trường (n = 6) định độ tinh khiết captopril disulfid, tiếp tục khảo sát điều kiện để tách Chế phẩm Hạn dùng Nguyên liệu 464/15, D amlodipin 03/2016 lô ALK5AQA23B Nguyên liệu 776/14, 02/2016 lô ALK5APA28B 0,062% hoàn toàn captopril, captopril disulfid tạp khác (nếu có) Thẩm định quy trình: tính đặc hiệu, tính tuyến tính (R2 > 0,998); độ xác (RSD ≤ 2%) độ (tỷ lệ phục hồi 98 % - 102 %) 0,047% 2.6 Ứng dụng: Đánh giá tạp số nguyên liệu chế phẩm tương ứng Viên nén amlodipin mg (A) 05/2016 0,154% Viên nang amlodipin mg (B) 01/2017 0,082% Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 TỔNG HỢP VÀ TINH CHẾ TẠP CHẤT Bảng 3.10 Kết kiểm tra tạp A tạp B nifedipin số 3.1.1 Tổng hợp tinh chế captopril disulfid nguyên liệu chế phẩm nifedipin thị trường (n = 6) Quy trình tổng hợp captopril disulfid: hòa tan g (0,023 mol) captopril Chế phẩm vào 100 ml nước cất, siêu âm phút 30 oC Thêm 10 ml H2O2 30%, Hạn dùng % tạp A % tạp B 010817 0,0043 0,102 171017 0,0039 0,152 Siêu âm 10 phút 30 oC, lọc lấy tủa sấy nhiệt độ 55 oC 12 NL Nifedipin (lô 205) 052018 0,0041 0,077 Dự kiến kết tủa captopril disulfid NL Nifedipin (lơ 249) 092018 0,0036 0,074 Tối ưu hóa quy trình tổng hợp captopril disulfid: mơ hình Box- Viên nén Nifedipin 10 mg (lô 030815 - C) Viên nén Nifedipin 10 mg (lô 030815 - D) khuấy đều, điều chỉnh pH dung dịch phản ứng HCl đến pH 2,2 Để yên hỗn hợp tránh ánh sáng 12 nhiệt độ phòng Lọc sản phẩm sau phản ứng, thu kết tủa phân tán tủa vào 100 ml nước Behnken, hiệu suất phản ứng tổng hợp 63,0% CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP CÁC TẠP CHẤT 4.1.1 Tổng hợp tinh chế tạp captopril disulfid Tổng hợp captopril disulfid với tác nhân H2O2 thành cơng khả oxy hóa oxy sinh từ H2O2 mạnh so với oxy không khí Do sản phẩm sinh nước nên captopril disulfid tủa dễ dàng sau tinh chế đạt độ tinh khiết cao, phù hợp với mục tiêu tạo sản phẩm làm chất đối chiếu hạn chế ô nhiễm môi trường Tinh chế captopril disulfid: sản phẩm tổng hợp tinh chế phương pháp kết tinh nóng với hỗn hợp nước–methanol, nhiệt độ tinh chế 65 oC Lọc áp suất giảm, sấy kết tinh 55 oC 12 3.1.2 Tổng hợp tinh chế 7-ADCA D-phenylglycin Quy trình tổng hợp 7-ADCA D-phenylglycin: cho 24 g cephalexin cho vào bình phản ứng, thêm 630 ml nước 24 g enzym PGA Điều chỉnh nhiệt độ phản ứng 37 oC, điều chỉnh pH dung dịch phản ứng đến pH 8,0 amoniac 5% Khi pH ổn định, ngưng phản ứng lọc 17 lấy dịch lọc, điều chỉnh dịch lọc đến pH HCl 3M, khuấy 3.5 ỨNG DỤNG KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TẠP CHẤT TRONG liên tục đến kết tủa hoàn toàn Tiếp tục lọc hỗn hợp sau phản ứng NGUYÊN LIỆU VÀ THÀNH PHẨM THUỐC TƯƠNG ỨNG Các sản phẩm tổng hợp sau đánh giá chất lượng đạt yêu cầu chất đối chiếu; quy trình định lượng đạt yêu cầu thẩm định ứng dụng kiểm tra số mẫu nguyên liệu thành phẩm tương ứng thị trường Các kết trình bày bảng từ 3.8 đến 3.11: Bảng 3.8 Kết định lượng captopril disulfid số mẫu nguyên liệu thành phẩm chứa captopril thị trường áp suất giảm, thu 11,58 g kết tủa B; phần dịch lọc tiếp tuc làm lạnh điều chỉnh đến pH 6,5; khuấy đến kết tủa hoàn toàn, lọc lấy kết tủa, thu 1,44 g chất A Phương pháp tinh chế: Phương pháp kết tinh lại: hòa tan kết tủa B HCl 0,2 M, đun nóng, thêm 1,5 g than hoạt, khuấy lọc nóng Dịch lọc điều chỉnh pH amoniac 5% Khuấy để yên đến kết tủa hồn Chế phẩm Mã hóa Hạn dùng tồn, lọc lấy tủa, thu 4,38 g sản phẩm B dạng tinh thể NL01 NL02 03/2016 09/2016 0,13% 0,13% CPNNA 05/2016 20,41% CPNNB 01/2017 8,49% CPTNC 02/2016 2,82% nhiệt độ phịng 30 phút Kiểm tra q trình phản ứng đến Nguyên liệu captopril, lô Nguyên liệu captopril, lô Viên nén captopril 25 mg (ngoại nhập, công ty A) Viên nén captopril 25 mg (ngoại nhập, công ty B) Viên nén captopril 25 mg (trong nước, công ty C) Viên nén captopril 25 mg CPTND 02/2017 0,59% khơng cịn vết ngun liệu (1) kết thúc phản ứng Hỗn hợp sau phản Viên nén captopril 25 mg CPTNE 04/2016 30,60% ứng chiết với NaHCO3 bão hòa lớp dịch nước sau Viên nén captopril 25 mg CPTNF 12/2016 3,02% Phương pháp HPLC điều chế: kết tủa A B tiếp tục tinh chế HPLC với cột C18, pha động methanol – nước (10 : 90) Lọc áp suất giảm thu 1,14 g sản phẩm A 3,504 g B tinh khiết 3.1.3 Tổng hợp tinh chế tạp D amlodipin Giai đoạn 1: tổng hợp tinh chế sản phẩm trung gian Cân 5,39 g phthaloyl amlodipin (1) cho vào bình phản ứng thêm 15 ml DCM, 1,5 g hỗn hợp SiO2 – HNO3 Khuấy hỗn hợp phản ứng Captopril disulfid chiết khơng cịn màu vàng Lớp DCM chiết tiếp với NaCl Bảng 3.9 Kết kiểm tra tạp 7-ADCA D-phenylglycin bão hòa làm khan Na2SO4 Lọc thu hồi DCM, kết tủa thu số nguyên liệu chế phẩm cephalexin thị trường (n = 6) sản phẩm trung gian Hiệu suất phản ứng đạt 85% Giai đoạn 2: tổng hợp tinh chế tạp D amlodipin Cho 5,37 g sản phẩm trung gian 10 ml toluen vào bình cầu, khuấy đến tan thêm 0,4 ml hydrazin 50%/0,7 ml methanol, tiếp tục khuấy nhiệt độ phòng Lọc lấy dịch lọc, thu hồi dung môi, thu 1,9 g kết tủa, dự kiến tạp D Chế phẩm NL cephalexin 0391, B5000405 NL cephalexin 0392, B5000631 Hạn dùng 03/2018 09/2018 Dphenylglycin không phát không phát 7-ADCA không phát không phát 16 Bảng 3.7 Kết thẩm định quy trình định lượng captopril disulfid 3.1.4 Tổng hợp tinh chế tạp A tạp B nifedipin mẫu thử nguyên liệu thành phẩm chứa captopril - Tổng hợp tạp A nifedipin phương pháp oxy hóa nifedipin với acid nitric Cho 346 mg nifedipin (1 mM) + 10 ml DCM vào bình Yêu cầu thẩm định Phương trình hồi qui Hệ số tương quan (R ) Kết Quả nón, thêm 250 mg hỗn hợp SiO2 – HNO3 khuấy 10 phút Lọc ŷ = 33441x lấy dịch lọc cho vào bình lắng gạn, thêm 10 ml nước, chiết DCM 0,9992 đến lớp nước trung tính Lớp DCM thu hồi dung môi, kết tủa 0,5 – 40 (ppm) dự kiến tạp A nifedipin, sấy nhiệt độ < 50 oC Giới hạn phát (LOD) 0,17 µg/ml Sản phẩm bảo quản lọ nâu, nhiệt độ khoảng oC Giới hạn định lượng (LOQ) 0,50 µg/ml - Tổng hợp tạp B nifedipin phương pháp chiếu tia UVA Cho Khoảng tuyến tính 2,5 g nifedipin (0,007 M) vào cốc có mỏ 50 ml methanol, khuấy từ Độ lặp lại RSD (%) (n = 6) Mẫu thử nguyên liệu 0,79 liên tục Chiếu đèn UVA, khoảng cách từ đèn tới bề mặt dung dịch Mẫu thử thành phẩm 1,47 khoảng 10 cm, tránh ánh sáng Chiếu đèn khoảng 15 giờ, lấy mẫu Mẫu thử giả lập nguyên liệu 1,07 giờ, kiểm tra phản ứng sắc ký lớp mỏng Dung dịch sau Mẫu thử giả lập thành phẩm 0,80 phản ứng loại nước Na2SO4, chuyển dung dịch thu RSD (%) vào bình cầu, rửa cốc methanol, cho nước rửa vào bình cầu Thu Mẫu thử nguyên liệu 0,81 hồi dung môi, kết tủa dự kiến tạp B nifedipin, sấy chân không Mẫu thử thành phẩm 1,97 không 50 oC Mẫu thử giả lập nguyên liệu 1,66 Tinh chế: tạp A tạp B tinh chế sắc ký cột với hệ dung Mẫu thử giả lập thành phẩm 0,56 Độ xác trung gian (n = 12) Độ (n = 9) Mẫu NL captopril + chuẩn captopril disulfid Mẫu giả dược + NL captopril + chuẩn captopril disulfid Tỷ lệ phục hồi (%) RSD môi ethyl acetat – n-hexan kết tinh lại aceton – nước Tóm tắt: hiệu suất tổng hợp (1); hiệu suất tinh chế (2) hiệu suất toàn quy trình (3) tạp chất tổng hợp 98,5 - 101,6 (RSD = 1,23%) Captopril 7- D- Tạp D Tạp A Tạp B disulfid ADCA phenylglycin amlodipin nifedipin nifedipin (1) 63,0% 82,3% 14,5% 42,0% 89,2% 95,5% (2) 57,1% 30,2% 79,2% 63,2% 34,8% 76,8% (3) 35,97% 24,85% 11,48% 26,54% 31,04% 73,34% 99,4 - 101,9 (RSD = 0,74%) 10 15 3.1.5 Xác định cấu trúc sản phẩm tổng hợp Bảng 3.1 Cấu trúc tạp tổng hợp luận án Cấu trúc sản phẩm Danh pháp Bảng 3.6 Kết đánh giá tạp D amlodipin Chỉ tiêu Phương pháp Yêu cầu Tính chất Cảm quan Dung dịch màu vàng nâu Acid (2S,2'S)-1,1'-disulphanediylbis[2 methyl-1-oxopropan-3,1-diyl]bis[pyrrolidine-2-carboxylic] - Phổ IR Định tính Acid (2R)-2-amino-2phenylacetic 3-ethyl 5-methyl 2-[(2aminoethoxy)methyl]-4-(2chlorophenyl)-6-methylpyridin3,5-dicarboxylat (C=O); 3523 (N-H) MS-ESI(+): m/z 407,1328 [M+H]+ - Phổ NMR H-NMR, δ (500 MHz, CDCl3, ppm): 7,41; 7,31; 7,27; 7,17; 4,80; 3,99; 3,52; 3,48; 2,84; 2,64; 0,92 Độ tinh khiết Acid (6R,7R)-7-amino-3-methyl8-oxo-5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] oct-2-ene-2-carboxylic (acid 7aminodesacetoxycephalosporanic) - Phổ khối IR (KBr/cm-1): 1238 (C-O); 1733 Sắc ký lỏng ≥ 99,0% (nguyên trạng) 3.4 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TẠP CAPTOPRIL DISULFID TRONG MẪU THỬ NGUYÊN LIỆU VÀ THÀNH PHẨM CHỨA CAPTOPRIL Các điều kiện sắc ký: Nồng độ mẫu thử: 1000 µg/ml Cột C18 (150 x 4,6 mm; µm) Pha động: acetonitril – acid phosphoric pH (30 : 70) Bước sóng phát hiện: 220 nm Dimethyl-2,6-dimethyl-4-(2nitrophenyl)-pyridin-3,5dicarboxylat Nhiệt độ cột 50 oC Tốc độ dòng ml/phút Thể tích tiêm 10 µl Quy trình định lượng captopril disulfid nguyên liệu thành Dimethyl-2,6-dimethyl-4-(2nitrosophenyl)-pyridin-3,5dicarboxylat phẩm captopril đạt yêu cầu thẩm định tiêu tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu Kết xác định miền giá trị, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ đúng, độ xác trình bày bảng 3.7 14 11 3.2 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH Bảng 3.5 Kết đánh giá tạp A B nifedipin Chỉ tiêu/ phương pháp Tạp A KHIẾT TẠP TỔNG HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Tạp B Tinh thể trắng ngà Dễ Tinh thể xanh nhạt Dễ tan methanol, tan methanol, ethanol, aceton ethanol, aceton Tính chất (Cảm quan) Điểm chảy (DSC) 105 oC 93,5 oC Hàm ẩm (TGA)  0,1%  0,1% Định tính Độ tinh khiết (Sắc ký lỏng) Phổ IR (KBr/cm-1): Phổ IR (KBr/cm-1): 1728; 1524; 1378 3084; 3001–2852; 1111 1729; 1492; 1374 1110 Phổ MS: ESI-MS(+) Phổ MS: ESI-MS(+) m/z + m/z 367,0908 [M+Na] 351,0956 [M+Na]+ Phổ NMR: Phổ NMR: 1 H-NMR, δ (500 MHz, H-NMR, δ (500 MHz, DMSO-d6, ppm): 8,26; 7,81; DMSO-d6, ppm): 7,72; 7,73; 7,29; 3,44; 2,55 7,52; 7,44; 6,55; 3,39; 13 C-NMR, δ (125 MHz, 2,67 DMSO -d6, ppm): 166,54; 13C-NMR, δ (125 MHz, 156,05; 156,05; 146,81; DMSO-d6, ppm): 167,71 144,67; 133,80; 130,81; (C=O ester); 161,64; 130,60; 130,35; 124,46; 161,64; 156,46; 144,40; 124,35; 124,35; 52,23; 23,09 139,95; 135,01; 130,68; 128,86; 127,27; 107,86; 107,86; 52,03; 23,52 ≥ 99,0% (nguyên trạng) ≥ 99,0% (nguyên trạng) Đã xây dựng thẩm định đạt yêu cầu quy trình xác định độ tinh khiết tạp tổng hợp được, bao gồm: captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Riêng mẫu thử tạp A B nifedipin sử dụng nồng độ 250 µg/ml; mẫu thử cịn lại quy trình 1000 µg/ml 3.2.1 Quy trình đánh giá captopril disulfid: cột Gemini NX C18 (150 x 4,6 mm; µm), pha động hỗn hợp acetonitril – acid phosphoric pH (30 : 70), bước sóng phát 220 nm, nhiệt độ cột 50 oC, tốc độ dịng ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl 3.2.2 Quy trình đánh giá D-phenylglycin: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm; µm), pha động hỗn hợp đệm phosphat pH – methanol, rửa giải gradient, bước sóng phát 220 nm, nhiệt độ cột 30 oC, tốc độ dịng ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl 3.2.3 Quy trình đánh giá 7-ADCA: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm; µm), pha động hỗn hợp đệm phosphat pH – methanol, kỹ thuật rửa giải gradient, bước sóng phát 220 nm, nhiệt độ cột 30 oC, tốc độ dòng ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl 3.2.4 Quy trình đánh giá tạp D amlodipin: cột C18 (250 x 4,6 mm; µm), pha động acetonitril – dung dịch acid pH (7,0 ml TEA/1000 ml nước điều chỉnh pH đến 3,0 acid phosphoric) (15 : 35 : 50), bước sóng phát 237 nm, nhiệt độ cột 35 oC, tốc độ dịng ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl 3.2.5 Quy trình đánh giá A B nifedipin: cột Phenomenex Gemini NX (150 x 4,6 mm; µm), pha động hỗn hợp nước – acetonitril (50 : 50), bước sóng phát 254 nm, nhiệt độ cột 30 oC, tốc độ dòng 0,8 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 µl 12 13 3.3 ĐÁNH GIÁ VÀ THIẾT LẬP TẠP CHẤT ĐỐI CHIẾU 3.3.1 Kết thiết lập chất đối chiếu Bảng 3.4 Kết đánh giá D-phenylglycin 7-ADCA Chỉ Bảng 3.2 Kết xác định giá trị ấn định µx giá trị công bố (% phương tinh khiết) tạp đối chiếu tổng hợp pháp STT Tên chất đối chiếu Catopril disulfid 7-ADCA D-phenylglycin Tạp D amlodipin Tạp A nifedipin Tạp B nifedipin KL(mg) 20 20 10 20 20 20 µx 0,0052 0,0187 0,0068 0,0018 0,0970 0,0650 % tinh khiết 99,45 99,90 99,94 99,92 99,56 99,71 3.3.2 Bộ liệu - Kết đánh giá tạp tổng hợp Các tiêu, phương pháp thử kết đánh giá tạp tổng hợp trình bày bảng 3.3 đến 3.6 sau: Bảng 3.3 Kết đánh giá tạp captopril disulfid Chỉ tiêu Phương pháp Yêu cầu Tinh thể trắng, dễ tan Tính chất Cảm quan pyridin, tan ethanol, tan methanol Điểm chảy DĐVN V 235 – 236 oC Hàm ẩm TGA ≤ 0,5% IR (KBr/cm-1): 1747 (HO-C=O), Phổ hồng ngoại 1601(-N-C=O) 490 (-S-S-) Phổ khối ESI-MS(-): m/z 431,1319 [M-H]1 H-NMR, δ (500 MHz, DMSO-d6, Định tính ppm): 4,22; 3,58; 2,60 – 2,70; 2,87–3,00; 1,81–2,18; 1,92; 1,09 Phổ NMR 13 C-NMR, δ (125 MHz, DMSOd6, ppm): 173,3; 58,3; 46,5; 41,2; 36,9; 28,6; 24,3; 16,5 ≥ 99,0% (nguyên trạng) Độ tinh khiết Sắc ký lỏng tiêu/ Tính chất Điểm chảy (DSC) D-phenylglycin 7-ADCA Bột kết tinh trắng Bột kết tinh trắng ngà 242 ± oC 306 ± oC Phổ IR (KBr/cm-1): 2933 Phổ IR (KBr/cm-1): 3151 (N-H); 2617 (C-H), 1612 (N-H); (C-N) 1508 (C=C) 1800 (C=O); 1618 (C- 2933 (C-H); N) 1539 cm-1 (C=C) Định tính Phổ MS: m/z 152,0707 + Phổ MS: m/z 237,03 [M+Na]+ [M+H] Phổ NMR: Phổ NMR: 1 D2O, ppm): 7,48; 7,47; DMSO-d6, ppm): 4,91; H-NMR, δ (500 MHz, H-NMR, δ (500 MHz, 7,47; 7,44; 7,44; 5,02 4,70; 3,55; 3,29; 1,98 13 13 D2O, ppm): 171,6; 132,4; DMSO-d6, ppm): 169,5; 130,1; 163,8; C-NMR, δ (125 MHz, 129,6; 129,6; 128,0; 128,0; 57,2 C-NMR, δ (125 MHz, 127,9; 122,8; 63,3; 58,5; 28,4; 19,4 Năng suất quay cực riêng: [a] = -156 o (C = 2, HCl N) Độ tinh khiết (Sắc ký lỏng) ≥ 99,0% (nguyên trạng) ≥ 99,0% (ngun trạng) DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Tran Van Muoi, Tran Linh Phuong, Ha Dieu Ly, Nguyen Duc Tuan, Dang Van Tinh (2013), "Synthesis of 3-ethyl 5-methyl 2-[(2-aminoethoxy)methyl]-4-(2chlorophenyl)-6-methylpyridine-3,5-dicarboxylat as amlodipin impurity D", The Eighth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, Ho Chi Minh City, Vietnam, 4-5, 531-534 Trần Văn Mười, Mai Kim Cường, Nguyễn Đức Tuấn, Đặng Văn Tịnh (2015), "Tổng hợp xác định độ tinh khiết quang hoạt D-α-phenylglycin", Tạp chí Y học TP.HCM, tập 19, phụ số 3, 459-465 Lữ Thiện Phúc, Trần Văn Mười, Nguyễn Tấn Đạt, Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Đặng Văn Tịnh, Nguyễn Đức Tuấn (2015), "Thiết lập chất đối chiếu captopril disulfid xây dựng quy trình HPLC định lượng tạp chất captopril disulfid nguyên liệu chế phẩm captopril", Tạp chí Dược học, số 466, 18-23 Trần Văn Mười, Nguyễn Xuân Thanh, Văn Kim Thành, Nguyễn Đức Tuấn (2016), "Tổng hợp xác định độ tinh khiết dehydronifedipin (tạp A) dehydroso nifedipin (tạp B) nifedipin", Tạp chí Y học Tp.HCM, phụ tập 20, số 2, 170-176 Trần Văn Mười, Nguyễn Xuân Thanh, Văn Kim Thành, Nguyễn Đức Tuấn (2016), "Thiết lập chất đối chiếu dehydronifedipin (tạp A) dehydroso nifedipin (tạp B) ứng dụng qui trình HPLC kiểm tra tạp A tạp B chế phẩm nifedipin", Tạp chí Dược học, số 4, 56-60  ... 7- ADCA, D- phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin phương pháp HPLC Về thiết lập chất đối chiếu tạp tổng hợp: Đã đánh giá tạp 7- ADCA, D- phenylglycin, captopril disulfid, tạp D amlodipin,. .. nhiên, nguồn cung cấp tạp chất đối chiếu khan Đề tài ? ?Tổng hợp thiết lập tạp chuẩn captopril disulfid, 7- ADCA, D- phenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A B nifedipin d? ?ng kiểm nghiệm thuốc? ?? thực với mục... khiết tạp tổng hợp phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Thiết lập tạp chuẩn captopril disulfid, 7- ADCA, Dphenylglycin, tạp D amlodipin, tạp A tạp B nifedipin đạt yêu cầu chất đối chiếu quốc gia Xây d? ??ng